Avaliação Dos Efeitos Da Angiotensina-(1

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS Carlos Henrique de Castro Belo Horizonte Agosto – 2008 Livros Grátis http://www.livrosgratis.com.br Milhares de livros grátis para download. 3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA ANGIOTENSINA-(1-7) E DO SEU RECEPTOR MAS NO CONTROLE DA FUNÇÃO CARDÍACA UTILIZANDO ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências, área de concentração Fisiologia Orientador: Prof. Dr. Robson Augusto Souza dos Santos Co-Orientador: Prof. Dr. Alvair Pinto de Almeida Belo Horizonte Agosto – 2008 4 DEDICATÓRIAS À Deus, Por estar sempre ao meu lado, abençoando e iluminando minhas decisões. À minha esposa Elisandra, Me acompanhou e me apoiou incondicionalmente desde o início desta jornada. Amor, compreensão e cumplicidade foram fundamentais para chegarmos juntos até aqui. Aos meus pais e minha irmã, Com dignidade, humildade e respeito me ensinaram o caminho do crescimento intelectual e professional. Ao meu sogro e à minha sogra, Luiz e Fátima, Pelos preciosos conselhos, pessoais e profissionais. 5 AGRADECIMENTOS Ao meu orientador, professor Dr. Robson Augusto Souza dos Santos, os mais sinceros agradecimentos. Sua confiança e orientação foi capaz de me trilhar para um imenso crescimento professional. Ao meu co-orientador, professor Dr. Alvair Pinto de Almeida, foi um grande responsável por esta conquista. Um grande incentivador e conselheiro. Ao Departamento de Fisiologia e Biofísica, ICB-UFMG, por ter possibilitado a realização deste trabalho. Ao professor Dr. Anderson José Ferreira, pelos conselhos e colaborações que foram importantes para a realização deste trabalho. Agradeço também pela grande amizade. Aos técnicos Elizabeth Dias Bomtempo e José Roberto, pelo empenho, disposição e amizade. Aos professores e colegas dos laboratórios de Hipertensão e de Fisiologia Cardiovascular do Departamento de Fisiologia, ICB, UFMG. Aos professores e colegas dos laboratórios de Biologia do Desenvolvimento e de Matriz Extracelular e Desenvolvimento do Coração do Departamento de Morfologia, ICB, UFMG. 6 RESUMO INTRODUÇÃO: O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um sistema essencial para a regulação das funções cardiovasculares, além de estar envolvido na patogênese de várias doenças cardiovasculares. Um importante avanço na compreensão do SRA foi o reconhecimento da Ang-(1-7) como um peptídeo biologicamente ativo. A identificação da proteína Mas como receptor da Ang-(1-7) forneceu uma base molecular importante para a significância biológica deste peptídeo. OBJETIVOS: O objetivo deste trabalho foi investigar o papel da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas na função e remodelamento cardíaco e na resistência vascular coronariana. MATERIAIS E MÉTODOS: Para avaliar diretamente o papel do receptor Mas e o efeito do Ang-(1-7) especificamente no coração, nós utilizamos camundongos com deleção genética para o receptor Mas (KO-Mas) e ratos transgênicos [TG(hA1-7)L7301] (TG) que superexpressam uma proteína de fusão produtora de Ang-(1-7) especificamente no coração. A função cardíaca foi avaliada usando a preparação de coração isolado. Os corações dos camundongos KO-Mas e de seus controles selvagens [Wild Type (WT)], foram submetidos a 20 minutos de isquemia global após 30 minutos de estabilização. O fluxo foi reiniciado e os corações foram reperfundidos por 30 minutos. Em um grupo adicional de camundongos WT, o antagonista do receptor Mas, A-779, foi acrescentado na solução de perfusão. Além disso, foi avaliada a participação do receptor Mas no efeito vasodilatador coronariando da acetilcolina. Após um período de 30 min de estabilização, os corações foram submetidos à estimulação elétrica (450 bpm) e perfundidos por 20 min com acetilcolina (10-7 M). Nos corações dos ratos TG e SD, após um período basal de 20 min, a artéria coronária descendente esquerda foi ocluída por 15 minutos induzindo uma isquemia regional. A ligadura foi liberada e os corações foram reperfundidos por mais 30 minutos. Os níveis de Ang-(1-7) no plasma e coração dos ratos TG e SD foram determinados por Radioimunoensaio. Hipertrofia e fibrose cardíaca foram induzidas pelo tratamento com isoproterenol (3 mg/kg i.p. por 7 dias nos ratos e 20 mg/kg s.c. por 5 dias nos camundongos). A quantificação dos colágenos I e III e fibronectina foi realizada utilizando a técnica de imunofluorescência e microscopia confocal. Cortes dos ventrículos esquerdos foram corados com hematoxilina e eosina para análise morfométrica. RESULTADOS: Os corações isolados dos camundongos KO-Mas e WT perfundidos com A-779 apresentaram menor tensão sistólica, +dT/dt, - dT/dt e frequência cardíaca. Durante a isquemia, os corações WT apresentaram diminuição na tensão sistólica e aumento da tensão diastólica. Na reperfusão foi observado um aumento na tensão sistólica e diastólica nos corações WT. A deleção genética ou o bloqueio do receptor Mas atenuou estas alterações. Os corações TG apresentaram níveis aumentados de Ang-(1-7) no coração sem diferenças significativas no plasma. Em condições basais, a tensão sistólica, +dT/dt e -dT/dt foram maiores nos corações dos ratos TG. Já a frequência cardíaca foi menor nestes animais. Além disso, os corações isolados dos ratos TG mostraram menor incidência e duração das arritmias de reperfusão comparado com SD. O aumento na área de secção transversa dos cardiomiócitos 7 induzido pelo isoproterenol foi significativamente maior nos corações dos camundongos KO-Mas. Além disso, a deposição de colágeno III induzida por este mesmo tratamento também foi maior nos corações KO-Mas. O efeito hipertrófico induzido pelo isoproterenol não foi bloqueado pela superexpressão da Ang-(1-7) nos ratos TG. Entretanto, os corações destes animais apresentaram menor deposição de colágeno III e fibronectina. A pressão de perfusão foi maior nos corações dos camundongos KO-Mas e WT perfundidos com A-779. Surpreendentemente, o efeito da acetilcolina na resistência coronariana foi completamente ausente nos corações KO-Mas. A vasodilatação coronariana induzida pela acetilcolina não foi alterada nos animais KO-AT1, mas foi maior nos corações KO-AT2. O fluxo coronariano foi menor nos ratos TG, mas aumentou significativamente durante a reperfusão quando comparado aos ratos SD. CONCLUSÃO: Estes resultados indicam que o eixo Ang-(1-7)-Mas exerce um papel essencial na função cardíaca durante a isquemia/reperfusão e na modulação da função endotelial dos vasos coronarianos. Além disso, este estudo mostra uma participação cardioprotetora da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no remodelamento cardíaco. 8 ABSTRACT BACKGROUND: The renin–angiotensin system (RAS), an important regulator of cardiovascular functions, plays a major role in the pathogenesis of cardiovascular diseases. One important advance in the understanding of the RAS was the recognition that Angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] is a biologically-active product of the RAS. The recent identification of the G-protein-coupled receptor Mas as an Ang(1-7) receptor has provided evidence for its biological significance. AIM: The aim of this study was to investigate the role of Ang-(1-7) and its receptor Mas on cardiac function, remodeling and coronary vascular resistance. MATERIALS AND METHODS: To directly investigate the role of receptor Mas and the effects of Ang-(1-7) specifically in the heart we used Mas knockout mice and transgenic rats [TG(hA1-7)L7301] (TG) which express an Ang-(1-7)-producing fusion protein in the heart. Cardiac function was examined using isolated heart preparations. Hearts from Wild Type (WT) and Mas knockout mice (KO-Mas) were subjected to 20 min of global ischemia after 30 min of stabilization. The flow was restarted and the hearts were reperfused for 30 min. An additional group of WT mice was perfused with Ang-(1-7) receptor Mas antagonist A-779. In addition, we evaluate the influence of receptor Mas on the effect of acetylcholine in the coronary resistance. Following a stabilization period of 30 min, hearts were subjected to pacing (450 bpm) and perfused for 20 minutes with acetylcholine (10-7 M). In hearts from SD and transgenic rats, after a basal period of 20 min, local ischemia was induced by left anterior descending coronary artery occlusion for 15 minutes. The ligature was released and reperfusion was performed for an additional 30 minutes. Ang-(1-7) level was determined by radioimmunoassay (RIA) in plasma and heart from transgenic and SD rats. Heart hypertrophy and fibrosis were induced by isoproterenol (3 mg/kg i.p./day for 7 days in rats and 20 mg/kg s.c./day for 5 days in mice). Quantification of collagen types I and III, plus fibronectin was performed using immunofluorescence-labeling techniques and confocal microscopy. Tissue sections from left ventricle were stained with hematoxylin–eosin for cell morphometry. RESULTS: Isolated hearts of KO-Mas and WT treated with A-779 presented a decreased systolic tension, +dT/dt, -dT/dt, and heart rate. Upon global ischemia WT hearts showed a significant decrease in systolic tension and an increase in diastolic tension. During reperfusion an increase in systolic and diastolic tension was observed in WT mice. Deletion or blockade of Mas markedly attenuated these changes in isolated hearts. Heterozygous TG presented a significant increase in cardiac Ang-(1-7) concentration compared with control rats without any significant change in plasma Ang-(1-7) levels. At basal conditions, hearts from TG rats showed a higher systolic tension, + dT/dt, and - dT/dt and a lower heart rate. In addition, isolated hearts from TG rats showed reduced incidence and duration of reperfusion arrhythmias in comparison with SD rats. Cardiomyocyte crosssectional area was significantly higher in isoproterenol-treated KO-Mas mice when compared with isoproterenol-treated WT mice. Moreover, KO-Mas mice presented a significant increase of isoproterenol-induced collagen type III deposition. The hypertrophic effect induced by isoproterenol treatment was not blocked by the overexpression of Ang-(1-7) in the heart transgenic rats. However hearts from TG rats showed a less pronounced deposition of collagen type III and fibronectin 9 induced by isoproterenol treatment than in corresponding controls. Isolated hearts from Mas-KO and WT treated with A-779 presented an increase in the perfusion pressure in the baseline period. Strikingly, the effect of acetylcholine on coronary resistance was blunted in KO-Mas. However, acetylcholine-induced coronary vasodilation was actually increased in KO-AT2 when compared with WT mice. Acetylcholine induced a similar coronary vasodilation in KO-AT1 and its control mice hearts. The coronary flow was decreased in TG rats at basal conditions. However, it significantly increased during the reperfusion after ischemia when compared with normal rats. CONCLUSION: These results indicate that Ang-(1-7)-Mas axis plays a key role in the cardiac function during ischemia/reperfusion and in the modulation of endothelial function of coronary vessels. Moreover, this study shows a marked cardioprotective role of Ang-(1-7) and its receptor Mas in cardiac remodeling. 10 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de formação de angiotensinas e seus recepores. AP, Aminopeptidases; ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolil-endopeptidase, AT, Receptor de Angiotensina. Figura 2. Vias contra-regulatórias do Sistema renina-angiotensina. ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; AT, Receptor de Angiotensina. Figura 3. Diagrama esquematizando os protocolos experimentais. Figura 4. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na tensão sistólica (A) e diastólica (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # WT vs WT perfundidos com KR contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 5. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na +dT/dt (A) e -dT/dt (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 6. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na freqüência cardíaca de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 7. Avaliação dos níveis de Ang-(1-7) nos corações (A) e plasma (B) de ratos SD e TG. *p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 8. Avaliação da tensão sistólica (A) e diastólica (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 9. Avaliação da +dT/dt (A) e –dT/dt (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O 11 valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. *p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste tstudent). Figura 10. Avaliação da freqüência cardíaca (A) e do trabalho cardíaco (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 11. Avaliação do índice de severidade de arritmias (ISA) (A) e incidências das arritmias de reperfusão irreversíveis (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 submetidos a oclusão da coronária descendente esquerda. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. * p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). Figura 12. Efeito da deleção genética do receptor Mas na resposta hipertrófica induzida por isoproterenol. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls). Figura 13. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação do colágeno III nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 14. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação do colágeno I nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 15. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 16. Avaliação da resposta hipertrófica em ratos TG(hA1-7)L7301 induzida por isoproterenol. *p<0,01. Os valores estão expressos como média ± EPM (Oneway Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls). 12 Figura 17. (A) Imunolocalização de colágeno III em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação de colágeno III nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 18. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 19. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de colágeno I nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. Figura 20. (A) Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na pressão de perfusão coronariana de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. (B) Curva da pressão de perfusão no período da reperfusão utilizada para análise do t1/2. As linhas pontilhadas representam os valores do t1/2 dos animais indicados. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 21. Avaliação do efeito vasodilatador da acetilcolina 10-7 mol/L em corações isolados de camundongos KO-Mas (A), KO-AT2 (B) e KO-AT1 (C). Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05 comparado ao grupo controle. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). Figura 22. Avaliação do fluxo coronariano em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 em condições basais (A) e durante isquemia/reperfusão (B). Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição da solução de Krebs-Ringer. Tabela 2. Índice de Severidade de Arritmias. Tabela 3. Coquetel de Inibidores de Proteases. Tabela 4. Soluções e volumes utilizados para RIE de Ang-(1-7). Tabela 5. Curva padrão para dosagem de proteína. Tabela 6. Descrição dos procedimentos realizados para o processo de inclusão dos tecidos. Tabela 7. Especificação dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência indireta. Tabela 8. Descrição dos procedimentos para a realização da técnica de imunofluorescência. Tabela 9. Descrição dos procedimentos para a realização da coloração dos cortes histológicos com hematoxilina e eosina. 14 LISTA DE ABREVIATURAS A-779, antagonista do receptor Mas ACN, acetonitrila Ang I, Angiotensina I Ang II, Angiotensina II Ang IV, Angiotensina IV Ang-(1-7), Angiotensina-(1-7) AP, Aminopeptidases; AT1, subtipo 1 do receptor de angiotensina II AT2, subtipo 2 do receptor de angiotensina II BSA, albumina de soro bovino DMSO, dimetilsulfóxido ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; EPM, erro pardrão da média HFBA, ácido heptafluorobutírico KO-AT1, camundongos com deleção genética do receptor AT1 KO-AT2, camundongos com deleção genética do receptor AT2 KO-Mas, camundongos com deleção genética do receptor Mas MEC, matriz extracelular NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PD 123319, antagonista do receptor AT2 PEP, Prolil-endopeptidase, 15 SD, Sprague Dawley SRA, Sistema renina-angiotensina TFA, ácido trifluoracético TG, rato transgênico WT, Wild Type, camundongos controles 16 SUMÁRIO RESUMO ................................................................................................................... IV ABSTRACT ............................................................................................................... VI LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. VIII LISTA DE TABELAS ................................................................................................. XI LISTA DE ABREVEATURAS .................................................................................... XII SUMÁRIO................................................................................................................... XIV 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 18 1.1. Sistema renina-angiotensina ........................................................................... 18 1.2. Receptores do sistema renina-angiotensina ................................................... 29 1.3. SRA e a estrutura cardíaca ............................................................................. 32 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 37 2.1. Objetivo geral .................................................................................................. 37 2.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 37 3. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 38 3.1. Animais ............................................................................................................ 38 3.2. Preparação dos corações isolados ............................................................................... 38 3.2.1. Protocolos ............................................................................................... 40 A. Isquemia/Reperfusão .............................................................................................. 40 B. Avaliação do efeito vasodilatador da Acetilcolina ................................... 41 3.3. Radioimunoensaio .............................................................................................. 43 3.3.1. Coleta do Coração e Plasma dos Ratos Transgênicos TG(hA1-7)L7301 e SD............................................................................................................ 43 17 3.3.2. Homogeneização de tecidos, extração das amostras e dosagens dos peptídeos ....................................................................................................... 44 A. Homogeneização do ventrículo esquerdo .................................................... 44 B. Extração da Ang-(1-7) do plasma e ventrículo esquerdo em colunas Bond Elut - C18 ........................................................................................................... 44 C. Radioimunoensaio para Angiotensina-(1-7) ................................................. 45 3.3.3. Dosagem de Proteínas ................................................................................ 47 3.4. Tratamento com isoproterenol ......................................................................... 48 3.5. Processamento do material para análises de morfometria e imunofluorescência ......................................................................................... 48 3.6. Análise dos colágenos I e III e fibronectina por Imunofluorescência ............... 49 3.6.1. Análise quantitativa de colágenos I e III e fibronectina .............................. 52 3.7. Análise Morfométrica .......................................................................................... 52 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................... 54 5. RESULTADOS ........................................................................................................... 55 5.1. Efeito da deleção genética do receptor Mas na Contratilidade Cardíaca ....... 55 5.2. Avaliação da função cardíaca em ratos transgêncios TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração .......................................... 60 5.3. Avaliação da incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos que superexpressam Ang-(1-7) no coração ......................................... 66 5.4. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais com deleção genética do receptor Mas ............................................ 67 5.5. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração ........................................................................................................... 72 18 5.6. Avaliação da participação do receptor Mas e da Angiotensina-(1-7) nos vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas ......................... 77 6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 83 7. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 98 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 99 19 1. INTRODUÇÃO 1.1. Sistema renina-angiotensina O Sistema Renina-angiotensina (SRA) é um importante sistema envolovido na regulação de diferentes funções, especialmente a regulação central e periférica da pressão arterial e do equilíbrio hidro-eletrolítico, além de estar envolvido na patogênese de várias doenças cardiovasculares (Morishita et al., 2000; Oudit et al., 2003). Após as primeiras descobertas sobre o SRA, há mais de um século, muito se avançou na compreensão de sua fisiologia e fisiopatologia. Os primeiros estudos relacionados ao SRA foram realizados por Tiegerstedt e Bergman em 1898, os quais observaram que extratos de rim não purificados causavam um aumento prolongado na pressão arterial de animais anestesiados (Tiegerstedt and Bergman, 1898; Inagami, 1998). Eles chamaram a substância responsável pelo aumento da pressão arterial de renina. Já em 1940, BraunMendes e colaboradores e Page & Helmer, relataram que o peptídeo pressórico não era a renina, e sim um produto da ação enzimática dessa substância sobre uma proteína plasmática (Braun-Menendez et al., 1940; Page and Helmer, 1940). Este produto foi posteriormente denominado angiotensina, resultado da agregação entre os termos “hipertensina”, originado na Argentina e “angiotonina”, nos Estados Unidos (Braun-Menendez and Page, 1958). Aproximadamente dez anos após os trabalhos desses dois grupos de pesquisadores foram identificadas duas formas de angiotensina, a angiotensina I (Ang I) e a angiotensina II (Ang II), sendo que a segunda é o resultado da quebra enzimática da primeira. Skeggs e colaboradores (1956) elucidaram a cascata de formação da angiotensina II, 20 demonstrando tratar-se de um octapeptídeo formado pela enzima conversora de angiotensina (ECA) (Skeggs et al., 1956). A importância da Ang II e todo o SRA no controle da homeostasia cardiovascular se tornou ainda mais relevante quando o grupo de pesquisadores formado por Inagami, Goodfriend e colaboradores descreveram os receptores da Ang II (apud Inagami, 1998). Desde então inúmeros estudos utilizando uma série de novos recursos experimentais permitiram a ampliação dos conhecimentos sobre esse complexo sistema. O SRA continua a ser amplamente estudado. Nas últimas décadas foram identificados novos componentes do sistema incluindo o receptor para Ang-(1-7) (Mas) (Santos et al., 2003), o receptor para pró-renina (Nguyen, 2007) e a Enzima Conversora de Angiotensina 2 (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000). Basicamente, a formação dos peptídeos angiotensinérgicos ocorre por meio de um processo de proteólise limitada, iniciada pela hidrólise do angiotensinogênio pela aspartil-protease renina. Tanto o decapeptídeo Ang I quanto o octapeptídeo Ang II, podem sofrer processo de biotransformação dando origem a outros peptídeos bioativos menores, como por exemplo, a Ang III, Ang IV e importantemente a Ang-(1-7), a qual será foco deste estudo. Além da enzima conversora de angiotensina, outras enzimas são capazes formar Ang II, tanto a partir da Ang I como diretamente do angiotensinogênio (Santos et al., 2000). No entanto, a real importância dessas diferentes vias para a formação da Ang II ainda não está totalmente estabelecida. A clivagem da Ang I e Ang II em outras angiotensinas depende de vias enzimáticas diversas, entre elas, a endopeptidase neutra, prolil-endopeptidase, prolil-carboxipeptidase e finalmente a ECA2 (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), sendo esta última amplamente estudada a partir dos anos 2000. 21 Outro grande passo para os estudos do SRA ocorreu com o desenvolvimento de novas técnicas de biologia molecular e bioquímica, onde diversos componentes do SRA foram identificados em diferentes tecidos. Isto levou à confirmação da existência do SRA tecidual, exercendo importantes funções regulatórias parácrinas e/ou autócrinas. Sendo assim, o SRA não é mais visto somente como um sistema endócrino, mas também como um modulador de funções teciduais (Dzau, 1988; Lindpaintner et al., 1990; Dzau, 1993; Ruzicka and Leenen, 1997; Wollert and Drexler, 1999). O angiotensinogênio é o único precursor conhecido da angiotensina e é codificado por um único gene. Esta α2-globulina é secretada constitutivamente pelo fígado, embora possa ser também secretada em baixas concentrações por outros tecidos (Atlas, 1998). Algumas enzimas clivam o angiotensinogênio para gerar diretamente a Ang I, mas a principal enzima responsável por esta clivagem é a renina (Campbell, 2003). Renina é uma aspartil protease, inicialmente sintetizada como pró-renina. A renina ativa, uma glicoproteína de 340 aminoácidos, é secretada principalmente por células mieloepitelióides da arteríola glomerular aferente, sendo responsável pela quebra do angiotensinogênio formando a Ang I. Tanto a pró-renina quanto o angiotensinogênio são expressos em vários tecidos, mas a queda nos níveis de renina ativa observada após nefrectomia, mostra que o rim é um dos principais sítios de conversão de prórenina em renina ativa (Atlas, 1998; Campbell, 2003). A ECA, uma dipeptidil carboxipeptidase, cliva a ligação Phe8 –His9 da Ang II para formar Ang I (Peach, 1977). Duas formas distintas da ECA são encontradas em humanos: a forma somática, que é encontrada em vários tecidos e uma isoenzima menor, a forma germinal, encontrada exclusivamente em testículos, a qual apresenta um 22 importante papel na fertilidade. Ambas as formas existem nas superfícies celulares como ectoenzimas, hidrolisando alguns peptídeos circulantes. A forma somática é particularmente abundante na superfície endotelial dos pulmões, rins, intestino, placenta e plexo coróide. Além de atuar sobre a Ang I para formar a Ang II, ela participa também da degradação de outros peptídeos, como a bradicinina (Turner and Hooper, 2002). Uma outra importante enzima, a ECA 2, recentemente caracterizada em humanos e roedores (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000), é uma enzima importante na regulação da função cardíaca e também está implicada em doenças cardiovasculares e renais (Crackower et al., 2002; Burrell et al., 2004; Danilczyk and Penninger, 2006). Esta enzima é composta de 805 aminoácidos que tem 42 % de homologia com o domínio catalítico N-terminal da ECA e uma região hidrofóbica próxima ao C-terminal. Diferentemente da ECA, ECA2 tem somente um sítio enzimático ativo e funciona mais como carboxipeptidase que dipeptidil carboxipeptidase. Assim, ela remove um único resíduo (Leu) da Ang I para gerar Ang-(1-9), um peptídeo com funções ainda desconhecidas. Embora a ECA2 tenha sido originariamente descrita por sua capacidade de gerar Ang-(1-9) a partir da Ang I (Donoghue et al., 2000), esta enzima também degrada Ang II formando Ang-(1-7), atualmente considerado seu principal papel, pois sua afinidade catalítica para a Ang II é 400 vezes maior que para Ang I (Vickers et al., 2002). Isto mostra seu papel fundamental na síntese de Ang-(1-7). Funcionalmente, a ECA2 é distinta da ECA por ser uma carboxipeptidase com atividade não afetada por inibidores específicos da ECA e possuir diferentes espectros de substratos, uma vez que a Ang II é um substrato da ECA2, ao contrário da bradicinina (Coates, 2003). Outras enzimas, como ilustrado na figura 23 1, também são responsáveis pela formação de Ang I, Ang II e outros peptídeos menores, como Ang-(1-7) e Ang IV. A Ang II e Ang III eram consideradas por muito tempo como os únicos fragmentos biologicamente ativos do SRA. Cadeias menores resultantes da degradação destes peptídeos eram até então considerados fragmentos inativos, uma vez que nenhuma atividade biológica era atribuída a eles. Entretanto, a descoberta da existência da Ang-(1-7) (Santos et al., 1988) e de seus efeitos cardiovasculares e cerebrais (Schiavone et al., 1988; Campagnole-Santos et al., 1989) levaram a uma nova percepção dos mecanismos pelos quais o SRA regula a homeostasia cardiovascular. A partir destes estudos, a Ang-(1-7) se tornou alvo de importantes estudos nas últimas décadas, principalmente por terem sido observados vários efeitos benéficos e opostos aos efeitos deletérios produzidos pela Ang II (Ferrario et al., 1997; Santos et al., 2000). Atualmente, várias evidências apontam para um novo conceito do SRA (Santos and Ferreira, 2007), que seria formado por duas vias enzimáticas distintas (Figura 2), uma vasoconstritora/hipertrófica/proliferativa, tendo como principal mediador a Ang II, e outra vasodilatadora/anti-hipertrófica/anti-proliferativa, mediada principalmente pela Ang-(1-7) através da ligação em seu receptor acoplado a proteína G Mas (Santos et al., 2003) e/ou a outro possível subtipo de receptor (Silva et al., 2007). Atualmente, vários estudos têm apontado o coração e os vasos sanguíneos como os principais alvos para as ações da Ang-(1-7), as quais incluem alterações bioquímicas e funcionais levando à vasodilatação e melhora da função cardíaca (Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996; Ferrario et al., 1997; Ferreira et al., 2002; Sampaio et al., 2003; Castro et al., 2005; Botelho-Santos et al., 2007). 24 Angiotensinogênio Renina Tonina Angiotensina I ECA2 ? Angiotensina-(1-9) Catepsina ECA PEP ECA NEP Quimase NEP ECA2 Angiotensina IV AP Angiotensina II Angiotensina-(1-7) PEP PCP ? AT4 AT1 AT2 Mas AT1-7 Figura 1. Ilustração do Sistema renina-angiotensina mostrando as vias de formação das angiotensinas e seus recepores. AP, Aminopeptidases; ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; NEP, Endopeptidase Neutra; PCP, Prolil-carboxipeptidase; PEP, Prolilendopeptidase, AT, Receptor de Angiotensina. 25 Angiotensina I ECA ECA2 ? Angiotensina II Angiotensina-(1-7) ECA2 AT1 Vasoconstrição Disfunção Endotelial Proliferação/hipertrofia Fibrose Aterosclerose Arritmogênese Trombose Mas Vasodilatação ñFunção endotelial òProliferação/hipertrofia òFibrose òAterosclerose Antiarritmogênese òTrombose Figura 2. Vias contra-regulatórias do Sistema renina-angiotensina. ECA, Enzima Conversora de Angiotensina; ECA2, Enzima Conversora de Angiotensina 2; AT, Receptor de Angiotensina. 26 A Ang-(1-7) produziu um significante aumento no débito cardíaco e volume sistólico em ratos anestesiados. Estes efeitos foram atenuados pelo antagonista do receptor Mas A-779 (Sampaio et al., 2003). Recentemente, foi demonstrado que a Ang-(1-7) apresenta ação anti-arritmogênica, pois este peptídeo na concentração de 0,22 nM diminuiu a incidência e a duração das arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos. Este efeito cardioprotetor foi bloqueado pelo antagonista A-779 e indometacina (Ferreira et al., 2001). Além disso, nesta mesma concentração, a Ang-(1-7) melhorou a função contrátil pósisquêmica de ratos por mecanismos envolvendo seu receptor e a liberação de prostaglandinas e bradicinina (Ferreira et al., 2002). Após indução de infarto agudo do miocárdio em ratos vivos, Loot e colaboradores (2002) mostraram que a infusão intravenosa de Ang-(1-7) atenuou a deterioração da função cardíaca com redução de 40% da pressão diastólica final do ventrículo esquerdo (Loot et al., 2002). No entanto, alguns efeitos da Ang-(1-7) são dependentes da concentração utilizada nos experimentos. Neves e colaboradores (1997) mostraram que este peptídeo, na concentração de 22 nM, promoveu uma facilitação das arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos (Neves et al., 1997). Colaborando com estes dados, camundongos transgêncos que superexpressam a ECA2 no coração apresentaram morte súbita devido a arritmias cardíacas (Donoghue et al., 2003). Estas observações sugerem que a alta concentração de Ang-(1-7) exerce efeitos deletérios no coração, possivelmente através da ativação da NADPH oxidase (Oudot et al., 2005). Recentemente, Santos e colaboradores (2004) demonstraram os efeitos benéficos da Ang-(1-7) em ratos transgênicos com níveis plasmáticos aumentados deste peptídeo (Santos et al., 2004). Medidas de radiotelemetria mostraram que estes ratos transgênicos apresentaram maior dP/dt 27 nos períodos diurno e noturno. O aumento nos níveis plasmáticos de Ang-(1-7) também atenuou a hipertrofia cardíaca induzida por isoproterenol e as arritmias de reperfusão, além de preservar a função cardíaca pós-isquêmica em corações isolados de ratos. Estes dados mostram importantes efeitos benéficos da Ang-(17) em concentrações similares às fisiológicas. A Ang-(1-7) apresenta interessantes efeitos na vasculatura coronariana. Alguns destes efeitos também apresentam variações com relação às doses ou concentrações e espécies utilizadas (Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996; Almeida et al., 2000; Castro et al., 2005). Em artérias isoladas de cães précontraídas com um análogo de tromboxano A2, o U-46619, a Ang-(1-7) promoveu vasorrelaxamento de maneira dose-dependente (10 nM – 100 µM). Este efeito foi completamente bloqueado por um antagonista não seletivo de Ang II, mas não pelos antagonistas específicos de AT1 (candesartan) ou AT2 (PD 123319), o que evidenciou a existência de um sítio de ligação específico para Ang-(1-7) nos vasos coronarianos de cães (Brosnihan et al., 1996) Esta ação vasodilatadora também foi observada por Porsti e colaboradores (1994). Por outro lado, a Ang(1-7) em altas concentrações (27, 70 e 210 nM) induziu diminuição do fluxo coronariano em corações isolados de ratos (Neves et al., 1997), mas não provocou mudanças consistentes na contratilidade cardíaca. Efeitos similares foram observados em corações de hamsters (Kumagai et al., 1990). A infusão crônica (8 semanas) de Ang-(1-7) melhorou a função endotelial aórtica e a perfusão coronariana em ratos submetidos a infarto agudo do miocárdio (Loot et al., 2002). Este peptídeo também apresenta importante ação potencializadora do efeito vasodilatador coronariano da bradicinina, como mostrado por estudos em corações isolados de ratos (Almeida et al., 2000) e em artérias isoladas de cães 28 (Brosnihan et al., 1996). Recentemente, nosso grupo demonstrou um complexo efeito vascular da Ang-(1-7) em corações isolados de camundongos (Castro et al., 2005). Neste modelo a Ang-(1-7) induziu vasodilatação na presença do antagonista do receptor AT1, losartan, sendo este efeito bloqueado pelos antagonistas dos receptores Mas e AT2 e também pela deleção genética do receptor Mas, sugerindo existirem possíveis interações entre os receptores angiotensinérgicos. O efeito vasodilatador da Ang-(1-7) também foi observado em outros leitos vasculares, incluindo artérias cerebrais de cães (Feterik et al., 2000), vasculatura sistêmica de felinos (Osei et al., 1993), arteríolas aferentes renais de coelho (Ren et al., 2002), anéis de aorta de ratos (le Tran and Forster, 1997), pele de ratos (Machado et al., 2002) e em vasos mesentéricos de ratos normotensos (Oliveira et al., 1999) e hipertensos (Fernandes et al., 2001). Diversos estudos têm documentado que estes efeitos vasodilatadores da Ang-(1-7) são dependentes do endotélio. Além disso, foi mostrado que as células endoteliais são importantes sítios de formação (Santos et al., 1992) e metabolismo da Ang-(1-7) (Chappell et al., 1998). A Ang-(1-7) pode estimular a produção de óxido nítrico, prostaglandinas ou fatores de relaxamento derivados do endotélio em células endoteliais (Brosnihan et al., 1996; Muthalif et al., 1998; Heitsch et al., 2001). O efeito vasodilatador da acetilcolina (efeito dependente do endotélio) foi completamente abolido em anéis de aorta de camundongos deficientes para o receptor Mas, confirmando a participação deste receptor na função endotelial (Santos et al., 2003). Um dos mecanismos responsáveis pela liberação de óxido nítrico estimulada pela Ang-(1-7) foi recentemente descrito por Sampaio e colaboradores (2007). Estes pesquisadores observaram que a Ang-(1-7) induz 29 liberação de óxido nítrico em células CHO (Chinese hamsters ovary) transfectadas com o receptor Mas e células endoteliais humanas através da estimulação da fosforilação do sítio estimulatório (Ser1177) e inibição do sítio inibitório (Thr495) da eNOS (endothelial nitric oxide synthase) (Sampaio et al., 2007). Este efeito foi dependente da via PI3K-AKT. Os dados in vitro estão de acordo com estudos que mostram a potencialização in vivo dos efeitos hipotensores da acetilcolina (Faria-Silva et al., 2005) e bradicinina (Paula et al., 1995) pela Ang-(1-7). Os poucos resultados obtidos em humanos ainda são contraditórios. Sasaki e colaboradores (2001) relataram efeito vasodilatador, ao passo que Davie e McMurray (1999) e Wilsdorf e colaboradores (2001) não observaram alterações vasculares induzidas pela Ang-(1-7) (Davie and McMurray, 1999; Sasaki et al., 2001; Wilsdorf et al., 2001). No entanto, estudos têm mostrado que a Ang-(1-7) tem participação importante nos efeitos hipotensores dos bloqueadores do receptor AT1 e dos inibidores da ECA (Iyer et al., 1998a; Iyer et al., 1998b; Collister and Hendel, 2003). Deddish e colaboradores (1998) demonstraram que o heptapeptídeo Ang-(1-7) é um substrato seletivo para o domínio N e um inibidor do domínio C da ECA (Deddish et al., 1998). Isso faz com que a ECA se torne uma importante via de inativação da Ang-(1-7) circulante e possivelmente tecidual. Assim, o uso de inibidores da ECA leva a um aumento da concentração sanguínea da Ang-(1-7) por dois motivos: (1) pelo aumento da disponibilidade de um precursor da Ang-(1-7), uma vez que a ECA é uma enzima responsável pela degradação da Ang I e (2) pela diminuição da degradação da Ang-(1-7) diretamente pela ECA, pois ela pode hidrolisar a ligação isoleucina5-histidina6 da Ang-(1-7), produzindo o pentapeptídeo Ang-(1-5) (Chappell et al., 1998; Ferrario 30 and Iyer, 1998). Esse aumento da concentração plasmática de Ang-(1-7) pode ser um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos benéficos na terapêutica com os inibidores da ECA, uma vez que o antagonista do receptor Mas, A-779, atenuou estes efeitos em alguns modelos experimentais (Kucharewicz et al., 2002; Maia et al., 2004). As ações vasculares da Ang-(1-7) não estão restritas ao endotélio, pois também apresenta efeitos antiproliferativos em células musculares lisas vasculares, sendo a inibição da atividade da cinase ERK1/2 um dos mecanismos envolvidos neste efeito (Freeman et al., 1996; Zhong et al., 2001; Tallant et al., 2005). 1.2. Receptores do sistema renina-angiotensina Existem dois principais subtipos de receptores para a Ang II, os receptores AT1, com 359 aminoácidos e bloqueados especificamente por bifenilimidazois, tal como o losartan, e os receptores AT2, os quais possuem 363 aminoácidos e são bloqueados por tetrahidroimidazopiridinas, como por exemplo, o PD 123319. Ambos apresentam sete domínios transmembrana e são acoplados à proteína G (Touyz and Berry, 2002; Campbell, 2003). Em humanos, há somente um único subtipo de receptor AT1, ao passo que em roedores, dois subtipos foram identificados, o AT1A e AT1B. O receptor AT1 é responsável pelas principais ações da Ang II e é predominante no controle de suas ações vasculares (Matsusaka and Ichikawa, 1997). Na vasculatura, receptores AT1 são expressos principalmente nas células musculares lisas. Já no coração, estes receptores estão presentes em 31 cardiomiócitos e fibroblastos, responsáveis por mediar efeitos inotrópico e cronotrópico positivo (Allen et al., 2000). O subtipo de receptor de Ang II AT2 é altamente expresso nos tecidos fetais e diminui rapidamente após o nascimento (Nahmias and Strosberg, 1995). Em adultos, a expressão do receptor AT2 é detectável no pâncreas, coração, rim, adrenais, miométrio, ovário, cérebro e vasos (Nahmias and Strosberg, 1995). O receptor AT2 é re-expresso em adultos após injúrias vascular e cardíaca e durante processos de cicatrização e obstrução renal, sugerindo um papel deste subtipo de receptor no remodelamento, crescimento e desenvolvimento tecidual (Tsuzuki et al., 1994). Os papeis funcionais deste receptor ainda são controversos, mas eles podem antagonizar, em condições fisiológicas, efeitos mediados pelo AT1 inibindo crescimento celular e por induzir apoptose e vasodilatação (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Por outro lado, estudos de fluxo sanguíneo em humanos saudáveis mostraram que o receptor AT2 não está envolvido na modulação do tônus vascular (Phoon and Howes, 2001). Outros estudos sugerem que estes receptores também contribuem para processos patológicos associados com hipertrofia cardíaca e inflamação (Mifune et al., 2000; Ichihara et al., 2001). No entanto, ainda há divergências sobre a participação do receptor AT2 no remodelamento cardíaco (Lako-Futo et al., 2003). Desde a descoberta da Ang-(1-7), várias evidências farmacológicas e fisiológicas apontavam para a existência de um receptor específico para este peptídeo. Esta hipótese foi fortalecida com a descoberta do antagonista seletivo da Ang-(1-7), o [7-D-Ala]-Ang-(1-7) (A-779) (Santos et al., 1994) e confirmada posteriormente por Santos e colaboradores em 2003, os quais identificaram o protooncongene Mas, um receptor com 325 aminoácidos, acoplado à proteína G e 32 com sete domínios transmembrana (Young et al., 1986), como um receptor específico para a Ang-(1-7) (Santos et al., 2003). Neste estudo foi observado que a deleção genética deste receptor aboliu a ligação da Ang-(1-7) em rins de camundongos. Estes camundongos também perderam completamente a ação antidiurética após sobrecarga aguda de água e a resposta vasodilatadora da Ang(1-7) em anéis de aorta. Experimentos in vitro mostraram a ligação da Ang-(1-7) em células CHO transfectadas com receptor Mas. Coletivamente, estes achados identificaram o Mas como um sítio específico de ligação para a Ang-(1-7). Este receptor é expresso em diferentes tecidos e células, tais como, testículo, coração, rim, cérebro, células endoteliais e musculares lisas vasculares e plaquetas (Metzger et al., 1995; Santos et al., 2003; Becker et al., 2007; Sampaio et al., 2007; Fraga-Silva et al., 2008). Recentemente, um estudo realizado em aortas de ratos Sprague-Dawley mostrou que o efeito vasodilatador da Ang-(1-7) foi mediado por receptores sensíveis ao D-Pro7-Ang-(1-7), mas não por receptores sensíveis ao A-779, o que sugere a existência de um segundo subtipo de receptor de Ang-(1-7) (Silva et al., 2007). Alguns estudos sugerem a existência de interações entre o receptor Mas e outros receptores, tais como o receptor de bradicinina B2 e o de Ang II, AT2, podendo ser um mecanismo envolvido no processo de liberação de mediadores vasodilatadores induzidos pela Ang-(1-7). Por exemplo, a ação vasodilatadora da Ang-(1-7) pode ser bloqueada pelo antagonista do receptor B2 de bradicinina (HOE-140) (Brosnihan et al., 1996; Gorelik et al., 1998). Recentemente, um estudo mostrou uma possível participação da bradicinina na vasodilatação induzida pela Ang II em vasos mesentéricos pré-contraídos. Nesta preparação, o antagonista do receptor Mas também atenuou o efeito vasodilatador da Ang II, 33 bem como da bradicinina (Soares de Moura et al., 2004). Além disso, foi sugerido que a Ang-(1-7) pode modular as alterações induzidas pela Ang II na resistência vascular (Roks et al., 1999). Outros estudos descreveram ações vasoconstritoras da Ang-(1-7) em altas concentrações (van Rodijnen et al., 2002), o que pode ser justificado pela sua fraca afinidade de ligação ao receptor AT1 (Rowe et al., 1995). Interações entre os receptores Mas e AT1 também foram fortemente evidenciadas (Castro et al., 2005; Kostenis et al., 2005). 1.3. SRA e a estrutura cardíaca Além dos mecanismos neuro-humorais, a função cardíaca também é determinada pela interação coordenada e dinâmica de células contráteis com os componentes da matriz extracelular (MEC). Esta interação é regulada por sinais químicos, mecânicos e elétricos entre os componentes celulares e não celulares do coração (Banerjee et al., 2006). Assim uma disfunção nestes componentes teciduais e consequentemente na estrutura cardíaca podem levar a uma alteração na função cardíaca. A matriz extracelular cardíaca consiste de colágenos intersticiais, proteoglicanas e glicoproteínas que estão arranjadas em uma rede tridimensional precisa em associação com miócitos, fibroblastos e capilares. Está claro que a MEC é uma estrutura dinâmica cuja organização e composições são conhecidas por modularem vários processos celulares. Eventos que alteram a composição molecular ou a organização dos componentes da MEC podem levar a sérios efeitos na função celular (Brilla et al., 1990; Gonzalez et al., 2002). Dentro do miocárdio, a MEC forma uma elaborada rede que interconecta os cardiomiócitos 34 uns aos outros e com os capilares dentro da parede ventricular (Robinson et al., 1983). Esta rede intersticial dentro do miocárdio é composta predominantemente de colágenos fibrilares, os quais são produzidos principalmente por fibroblastos e miofibroblastos (Weber et al., 1989; Mukherjee and Sen, 1991; Gonzalez et al., 2002). Dentre os colágenos presentes no coração, o tipo I é predominante (normalmente acima de 50 %). Ele está associado principalmente às fibras grossas e confere resistência a deformação. O colágeno tipo III compreende 10 – 45 % dos colágenos fibrilares. Está associado às fibras finas que conferem elasticidade (Brower et al., 2006). Estes colágenos fibrilares fornecem uma rede estrutural para os cardiomiócitos e vasos coronários e dá ao tecido cardíaco propriedades físicas de rigidez e resistência à deformação (Weber, 1989; Burlew and Weber, 2000). Em adição, o colágeno fibrilar também age como uma ligação entre os elemento contráteis dos cardiomiócitos adjacentes (Terracio et al., 1991). O remodelamento cardíaco é um processo pelo qual alterações moleculares, celulares e intersticiais se manifestam como alterações na estrutura, arquitetura e função ventricular em resposta, entre outros fatores, a sobrecargas hemodinâmicas, ativação neuro-humoral e inflamação (Pfeffer and Braunwald, 1990; Cohn et al., 2000; Sutton and Sharpe, 2000). No nível celular, os principais componentes do remodelamento cardíaco são as alterações nos miócitos, tais como, hipertrofia e apoptose, proliferação de fibroblastos e a produção e degradação de proteínas da matriz extracelular (Passeri and Bloch, 2005). Foi mostrado que os miofibroblastos cardíacos expressam componentes do SRA, incluindo angiotensinogênio, renina, ECA, e são capazes de sintetizar angiotensina (Katwa et al., 1997). Vários estudos mostram mudanças no acúmulo, composição ou organização de proteínas da MEC durante o desenvolvimento de 35 doenças cardíacas. Muitas dessas alterações estão associadas com a ativação de sistemas humorais, como por exemplo, o SRA. Vários estudos demonstraram que componentes local ou circulante deste sistema, estão envolvidos no desenvolvimento de fibrose miocardial em diferentes patologias cardíacas (Sadoshima and Izumo, 1993; Ju and Dixon, 1996b; Zhou et al., 1996; Hafizi et al., 1998; Ichihara et al., 2001; Gonzalez et al., 2002). A fibrose miocardial, caracterizada por uma elevação na quantidade de colágenos, fibronectina e outras proteínas de MEC, aparece em modelos animais de hipertrofia e insuficiência cardíaca relacionados ao SRA (Weber and Brilla, 1991; Boluyt et al., 1994). A Ang II, principalmente via receptor AT1, pode induzir respostas que afetam a estrutura e função do coração. Estas respostas incluem a hipertrofia de cardiomiócitos e acúmulo de tecido fibroso, ambos contribuindo para um progressivo comprometimento da função cardíaca (Villarreal and Dillmann, 1992; Ju and Dixon, 1996a; Kawano et al., 2000; Schnee and Hsueh, 2000; Pathak et al., 2001; Lijnen and Petrov, 2003). Estudos in vitro de fibroblastos cardíacos de ratos adultos e neonatos mostraram que a angiotensina II estimula a proliferação de fibroblastos e a síntese de colágenos via receptor AT1 (Crabos et al., 1994; Zhou et al., 1996). Fielitz e colaboradores (2001) observaram um aumento de RNA mensageiros para colágenos I e III e fibronectina em miocárdio de pacientes com doença de válvula aórtica, sendo esta regulação associada com a ativação do SRA (Fielitz et al., 2001). A hipertrofia do miócito cardíaco é um importante mecanismo adaptativo que ocorre em resposta a sobrecarga hemodinâmica e precede a maioria dos tipos de insuficiência cardíaca (Braunwald and Bristow, 2000; Lorell and Carabello, 2000). Várias evidências provenientes de estudos clínicos, bem como 36 de modelos experimentais de insuficiência cardíaca e culturas de células mostram importante participação do SRA no processo de hipertrofia cardíaca (Yamazaki et al., 1998). A ativação adrenérgica crônica também é responsável por efeitos deletérios no coração relacionados ao remodelamento cardíaco, incluindo injúrias e apoptose no miócito cardíaco, função celular e transdução de sinal alterados, hipertrofia e fibrose cardíaca. Estas disfunções resultam em remodelamento miocardial progressivo e deterioração da função cardíaca (Murray et al., 2000). A Ang-(1-7) por sua vez, tem sido considerada um componente importante na modulação do remodelamento cardíaco. Loot e colaboradores (2002) observaram que o tratamento crônico com Ang (1-7) atenuou a hipertrofia dos miócitos de ratos infartados (Loot et al., 2002). Averill e colaboradores (2003) observaram que o infarto agudo do miocárdio induzido pela oclusão da artéria coronária esquerda aumentou significativamente a imunorreatividade para Ang-(17) ao redor da área infartada, sugerindo uma participação deste peptídeo na recuperação das injúrias teciduais (Averill et al., 2003). Iwata e colaboradores (2005) observaram que Ang-(1-7) pode se ligar a fibroblastos cardíacos e regular funções celulares que estão envolvidas no remodelamento cardíaco, tais como diminuição da síntese de colágenos e de processos hipertróficos (Iwata et al., 2005). Grobe e colaboradores (2005, 2006) observaram que a administração crônica de Ang-(1-7) em ratos hipertensos atenuou a hipertrofia e fibrose cardíaca sem modificar as alterações na pressão arterial (Grobe et al., 2006; Grobe et al., 2007). He e colaboradores (2005) também avaliaram a expressão gênica de colágenos I e III em ratos hipertensos tratados com Ang-(1-7) e observaram que o aumento da expressão do RNA mensageiro destes colágenos, induzido pela hipertensão, no miocárdio ventricular esquerdo foi diminuída pelo tratamento com 37 Ang-(1-7), sugerindo que a Ang-(1-7) pode modular o remodelamento cardíaco através da inibição da síntese de proteínas da matriz extracelular (He et al., 2004). Em 2006, Gava demonstrou a importância do receptor Mas na modulação de proteínas da matriz extracelular no coração (Gava, 2006). Foi observado que animais knockout para o receptor Mas apresentam expressões aumentadas de colágeno I, III e fibronectina sugerindo que a interação Ang-(1-7)-Mas, pode promover importantes efeitos anti-fibróticos no coração. Nesse estudo nós objetivamos avaliar a participação da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no controle da função cardíaca e vascular em dois modelos de animais geneticamente modificados, ou seja, animais com ganho ou perda de função do eixo Ang-(1-7)/Mas. 38 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Avaliar a participação da Ang-(1-7) via receptor Mas na função cardíaca utilizando dois modelos de animais geneticamente modificados, sendo um com ganho e outro com perda de função do eixo Ang-(1-7)/Mas. 2.2. Objetivos específicos · Avaliar a função cardíaca em corações isolados de camundongos com deleção genética do receptor Mas em condições basais e após serem submetidos à isquemia/reperfusão. · Avaliar a função cardíaca em corações isolados de ratos transgênicos que apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração. · Avaliar a incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos que apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração. · Avaliar a resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em camundongos com deleção genética do receptor Mas. · Avaliar as resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em ratos que apresentam níveis elevados de Ang-(1-7) no coração. · Avaliar o papel do receptor Mas e o efeito do aumento dos níveis de Ang(1-7) nos vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas.. 39 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Animais Foram utilizados camundongos com deleção genética dos receptores Mas (KO-Mas), AT2 (KO-AT2) ou AT1 (KO-AT1) e seus controles [C57BL/6 (WT) e FVBN] com idades entre 10 e 14 semanas e ratos transgênicos da linhagem TG(hA1-7)L7301 que expressam uma proteína de fusão produtora de Ang-(1-7) no coração e seu controle Sprague Dawley (SD) com idades entre 6 e 7 meses. Estes animais foram fornecidos pelo biotério de animais transgênicos do Laboratório de Hipertensão do ICB-UFMG. 3.2. Preparação dos corações isolados Para a perfusão dos corações isolados de camundongo foi utilizada a técnica de Langendorff com fluxo constante. O fluxo utilizado foi de 2,0 ml/min a uma temperatura de 37 ± 1 oC. Para a perfusão dos corações de ratos foi utilizada a técnica de Langendorff com pressão constante. Esta pressão era mantida em 65 mmHg durante todo o experimento e também a uma temperatura de 37 ± 1oC. A composição da solução nutridora utilizada para a perfusão dos corações isolados (Solução de Krebs-Ringer) está detalhada na tabela 1. 40 Tabela 1. Composição da solução de Krebs-Ringer. COMPOSTO CONCENTRAÇÃO EM mM NaCl 118,41 KCl 4,69 KH2PO4 1,17 MgSO4 .7H2O 1,17 CaCl2 . 2H2O 2,51 Dextrose anidra (glicose) 11,65 NaHCO3 26,24 Os animais foram sacrificados por decapitação 10 minutos após serem heparinizados (100 UI em camundongos e 400 UI em ratos). Uma vez exposta a cavidade torácica, o coração era retirado e colocado em um béquer contendo solução nutridora oxigenada e em temperatura de aproximadamente 4 ºC. O resfriamento tem por objetivo diminuir o metabolismo do miocárdio e o consumo de O2 nos instantes anteriores à canulação do coração. Depois de transferido para a placa de Petri, os restos de tecido pulmonar e vascular, traquéia e esôfago que acompanhavam o coração eram removidos. Em seguida, a aorta ascendente era seccionada na altura de sua primeira ramificação (tronco braquiocefálico), fixada uma agulha de aço inoxidável conectada ao sistema de perfusão contendo a solução nutridora. Desta forma, permitia-se que a solução nutridora percorresse retrogradamente o coto aórtico remanescente promovendo o fechamento da valva aórtica e consequentemente a perfusão das artérias coronarianas. O tempo do sacrifício até o início da perfusão era de aproximadamente 3 minutos. Caso o período de preparação excedesse este tempo o coração era descartado. 41 Um transdutor de força era conectado ao ápice do coração para o registro da tensão sistólica e diastólica. Para o registro de pressão de perfusão nos experimentos onde foi utilizada a técnica de fluxo constante, um transdutor de pressão foi acoplado ao sistema por uma abertura imediatamente acima do coração. Nos corações isolados de ratos, onde foi utilizada a técnica de pressão constante, o fluxo era coletado durante 1 minuto em intervalos regulares de 5 minutos. Um eletrodo bipolar era colocado diretamente na superfície do coração para o registro do eletrocardiograma. Este registro foi utilizado para avaliar a presença das arritmias de reperfusão. A aquisição dos dados foi realizada através do Biopac Systems, Inc. (USA). A freqüência cardíaca e as derivadas da tensão (+dT/dt e -dT/dt) foram calculadas a partir da onda de tensão sistólica. 3.2.1. Protocolos A. Isquemia/Reperfusão Após um período basal de 20-30 minutos, os corações isolados de camundongos foram submetidos à anóxia global por 20 minutos com o desligamento da bomba de infusão e posteriormente reperfundidos por um período de 30 minutos (Figura 3 A). Para confirmar o papel do receptor Mas na função cardíaca, um grupo adicional de camundongos WT foi perfundido com Krebs-Ringer contendo o antagonista do receptor Mas A-779 (2 nM). A perfusão deste antagonista foi iniciada no início do período basal e mantido durante todo o experimento (Figura 3 A). 42 Os corações isolados de ratos foram submetidos à isquemia regional do ventrículo esquerdo. Após um período basal de 20-30 minutos, a artéria coronária descendente esquerda era ocluída por 15 minutos. Decorrido este tempo, os corações eram reperfundidos por 30 minutos (Figura 3 B). As arritmias cardíacas foram definidas como presença de taquicardia e/ou fibrilação ventricular após a reperfusão. Para avaliar quantitativamente as arritmias de reperfusão, estas foram graduadas arbitrariamente de acordo com sua duração e utilizado o “Índice de Severidade de Arritmias” (Tabela 2), como descrito previamente (Bernauer and Ernenputsch, 1988; Ferreira et al., 2001; Santos et al., 2004), sendo consideradas irreversíveis as arritmias com duração de 30 minutos. Tabela 2. Índice de Severidade de Arritmias. Duração (min) Índice (undades arbitrárias) ≤3 2 3a6 4 6 a 10 6 10 a 15 8 15 a 20 10 20 a 25 11 25 a 30 12 B. Avaliação do efeito vasodilatador da Acetilcolina Para avaliar a possível participação do receptor Mas no efeito vasodilatador coronariano da acetilcolina, os corações isolados de camundongos eram mantidos por um período de estabilização de 20 minutos em ritmo sinusal e posteriormente estimulados por um período adicional de 15 minutos com 43 frequência constante de 420 bpm através da utilização de um estimulador elétrico. Este procedimento foi adotado para evitar assistolias cardíacas induzidas pela acetilcolina. Decorrido este tempo, a acetilcolina (10-7 M) era adicionada à solução nitridora e perfundida por 20 minutos (Figura 3 C). A Basal Anóxia Reperfusão 20-30 min 20 min 30 min Basal Anóxia Reperfusão 20-30 min 20 min 30 min A-779 B Isquemia Basal 15 min 20-30 min C 30 min Acetilcolina (10-7 M) Basal 20-30 min Reperfusão 15 min 20 min Estimulação Elétrica (420 bpm) Figura 3. Diagrama esquematizando os protocolos experimentais. 44 3.3. Radioimunoensaio 3.3.1. Coleta do Coração e Plasma dos Ratos Transgênicos TG(hA1-7)L7301 e SD Os ratos foram sacrificados por decapitação, seguindo-se de coleta de aproximadamente 3 ml de sangue em tubo de polietileno mantido em gelo contendo coquetel de inibidores de proteases (Tabela 3). Cada tubo continha 420 ml do coquetel (140 ml para 1 ml de sangue). O sangue foi centrifugado por 10 min, 2.500 rpm a 4 ºC, o plasma separado e congelado a -20º C para posterior extração da Ang-(1-7). O coração foi retirado, separado os átrios e ventrículos, congelado em nitrogênio líquido e mantidos em temperatura de -80 ºC até o momento da homogeneização. Tabela 3. Coquetel de Inibidores de Proteases. Inibidor enzimático Volume utilizado por ml de amostra Para-hidroximercúrio-benzoato (pOHHgHz), 1 mM 10 ml Orto-fenantrolina, 30 mM 50 ml Fenilmetilsulfonil fluorídrico (PMSF), 1 mM 10 ml Ácido etilenodinitrilotetra-acético (EDTA), 7,5 % 50 ml Pepstatin A, 1 mM 20 ml As soluções de pOHHgBz e PMSF foram preparadas no dia da coleta. As demais soluções foram preparadas nos dias anteriores, sendo a pepstatin A e orto-fenantrolina conservados em freezer - 20º C e EDTA 7,5% mantido em geladeira. O coquetel de inibidores de proteases foi preparado imediatamente antes da coleta do sangue. 45 3.3.2. Homogeneização de tecidos, extração das amostras e dosagens dos peptídeos. A. Homogeneização do ventrículo esquerdo. O ventrículo foi homogeneizado com o auxílio de um homogeneizador (Turax) utilizando-se 10 ml de solução de etanol ácido (HCl 0,045 N/etanol) na presença de 1400 ml de coquetel de inibidores de proteases como descrito anteriormente e 10 ml de BSA 5% em água deionizada. Amostras dos homogenatos foram retiradas para dosagem de proteínas pelo método de Bradford (Bradford, 1976). Após homogeneização, as amostras foram centrifugadas por 30 min a 10.000 rpm à 4º C. O sobrenadante foi vertido para um tubo de polietileno lavado com BSA 0,1 % para liofilização em centrífuga evaporadora por 10-12 horas ou até a formação do resíduo. Depois de liofilizado, o resíduo foi ressuspendido seqüencialmente em 750 ml de água miliq, soluções de TFA 0,2% e TFA 0,1%. Para a completa dissolução desses resíduos foi utilizado aparelho de ultra-som (Vibra Cell, Sonics e Materiasl Inc). O sobrenadante resultante foi transferido para tubo de polietileno lavado com BSA 0,1% e logo após a Ang-(1-7) foi extraída em colunas C18 - Bond Elut. B. Extração da Ang-(1-7) do plasma e ventrículo esquerdo em colunas Bond Elut - C18 46 Para a extração da angiotensina do plasma e coração, as colunas Bond Elut foram pré-ativadas com 10 ml de ACN 99,9%/HFBA 0,1% e 10 ml de HFBA 0,1%. Após pré-ativação, as colunas foram ativadas usando-se: 10 ml de ACN 99,9%/HFBA 0,1%, 10 ml de HFBA 0,1%, 3 ml de BSA 0,1%/HFBA 0,1%, 10 ml de ACN 10%/HFBA 0,1%, 3 ml de HFBA 0,1%. Após ativação da coluna as amostras foram aplicadas, seguindo-se de lavagem seqüencial com 20 ml de HFBA 0,1% e 3 ml de ACN 20%/HFBA 0,1%. Os peptídeos foram eluidos com 3 ml de ACN 99,9%/HFBA 0,1% em tubos de polietileno lavados com BSA 0,1%. As amostras de plasma antes de serem aplicadas na coluna, foram centrifugadas por 20 min/2.500 rpm/4 ºC. C. Radioimunoensaio para Angiotensina-(1-7) Para a realização do radioimunoensaio e obtenção das concentrações de Angiotensina-(1-7) foram utilizadas as seguintes soluções: I - Tampão do ensaio: Tris-HCl 50 mM , BSA 0,1% , Nacl 50 mM, Ázida Sódica 0,02% . Os reagentes foram dissolvidos em 400 ml de H2O deionizada. O pH foi acertado para 7,5 com HCl 3 N e o volume completado para 500 ml com H2O deionizada. II – Tampão II: NaCl 0,9% , BSA 0,1%, Ácido acético glacial 0,03%. Os reagentes foram dissolvidos em 500 ml de água deionizada. Esta solução foi usada para reconstituição das amostras e diluição da curva padrão. III - Anticorpo policlonal (título 1:20.000). Preparado a partir de solução estoque de reconstituição 1:500, pela dissolução em tampão do ensaio. Este anticorpo apresenta menos que 0,001% de reatividade cruzada com a Ang I e Ang II, 47 0,001% de reatividade cruzada com Ang-(2-7), Ang-(3-7), 0,08% de reatividade cruzada com Ang-(4-7) e 0,005% com Ang-(1-5). IV - 125I Ang-(1-7): marcada, purificada e diluída com tampão do ensaio, para uma concentração de 6000 cpm para cada 0,1 ml. V – Curva Padrão: As concentrações de padrão utilizadas foram de 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 pg/0,1 ml, diluídos em tampão II utilizando-se balão volumétrico, preparadas a partir de uma solução estoque de 2 mg/ml. VI - Suspensão de Carvão: A separação do peptídeo ligado ao anticorpo do peptídeo livre foi feita pela adição de solução de carvão ativado-dextran após incubação de 18-22 horas. O carvão ativado e o dextran foram dissolvidos em tampão do ensaio. A suspensão foi mantida sob agitação constante, em banho de gelo por 1 hora antes do uso. Cada ensaio seguiu o seguinte protocolo (Tabela 4): Tabela 4. Soluções e volumes utilizados para RIE de Ang-(1-7). Total Branco P0 1 Padrão Amostra - 100 100 _ _ 1300 200 100 100 100 Pontos da curva _ _ _ 100 _ Amostra _ _ _ _ 100 100 100 100 100 100 _ _ 100 100 100 1400 400 400 400 400 Soluções (ml) Tampão II Tampão do ensaio 125 IAng-(1-7) 2 Anticorpo Volume final 1 2 Valor de referëncia Ang-(1-7) radioiodada 48 Após adição das respectivas soluções nos tubos estes foram agitados em vórtex e incubados por 18-22 horas. Após a incubação foi adicionado 1 ml de suspensão de carvão em todos os tubos exceto no tubo total e todos foram centrifugados a 4 o C, 2.500 rpm por 20 min. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e realizada a leitura no contador gama. 3.3.3. Dosagem de Proteínas A determinação da proteína foi feita com o objetivo de corrigir e padronizar os resultados da concentração tecidual de Ang-(1-7) por miligrama de proteína. Foi retirado 100 ml do homogenato para posterior dosagem de proteína. As amostras foram diluídas quando necessário, sendo usados 10 ml no ensaio que foram feitos em duplicata. Foram adicionados às amostras, 40 ml de água miliq e 2,5 ml de Comassie Blue. Foi utilizada albumina de soro bovino (BSA) para construção da curva padrão. A curva padrão foi realizada de acordo com a tabela abaixo (Tabela 5): Tabela 5. Curva padrão para dosagem de proteína. Pontos da Curva Vol. Proteína Vol.água Vol. Comassie Blue Branco - 50,0 ml 2,5 ml 2,5 mg 2,5 ml 47,5 ml 2,5 ml 5,0 mg 5,0 ml 45,0 ml 2,5 ml 10,0 mg 10,0 ml 40,0 ml 2,5 ml 20,0 mg 20,0 ml 30,0 ml 2,5 ml 40,0 mg 40,0 ml 10,0 ml 2,5 ml 49 Após adição de Comassie Blue, as amostras foram agitadas e deixadas à temperatura ambiente por 10 min, e então lidas em espectrofotômetro com comprimento de onda de 595 nanômetros. Os cálculos foram feitos a partir das absorbâncias obtidas. 3.4. Tratamento com isoproterenol Para avaliar a resposta hipertrófica e fibrótica nos animais estudados, foi utilizado o tratamento com isoproterenol (Sigma, USA). Os camundongos KO-Mas e WT foram submetidos a injeções s.c. diárias de isoproterenol (20 mg/Kg) ou salina 0,9 % (0,1 mL) durante 5 dias. Os ratos TG(hA1-7)L7301 e os controles Sprague-Dawley (SD) foram submetidos a injeções i.p. diárias de isoproterenol (3 mg/Kg) ou salina 0,9 % (0,2 mL) durante 7 dias. 3.5. Processamento do material para análises de morfometria e imunofluorescência Os corações foram perfundidos com solução de PBS a 4°C para remoção do sangue da parede ventricular, fixados em metanol 80% / DMSO 20% e criosubstituido a -80°C durante seis dias. Após este período, os tecidos foram transferidos para -20°C por 1 dia. Após a fixação e a criosubstituição, os corações foram submetidos ao processo de inclusão seguindo os procedimentos descritos na tabela 6. 50 Tabela 6. Descrição dos procedimentos realizados para o processo de inclusão dos tecidos. Desidratação: Álcool absoluto 1 (30 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 2 (30 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 3 (30 min, temperatura ambiente) Diafanização: Xilol 1 (30 min, temperatura ambiente) Xilol 2 (30 min, temperatura ambiente) Infiltração: Xilol 50% / Paraplast Plus 50% (12 horas, 63ºC) Paraplast 1 (30 minutos, 63ºC) Paraplast 2(30 minutos a 63ºC) Inclusão: Paraplast (63ºC) Após a inclusão em paraplast foram realizados cortes histológicos de 7 e 4 µm de espessura para imunofluorescência e morfometria, respectivamente. 3.6. Análise dos colágenos I e III e fibronectina por Imunofluorescência A técnica de imunofluorescência indireta foi utilizada para identificar e quantificar as moléculas de colágenos I e III e fibronectina. Foi realizada a determinação das diluições ideais dos anticorpos primário e secundário para a imunofluorescência. Um controle sem o uso dos anticorpos primário e secundário foi feito para verificar se o tecido possuía autofluorescência. Controles utilizando somente os anticorpos secundários foram realizados em todos os experimentos e foram negativos em todos os casos. Os núcleos celulares foram marcados com iodeto de propídeo em alguns cortes histológicos (pseudocolor azul). As 51 especificações dos anticorpos utilizados e suas diluições encontram-se na tabela 7. Tabela 7. Especificação dos anticorpos utilizados na técnica de imunofluorescência indireta. Anticorpo Especificação Policlonal, coelho anti colágeno I humano Policlonal, coelho anti Primários colágeno III humano Policlonal, coelho anti fibronectina humano Diluição Fonte 1:400 Rockland 1:400 Rockland 1:600 Rockland Policlonal, burro anti-(IgG de Secundário coelho) conjugado com Cy3 ou Cy5 1:400 Jackson Imuno Research Após a montagem das lâminas, foram realizados os seguintes procedimentos para imunofluorescência indireta (Tabela 8): 52 Tabela 8. Descrição dos procedimentos para a realização da técnica de imunofluorescência. Desparafinização: Xilol 1 (10 min, temperatura ambiente) Xilol 2 (10 min, temperatura ambiente) Xilol 3 (10 min, temperatura ambiente) Hidratação: Álcool absoluto 1 (5 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 2 (5 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 3 (5 min, temperatura ambiente) Álcool 95 % (3 min, temperatura ambiente) Álcool 70 % (3 min, temperatura ambiente) Álcool 50 % (3 min, temperatura ambiente) Álcool 25 % (3 min, temperatura ambiente) Água (3 min, temperatura ambiente) PBS3 (10 min, temperatura ambiente) Etapa de bloqueio4: 60 min, temperatura ambiente. Incubação anticorpo Diluição em PBS com BSA 0,1% e Tween 20 primário: 0,01% - overnight, 4ºC. Lavagem das lâminas: 4 banhos de 5 minutos em PBS. Incubação anticorpo Diluição em PBS com BSA 0,1% e Tween 20 secundário: 0,01%, 60 min, temperatura ambiente. Lavagem das lâminas: 4 banhos de 5 minutos em PBS. Montagem das lâminas: Solução de glicerina 90% / TRIS 1M 10% pH 9,0, 25ºC. Os cortes submetidos à técnica de imunofluorescência foram analisados em microscopia confocal Zeiss 510Meta. 3 Phosphate-Buffered Saline – Tampão fosfato salino Solução de Bloqueio: BSA 1 % e Tween 20 0,1% em PBS 4 53 3.6.1. Análise quantitativa de colágenos I e III e fibronectina. Para a quantificação dos colágenos I e III e fibronectina foi medida a intensidade de fluorescência no miocárdio dos ventrículos esquerdos dos animais. Foram capturadas 3 imagens nos ventrículos de camundongos e 4 nos ventrículos de ratos. As imagens foram analisadas em escala de cinza através do programa ImageTool 2.04. A intensidade de fluorescência é fornecida através da unidade “Nível de Cinza”, que varia do valor zero (preto) ao valor 255 (branco). Quanto mais próximo do valor 255, maior a intensidade fluorescência. Os parâmetros utilizados do microscópio confocal foram os mesmos para todos os grupos e controle do anticorpo secundário, tornando o nível de fluorescência uniforme, confiável e possível de comparação. 3.7. Análise Morfométrica A hipertrofia cardíaca foi analisada em cortes transversais de ventrículos esquerdos (4 mm) corados com hematoxilina e eosina, como detalhado na tabela 9. O diâmetro dos miócitos foi avaliado em 2 cortes por animal usando um micromedidor ocular adaptado ao microscópio de luz (BX 60, Olympus) com 400x de magnificação. Somente cardiomiócitos cortados longitudinalmente com núcleo e limites celulares visíveis foram analisados (aproximadamente 30 cardiomiócitos por corte). O diâmetro de cada miócito foi medido na região correspondente ao núcleo. 54 Tabela 9. Descrição dos procedimentos para a realização da coloração dos cortes histológicos com hematoxilina e eosina. Desparafinização: Xilol 1 (30 min, temperatura ambiente) Xilol 2 (15 min, temperatura ambiente) Xilol 3 (15 min, temperatura ambiente) Hidratação: Álcool absoluto 1 (2 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 2 (2 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 3 (2 min, temperatura ambiente) Álcool 90 % (2 min, temperatura ambiente) Álcool 80 % (2 min, temperatura ambiente) Álcool 70 % (2 min, temperatura ambiente) Lavagem das laminas: Água corrente, 20 min, temperatura ambiente. Solução de Hematoxilina: 1 min, temperatura ambiente Lavagem das lâminas: Água corrente, 20 min, temperatura ambiente. Solução de eosina: 40 seg, temperatura ambiente Desidratação: Álcool 70 % (1 min, temperatura ambiente) Álcool 80 % (1 min, temperatura ambiente) Álcool 90 % (1 min, temperatura ambiente) Álcool 95 % (1 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 1 (21 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 2 (1 min, temperatura ambiente) Álcool absoluto 3 (1 min, temperatura ambiente) Montagem das lâminas: Xilol 1 (2 min, temperatura ambiente) Xilol 2 (2 min, temperatura ambiente) Xilol 3 (10 min, temperatura ambiente) 55 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados estão expressos com média ± EPM. Para a análise estatística dos resultados dos corações isolados foram realizados os testes Two way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni ou teste t-student não pareado. Este último também utilizado para análise dos resultados de radioimunoensaio. One way ANOVA seguido do teste de Newman-Keuls foi usado para análise morfológica e imunohistoquímica. 56 5. RESULTADOS 5.1. Efeito da deleção genética do receptor Mas na Contratilidade Cardíaca. Os corações de camundongos com ausência da expressão do receptor Mas foram submetidos à técnica de Langendorff com fluxo constante para avaliação da função cardíaca. A contratilidade cardíaca apresentou importantes diferenças entre os grupos antes, durante e após a isquemia. A tensão sistólica foi significativamente menor nos corações dos animais KO-Mas no período basal (1,31 ± 0.18 vs 2,09 ± 0,13 g nos animais WT, p<0,05) e na reperfusão. Durante a isquemia os corações dos animais WT apresentaram diminuição na tensão sistólica, alcançando assim valores semelhantes aos observados nos animais KOMas. No entanto, durante a reperfusão a tensão sistólica retornou aos valores basais nos animais WT, enquanto nos corações KO-Mas permaneceu constante em todos os períodos. O bloqueio agudo do receptor Mas com seu antagonista A779, induziu uma alteração similar àquelas observadas nos corações dos comundongos KO-Mas no período basal e na reperfusão (Figura 4 A). A tensão diastólica foi similar entre os grupos no período basal. No entanto, ocorreu um significativo aumento nos corações dos camundongos WT comparado aos animais KO-Mas durante o período isquêmico e pós-isquêmico (0,27 ± 0,01 vs 0,70 ± 0,06 g nos animais WT durante a reperfusão, p<0,05). Os corações WT perfundidos com o antagonista A-779 tiveram alteração semelhante aos animais KO-Mas durante a reperfusão (Figura 4 B). 57 A 3.5 *# Tensão Sistólica (g) 3.0 # *# WT, n=8 KO, n=5 WT + A-779, n=3 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal Anóxia Reperfusão Tempo(min) Tensão Diastólica (g) B 2.0 *# 1.5 *# WT, n=8 KO, n=5 WT + A-779, n=3 1.0 0.5 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal Anóxia Tempo(min) Reperfusão Figura 4. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na tensão sistólica (A) e diastólica (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # WT vs WT perfundidos com KR contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). 58 Os corações dos animais KO-Mas apresentaram +dT/dt significativamente menor nos períodos basal e reperfusão comparados aos camundongos WT (42,58 ± 3,86 vs 60,96 ± 4,12 g/s nos camundongos WT durante o peíodo basal, p<0,05) (Figura 5 A). Além disso, a deleção do receptor Mas induziu significante queda da –dT/dt durante o período basal (42,69 ± 3,47 vs 58,26 ± 3,80 g/s nos corações WT, p<0,05), porém, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos durante a isquemia ou reperfusão (Figura 5 B). O antagonista A779, de maneira similar à deleção genética do receptor Mas, induziu significativa queda em ambos os parâmetros, +dT/dt e -dT/dt no período basal. A 100 *# + dT/dt (g/s) 75 * 50 WT, n=8 KO, n=5 WT + A-779, n=3 25 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal Anóxia Tempo(min) Reperfusão 59 B 100 *# - dT/dt (g/s) 75 50 WT, n=8 KO, n=4 WT + A-779, n=3 25 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal Anóxia Tempo(min) Reperfusão Figura 5. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na +dT/dt (A) e -dT/dt (B) de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). A frequência cardíaca também foi diferente entre os grupos, sendo menor nos corações KO-Mas e WT tratados com A-779 comparados ao grupo controle (242,7 ± 10,26 bpm nos camundongos KO-Mas vs 322,7 ± 10,50 bpm nos animais WT durante o período basal, p<0,05). No entanto, estas diferenças não ocorreram durante ou após a isquemia (Figura 6). 60 *# Freqência Cardíaca (bpm) 400 300 200 WT, n=8 100 KO, n=5 WT + A-779, n=3 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal Anóxia Tempo(min) Reperfusão Figura 6. Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na freqüência cardíaca de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; #p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). 61 5.2. Avaliação da função cardíaca em ratos transgêncios TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração. Com o objetivo de reduzir a possibilidade de alterações não-específicas devido a introdução do transgene no genoma do rato, foram utilizados ratos heterozigotos. Para confirmar a superexpressão da Ang-(1-7) nos corações destes ratos a concentração deste peptídeo foi medida pela técnica de radioimunoensaio. Os corações dos ratos transgênicos apresentaram maior concentração de Ang-(1-7) comparado aos de seus controles (17,1 ± 2,1 vs 3,9 ± 1,4 pg/mg de proteína nos ratos SD)(Figura 7 A). No entanto, não foram encontradas diferenças significativas nos níveis plasmáticos de Ang-(1-7) (66,5 ± A pg/mg de proteína 23,2 vs 41,9 ± 11,1 pg/ml nos ratos SD) (Figura 7 B). 25 20 * 15 10 5 0 SD, n=4 TG, n=4 B pg/mg de proteína 62 150 125 100 75 50 25 0 SD, n=4 TG, n=4 Figura 7. Avaliação dos níveis de Ang-(1-7) nos corações (A) e plasma (B) de ratos SD e TG. * p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). A função cardíaca dos animais TG e SD foi avaliada in vitro através da técnica de Langendorff com pressão constante. Os corações dos animais TG mostraram maior força de contração, representada pela tensão sistólica, comparado ao seu controle SD em condições basais (23,54 ± 0,96 vs 19,28 ± 2,45 g nos animais SD no final do período basal) (Figura 8 A). No entanto, a tensão diastólica não foi diferente entre os grupos (Figura 8 B). B Tensão sistólica (g) A 30 Tensão diastólica (g) 63 1.0 25 20 * 15 10 5 0 SD, n=5 TG, n=7 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 SD, n=5 TG, n=7 Figura 8. Avaliação da tensão sistólica (A) e diastólica (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). 64 De forma semelhante, outros índices de contratilidade e relaxamento também foram analisados e apresentaram-se maiores nos animais transgênicos: +dT/dt (390,8 ± 2,1 vs 323,4 ± 4,4 g/s nos ratos SD, p<0.05) e –dT/dt (418,8 ± 9,25 vs 356,2 ± 4,78 g/s nos ratos SD, p<0.05) (Figura 9 A e B). 500 +dT/dt (g/s) A 400 * 300 200 SD, n=5 TG, n=7 100 0 500 -dT/dt (g/s) B 400 * 300 200 100 0 SD, n=5 TG, n=7 Figura 9. Avaliação da +dT/dt (A) e –dT/dt (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. *p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste tstudent). 65 Os animais que superexpressam Ang-(1-7) nos corações apresentaram pequena, porém significativa diminuição da freqüência cardíaca, quando comparado ao seu grupo controle (211,0 ± 3,76 vs 240 ± 4,13 bpm nos coracões SD, p<0,05) (Figura 10). Sabendo-se que alterações na frequência cardíaca pedem levar a alterações na tensão sistólica e consequentemente no trabalho cardíaco, nós calculamos o produto da tensão sistólica com a frequência cardíaca e, como mostrado na figura 10 B, o trabalho cardíaco dos ratos transgênicos foi significativamente maior que dos ratos SD, descartando assim, a possibilidade da força de contração elevada nos animais transgênicos ser decorrente da frequência cardíaca diminuída. B TS x FC (g/bpm) A Frequência Cardíaca (bpm) 66 250 * 200 150 100 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 SD, n=5 TG, n=7 50 0 * SD, n=5 TG, n=7 Figura 10. Avaliação da freqüência cardíaca (A) e do trabalho cardíaco (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student), TS, tensão sistólica, FC, frequência cardíaca. 67 5.3. Avaliação da incidência de arritmias de reperfusão em corações isolados de ratos que superexpressam Ang-(1-7) no coração. Quando as arritmias de reperfusão foram avaliadas, os animais TG apresentaram menor duração nas fibrilações e/ou taquicardias ventriculares (Figura 11 A). Além disso, também foi observada menor incidência de arritmias B 12.5 * 10.0 Aritmias Irreversíveis (%) A ISA (Unidades arbitrárias) irreversíveis, ou seja, com durações de 30 minutos (Figura 11 B). 7.5 5.0 2.5 SD, n=4 TG, n=6 0.0 100 4/4 75 50 2/6 25 0 SD, n=4 TG, n=6 Figura 11. Avaliação do índice de severidade de arritmias (ISA) (A) e incidências das arritmias de reperfusão irreversíveis (B) em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 submetidos a oclusão da coronária descendente esquerda. Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. * p<0.05 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). 68 5.4. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais com deleção genética do receptor Mas. A avaliação morfométrica dos cardiomiócitos do ventrículo esquerdo dos animais KO-Mas não mostrou diferença significativa na área de secção cruzada (mm2) comparado aos cardiomiócitos dos animais WT quando estes animais foram tratados com veículo. O tratamento com isoproterenol, por sua vez, induziu significativo aumento na área de secção cruzada (hipertrofia) nos dois grupos de animais, WT e KO-Mas. No entanto, este tratamento induziu uma resposta hipertrófica mais acentuada nos cardiomiócitos dos camundongos KO-Mas quando comparados aos animais WT submetidos ao mesmo tratamento (19,3 ± 0,50 vs 17,8 ± 0,43 nos animais WT, p<0.05) (Figura 12). Área de secção transversa (mm2) * 20 * * 18 Salina, n= 4 Isoproterenol, n=4 16 14 12 10 0.0 WT KO Figura 12. Efeito da deleção genética do receptor Mas na resposta hipertrófica induzida por isoproterenol. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls). 69 A técnica de imunofluorescência foi utilizada para analisar a expressão de proteínas específicas da MEC (colágenos I e III e fibronectina) no tecido cardíaco de animais KO-Mas e WT em resposta ao isoproterenol. Confirmando resultados prévios (Gava, 2006; Santos et al., 2006), as marcações para os colágenos I e III e fribronectina em tecidos cardíacos de camundongos KO-Mas foi significativamente maior do que as observadas em tecidos de corações WT. A expressão do colágeno III ocorreu na MEC do tecido ao redor dos cardiomiócitos e dos vasos sanguíneos. O tratamento com isoproterenol não foi capaz de aumentar significativamente a síntese de colágeno III nos animais controle. No entanto, os animais KO-Mas que já apresentavam maior marcação para colágeno III em condições basais, apresentaram significante aumento na expressão desta proteína quando submetidos ao tratamento com isoproterenol (Figura 13 A e B). Este mesmo tratamento induziu significativo aumento de colágeno I em ambos os grupos, porém levemente maior nos corações de camundongos KO-Mas (25,4 %) comparado aos corações de animais WT (20,6 %) (Figura 14 A e B). O tratamento com isoproterenol não induziu alterações significativas na deposição de fibronectina em nenhum dos grupos de animais comparados ao tratamento com salina. Apenas um pequeno aumento (11,2 %) foi observado nos animais KO-Mas tratados com isoproterenol comparado ao tratamento com salina (Figura 15 A e 15 B). 70 A WT Isoproterenol Salina KO 50 µm Intensidade Relativa de Fluorescência (U.A.) B * * 150 * 125 100 75 50 25 Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 0 WT KO Figura 13. (A) Imunolocalização de colágeno III (amarelo) em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação do colágeno III nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 71 A KO Isoproterenol Salina WT 50 µm Intensidade Relativa de Fluorescência (U.A.) B * * * 150 * 125 100 75 50 Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 25 0 WT KO Figura 14. (A) Imunolocalização de colágeno I (amarelo) em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação do colágeno I nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 72 A A KO Isoproterenol Salina WT 50 µm Intensidade Relativa de Fluorescência (U.A.) B * 75 * 50 25 Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 0 WT Mas KO Figura 15. (A) Imunolocalização de fibronectina (amarelo) em ventrículo esquerdo de camundongos KO-Mas e WT tratados com isoproterenol ou salina. (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de camundongos WT e KO-Mas tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pósteste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 73 5.5. Avaliação da resposta fibrótica e hipertrófica induzida por isoproterenol em animais TG(hA1-7)L7301 que superexpressam Angiotensina-(1-7) no coração. O efeito cardioprotetor da superexpressão de Ang-(1-7) no coração foi avaliado em animais submetidos a tratamentos diários de isoproterenol. Os cardiomiócitos dos animais TG que superexpressam Ang-(1-7) no coração não apresentaram diferenças morfométricas significativas em relação ao seu controle. O tratamento com isoproterenol induziu uma hipertrofia similar nos dois grupos de Área de secção transversa (mm2) animais, SD e TG (18,35 ± 0,30 vs 18,31 ± 0,33 nos animais SD) (Figura 16). 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 * * Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 SD TG Figura 16. Avaliação da resposta hipertrófica em ratos TG(hA1-7)L7301 induzida por isoproterenol. *p<0,01. Os valores estão expressos como média ± EPM (Oneway Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls). 74 Utiliazando-se a técnica de imunofluorescência, nós não observamos diferenças significativas na deposição das proteínas de matriz avaliadas entre os animais tratados com salina. No entanto, a resposta fibrótica ao tratametno com isoproterenol foi diferente entre os animais. Após sete dias de tratamento, pôdese observar que o isoproterenol induziu aumento de colágeno III nos dois grupos de animais, porém de forma significativamente menor nos animais que superexpressam Ang-(1-7) no coração (67,47 ± 2,20 vs 87,90 ± 3,09 unidade arbitrárias nos ratos SD) (Figura 17 A e B). Este efeito protetor também foi observado quando os cortes foram incubados com anticorpo para fibronectina (97,84 ± 2,88 vs 142,7 ± 3,74 unidade arbitrárias nos ratos SD) (Figura 18 A e B). Entretanto, não foi observada diferença significativa na marcação para o colágeno do tipo I entre os ratos tratados com isoproterenol (104,0 ± 2,64 vs 101,6 ± 2,00 unidade arbitrárias nos ratos SD) (Figura 19 A e B). 75 TG SD Isoproterenol Salina A 50 µm Intensidade Relativa de Fluorescência (A.U.) B * 125 100 * * 75 50 25 Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 0 SD TG Figura 17. (A) Imunolocalização de colágeno III (amarelo) em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos celulares foram marcados com iodeto de propídeo (azul). A imagem inserida no canto superior direito representa o nível de marcação obtido quando o anticorpo primário não foi usado na incubação (controle negativo). (B) Quantificação da marcação de colágeno III nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 76 A TG Isoproterenol Salina SD 50 µm Intensidade Relativa de Fluorescência (A.U.) B * 200 175 150 * * 125 100 75 50 Salina, n=4 Isoproterenol, n=4 25 0 SD TG Figura 18. (A) Imunolocalização de fibronectina em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos celulares foram marcados com iodeto de propídeo (azul). (B) Quantificação da marcação de fibronectina nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 77 SD TG Isoproterenol Salina A Intensidade Relativa de Fluorescência (A.U.) B 125 50 µm * * 100 75 50 25 Salina, n=4 Isoprotererenol, n=4 0 SD TG Figura 19. (A) Imunolocalização de colágeno I em ventrículo esquerdo de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. Os núcleos celulares foram marcados com iodeto de propídeo (azul). (B) Quantificação da marcação de colágeno I nos ventrículos esquerdos de ratos TG(hA1-7)L7301 e SD tratados com isoproterenol ou salina. *p<0,05. Os valores estão expressos como média ± EPM (One-way Anova seguido pelo pós-teste de Newman-Keuls); U.A., unidades arbitrárias. 78 5.6. Avaliação da participação do receptor Mas e da Angiotensina-(1-7) nos vasos coronarianos em condições basais e pós-isquêmicas. Os corações isolados dos camundongos KO-Mas apresentaram maior pressão de perfusão coronariana (172,1 ± 11,43 vs 132,4 ± 10,97 mmHg, p<0,05) no período basal (pré-isquemia) comparado aos animais controles, o que representa um estado de maior constrição coronariana (Figura 20 A). Esta diferença foi maior com 5 min de reperfusão (138,5 ± 12,01 vs 73,39 ± 8,11 mmHg nos animais WT) alcançando valores similares ao período basal no final da reperfusão. Isto demonstra que os animais KO-Mas apresentam mecanismos vasodilatadores, que podem estar envolvidos na recuperação pós-isquêmica, prejudicados em relação aos animais WT. Isto foi confirmado quando o t1/2 foi analisado, ou seja, o tempo gasto para atingir 50 % da pressão de perfusão máxima após o início da reperfusão (t1/2: 0,76 ± 0,05 vs 4,17 ± 0,42 min nos animais controles) (Figura 20 B). Este resultado foi similar quando os corações dos animais WT foram perfundidos com K-R contendo A-779, os quais apresentaram um significante aumento na pressão de perfusão nos períodos basal e pós-isquêmico (Figura 20 A). 79 Pressão de Perfusão (mmHg) A 250 *# 200 *# 150 100 WT, n=8 KO, n=5 WT + A-779, n=3 50 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Basal B 200 KO Reperfusão Oclusão Tempo(min) WT Variação da Pressão de Perfusão (mmHg) 175 150 125 100 75 WT, n=8 KO, n=5 WT + A-779, n=3 50 25 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20.0 22.5 25.0 Tempo após inicío da reperfusão (Min) Figura 20. (A) Efeito da deleção genética do receptor Mas e do seu antagonista A-779 na pressão de perfusão coronariana de corações isolados de camundongos antes, durante e após isquemia. (B) Curva da pressão de perfusão no período da reperfusão utilizada para análise do t1/2. As linhas pontilhadas representam os valores do t1/2 dos animais indicados. Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05, WT vs KO-Mas; # p<0,05, WT vs WT perfundidos com K-R contendo A-779. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). 80 Visto que o receptor Mas e outros receptores angiotensinérgicos (AT1 e AT2) apresentam importante envolvimento na modulação da resistência coronariana (Zhang et al., 2003; Merkus et al., 2006; van Esch et al., 2006), foi avaliada e comparada a participação destes receptores na resposta vasodilatadora da acetilcolina, uma potente droga cujo efeito vasodilatador é dependente do endotélio e amplamente utilizada para avaliar a função endotelial. Surpreendentemente, o efeito vasodilatador da acetilcolina foi completamente ausente nos animais KO-Mas (Figura 21 A). Por outro lado, a vasodilatação induzida pela acetilcolina foi maior nos corações dos animais KO-AT2 (Figura 21 B) e similar nos animais KO-AT1 (Figura 21 C) comparado aos respectivos grupos controles. Estes resultados mostram um papel fundamental do receptor Mas na modulação da função vascular coronariana em camundongos. Variação da Pressão de Perfusão (mmHg) A Ach 10 5 * 0 -5 -10 -15 WT, n=4 -20 KO Mas, n=4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tempo (min) 81 Variação da Pressão de Perfusão (mmHg) B Ach 10 WT, n=4 KO AT2, n=4 5 0 -5 -10 * -15 -20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tempo (min) Variação da Pressão de Perfusão (mmHg) C Ach 10 5 WT, n=4 0 KO AT1, n=4 -5 -10 -15 -20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Tempo (min) Figura 21. Avaliação do efeito vasodilatador da acetilcolina 10-7 mol/L em corações isolados de camundongos KO-Mas (A), KO-AT2 (B) e KO-AT1 (C). Os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. *p<0,05 comparado ao grupo controle. Os valores estão expressos como média ± EPM (Two-way Anova seguido pelo pós-teste de Bonferroni). 82 Os corações dos ratos TG apresentaram, em condições basais, menor fluxo coronariano comparado aos animais controle (9,36 ± 0,15 vs 15,20 ± 0,30 nos ratos SD, p<0,05) (Figura 22 A). Este efeito coronariano pode ser pelo menos em parte, resultante da maior força de contração. No entanto, quando estes animais foram submetidos à isquemia do ventrículo esquerdo e subsequentemente reperfundidos, os corações dos animais TG apresentaram um aumento significativo do fluxo coronariano em relação ao seu próprio período basal e também comparado ao grupo controle no período de reperfusão (Figura 22 B). 83 Fluxo Coronariano (mL/min) A 20 15 10 * SD, n=5 TG, n=7 5 0 Fluxo Coronariano (%) B 200 175 150 125 100 75 50 25 0 * SD, n=7 TG, n=4 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 Reperfusão Oclusão Tempo (min) Figura 22. Avaliação do fluxo coronariano em corações isolados de ratos TG(hA1-7)L7301 em condições basais (A) e durante isquemia/reperfusão (B). Os corações foram analisados pela técnica de Langendorff. O valor de cada animal foi obtido pela média dos valores coletados em intervalos de 5 minutos durante 20 minutos do período basal. * p<0.001 comparado com os corações de ratos SD. Os valores estão expressos como média ± EPM (Teste t-student). 84 6. DISCUSSÃO Neste estudo foi observada a participação fundamental da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no controle da função cardíaca. Além disso, o eixo Ang-(17)/Mas se mostrou um componente essencial na cardioproteção da isquemia/Reperfusão e no remodelamento cardíaco induzido por isoproterenol. Para este estudo, nós utilizamos dois tipos de animais geneticamente modificados, um que apresentava perda da função do eixo Ang-(1-7)/Mas, os camundongos knockout para o receptor Mas, e outro com ganho da função deste eixo, os rato transgênicos TG(hA1-7)L7301 que superexpressam a Ang-(1-7) no tecido cardíaco. Estes ratos possuem uma proteína de fusão produtora de Ang-(17) especificamente no coração (Ferreira, 2004). A superexpressão deste peptídeo no tecido cardíaco foi confirmada pela técnica de Radioimunoensaio, onde os níveis de Ang-(1-7) se mostraram 4 vezes maior que os encontrados nos animais controles. Nós confirmamos também que este aumento foi limitado ao tecido cardíaco, uma vez que os níveis plasmáticos de Ang-(1-7) não foram diferentes entre os grupos. Nos animais KO-Mas, a função cardíaca representada pela tensão sistólica, +dT/dt e –dT/dt, foi significativamente menor quando comparada com seu controle. A participação do receptor Mas na função cardíaca foi confirmada quando os animais WT foram perfundidos com o antagonista A-779, pois a presença deste na solução de perfusão causou uma significativa diminuição dos parâmetros relacionados à contratilidade cardíaca, tornando os valores similares aos encontrados nos animais KO-Mas. A deterioração da função cardíaca nos animais KO-Mas foi comprovada posteriormente in vivo, quando este animais 85 foram submetidos à ecocardiografia (Santos et al., 2006). Nesta avaliação foi revelada uma diminuição da fração de encurtamento, da espessura da parede posterior e septo interventricular na sístole e diástole e da dimensão do ventrículo esquerdo no final da diástole nos animais KO-Mas. Por outro lado, estes animais apresentaram maior dimensão do ventrículo esquerdo no final da sístole e uma marcada disfunção ventricular global mostrada pelo maior índice de performance miocardial. Por outro lado, as alterações na função cardíaca encontradas nos ratos TG(hA1-7)L7301 foram opostas àquelas encontradas nos camundongos KO-Mas. Estes ratos apresentaram melhor função cardíaca, observada pela maior tensão sistólica, +dT/dt e –dT/dt. Prévios trabalhos sugeriram que a Ang-(1-7) pode ser uma moduladora de canais iônicos (Gironacci et al., 1994; Bevilaqua et al., 2002; Gironacci et al., 2004). A Ang-(1-7) potencializa a liberação de [3H]Norepinefrina gerada pela estimulação nervosa em átrio isolado (Gironacci et al., 1994). Na junção neuromuscular, a Ang-(1-7) aumentou a liberação, de forma dose-dependente, de acetilcolina (Bevilaqua et al., 2002). Desta forma, tendo os canais de cálcio um papel classicamente conhecido na contratilidade cardíaca (Langer, 1977), Santos e colaboradores (2006) avaliaram o perfil da corrente de cálcio nos cardiomiócitos dos animais KO-mas e observaram que a interação Ang-(1-7)-Mas exerce um papel modulatório importante na corrente de cálcio destas células. Neste estudo observou-se que o tempo para atingir o pico da corrente de Cálcio do tipo L foi mais lento nas células dos camundongos KO-Mas, o que poderia prejudicar o processo de reenchimento do retículo sarcoplasmático, culminando em menor quantidade de cálcio liberada durante a excitação. Outra causa para a diminuição 86 da função cardíaca nos animais KO-mas pode ser explicada pelo perfil fibrótico apresentado nos corações destes animais, representado pelo aumento na expressão dos colágeno I e III e fibronectina. Apesar do efeito anti-hipertensivo da Ang-(1-7), as alterações nas proteínas de matriz extracelular foram independentes da pressão arterial, pois os animais KO-Mas não apresentam alterações significativas da pressão arterial e, além disso, o perfil fibrótico também está presente nos animais neonatos (Santos et al., 2006). O aumento de colágenos da MEC no coração, como relatado em doenças cardíacas hipertensivas, cardiomiopatia isquêmica e cardiomiopatia hipertrófica, levam ao acúmulo de tecido fibroso e contribui para um comprometimento progressivo da função cardíaca (Kawano et al., 2000; Schnee and Hsueh, 2000; Pathak et al., 2001; Gonzalez et al., 2002; Lijnen and Petrov, 2003). O colágeno fibrilar forma uma ligação entre os elementos contráteis de cardiomiócitos adjacentes. No entanto, quando há um acúmulo anormal de fibras colágenas, levando à fibrose, a rigidez miocardial aumenta, comprometendo deste modo, o enchimento diastólico. O acúmulo contínuo aumenta ainda mais esta rigidez e prejudica o comportamento contrátil e a atividade elétrica (Diez et al., 2001). Deste modo, o aumento destes colágenos fibrilares pode explicar, pelo ao menos em parte, a diminuição da contratilidade encontrada nos animais KO-Mas. Entretanto, a participação direta do receptor Mas na contratilidade cardíaca deve ser considerada, pois é improvável que a perfusão aguda do antagonista deste receptor nos corações isolados dos animais WT promova alguma alteração estrutural suficiente para induzir as alterações encontradas na função cardíaca. Deve ser ressaltado também, que a alteração da frequência cardíaca (discutida abaixo) causada pelo bloqueio do eixo Ang-(1-7)/Mas dificilmente pode ser responsável pelas 87 mudanças observadas na contratilidade cardíaca, visto que, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos no período pós-isquêmico. Alguns resultados encontrados pelo nosso grupo (dados não publicados) mostram a participação do cálcio no aumento da contratilidade cardíaca dos ratos transgênicos. Este aumento na contratilidade causado pela alta concentração tecidual de Ang-(1-7) nos corações, também pode ser devido a um possível aumento na síntese de óxido nítrico. Estudos mostraram que o óxido nítrico é responsável por diversos efeitos mediados pela Ang-(1-7) (Castro et al., 2005; Faria-Silva et al., 2005; Rajendran et al., 2005; Sampaio et al., 2007; Fraga-Silva et al., 2008). O óxido nítrico aumenta a produção de GMP cíclico, que quando presente em baixas concentrações inibe a atividade da fosfodiesterase III, prevenindo assim a hidrólise do AMP cíclico e permitindo seu acúmulo na célula (Kojda et al., 1996). O acúmulo do AMP cíclico ativa a proteína cinase A, responsável pela abertura dos canais de cálcio dependente de voltagem e dos receptores de rianodina, levando ao aumento da concentração intracelular de cálcio e maior contratilidade (Marx et al., 2000). Outro achado relacionado à função cardíaca foi a menor frequência cardíaca encontrada nos animais KO-Mas e o efeito bradicárdico do antagonista A-779. No entanto, curiosamente, os ratos transgênicos também apresentaram menor frequência cardíaca que seus controles. O efeito do eixo Ang-(1-7)/Mas na frequência cardíaca ainda é controverso. Santos e colaboradores (2004) mostraram que ratos transgênicos com níveis aumentados de Ang-(1-7) no plasma apresentaram maior frequência cardíaca in vivo e ex vivo. Ao contrário, a Ang-(1-7) infundida durante 7 dias induziu um pequeno, porém significativo efeito bradicárdico em ratos Wistar (Braga et al., 2002). Uma hipótese plausível para a 88 frequência cardíaca diminuída nos animais transgênicos do nosso estudo seria possíveis alterações nas correntes iônicas do nodo-sinoatrial e/ou átrioventricular. Diferentemente dos achados encontrados por Santos e colaboradores (2004), onde os ratos transgênicos da linhagem TGR(A1-7)3292 apresentaram maior frequência cardíaca in vivo, não foram observadas diferenças significativas na frequência cardíaca dos camundongos KO-Mas (Santos et al., 2006) ou dos ratos transgênicos TG(hA1-7)L7301 (dados não publicados), reforçando a hipótese de uma modulação do receptor Mas na atividade do nodo sino-atrial e consequentemente na modulação da frequência cardíaca intrínseca. O conteúdo aumentado de proteínas da matriz extracelular também pode ser um fator relacionado à menor frequência cardíaca intrínseca nos camundongos KO-Mas. As espécies de animais, formas de administração e concentrações utilizadas de Ang-(1-7) podem, ao menos em parte, explicar estas observações divergentes da frequência cardíaca nos estudos realizados até a presente data. Nossos dados também mostram que o eixo Ang-(1-7)/Mas está envolvido na manutenção ou preservação da função cardíaca pós-isquêmica. A menor tensão sistólica, +dT/dt e –dT/dt observada nos animais KO-Mas e WT perfundidos com A-779 no período basal permaneceram constantes no período de reperfusão, ou seja, não foram observadas alterações mecânicas induzidas pela isquemia/reperfusão nos corações dos camundongos KO-Mas ou WT perfundidos com A-779. Isto mostra a relevante participação do receptor Mas na função cardíaca, pois a função contrátil no período basal já está diminuída nestes animais, o que minimizou uma maior perda proveniente do processo isquêmico, ou seja, o bloqueio do receptor Mas promove um efeito devastador na função contrátil, levando a um fenótipo onde as alterações induzidas pela 89 isquemia/reperfusão se tornam dificilmente detectáveis. Nossos achados estão de acordo com diversos trabalhos que mostram os efeitos protetores da Ang-(1-7) no coração (Brosnihan et al., 1996; Brosnihan et al., 1998; Ferreira et al., 2001; Ferreira et al., 2002; Loot et al., 2002; Averill et al., 2003; Zisman et al., 2003; Santos et al., 2004). A Ang-(1-7), em concentrações picomolares, melhorou a função cardíaca pós-isquêmica em corações isolados de ratos (Ferreira et al., 2002). Este efeito foi completamente bloqueado pelo antagonista do receptor Mas, A-779, sugerindo que as ações da Ang-(1-7) no coração foram mediadas pelo seu receptor específico. Além disso, este estudo também mostrou a participação das prostaglandinas nos efeitos benéficos da Ang-(1-7), visto que a indometacina também bloqueou o efeito anti-arritmogênico e a preservação da função sistólica induzida pela Ang-(1-7). Em outro estudo, foi observado que a infusão crônica de Ang-(1-7) preservou a função cardíaca e função endotelial sistêmica, reduziu a queda da pressão arterial e fluxo coronariano em ratos submetidos à oclusão da artéria coronária esquerda (Loot et al., 2002). Um possível mecanismo responsável pelos efeitos benéficos da Ang-(1-7) na função cardíaca seria a modulação dos níveis cardíacos de Ang II (Mendes et al., 2005), pois sabe-se que indivíduos portadores de insuficiência cardíaca apresentam níveis cardíacos aumentados deste peptídeo (Serneri et al., 2001). No entanto, os resultados obtidos em nosso estudo utilizando animais com deleção genética para o receptor Mas mostra uma relevante participação direta deste receptor na modulação da função cardíaca. Alguns estudos têm sugerido que a recuperação do processo de isquemia/reperfusão esteja relacionada ao fluxo coronariano (Collard and Gelman, 2001). Desta forma, as alterações encontradas na pressão de perfusão (discutida 90 abaixo) também poderia ser uma possível causa das demais alterações encontradas nos corações dos animais KO-Mas. Entretanto, não foram observadas diferenças significativas na pressão de perfusão entre o período basal e reperfusão de cada grupo. Além disso, estudos prévios mostraram que a Ang(1-7) não alterou o fluxo coronariano em corações isolados de ratos após reperfusão (Neves et al., 1997; Ferreira et al., 2002). Estes dados sugerem que os efeitos da Ang-(1-7) na função cardíaca após isquemia/reperfusão são independentes de alterações no fluxo coronariano e fortalece achados anteriores (Ferreira et al., 2001; Ferreira et al., 2002; Loot et al., 2002; De Mello et al., 2007) que mostram que a Ang-(1-7) preserva a função cardíaca pós-isquêmica por mecanismos diretos envolvendo seu receptor Mas. O resultado encontrado na tensão diastólica dos corações de camundongos também é uma importante evidência de que o receptor Mas está envolvido na modulação da homeostasia do cálcio no coração, pois foi observado em nossos experimentos que o aumento da tensão diastólica nos animais WT foi inexistente nos animais KO-Mas e WT perfundidos com A-779. Estes achados estão de acordo com diferentes estudos que demonstram que as injúrias de isquemia/reperfusão induzem significante aumento do conteúdo intracelular de cálcio (Daly et al., 1984; Manning and Hearse, 1984; Fukuda et al., 2001). Narita e colaboradores (1983), utilizando corações isolados de Hamisters, observaram que o aumento da tensão diastólica pós-isquêmica foi atenuado pela redução na concentração de cálcio na solução de perfusão e pelo diltiazen, uma antagonista dos canais lentos de cálcio (tipo L) (Narita et al., 1983). O retículo sarcoplasmático e o sarcolema dos cardiomiócitos são os principais componentes responsáveis pela manutenção da homeostasia do cálcio no coração (MacLennan et al., 2002). 91 A despolarização do potencial de ação ativa os canais de cálcio do tipo L resultando no influxo de cálcio e consequentemente no aumento da concentração intracelular de cálcio estimulando a liberação deste íon do retículo sarcoplasmático via receptores de rianodina (Chamberlain et al., 1984). Durante o processo de relaxamento das células cardíacas, grande parte do cálcio liberado é sequestrado de volta para o retículo através da SERCA e parte é eliminado da célula via trocador Na+/Ca2+. Estudos têm mostrado que o processo de isquemia/reperfusão altera o funcionamento normal do retículo sarcoplasmático, diminuindo a ativação da SERCA (Osada et al., 1998) e resultando na sobrecarga intracelular de cálcio. Assim, alterações na fosforilação de proteínas reguladoras da ativação da SERCA ou do trocador Na+/Ca2+ podem estar envolvidas nas alterações encontradas na tensão diastólica dos animais WT. Porém, experimentos adicionais são necessários para explicar os resultados encontrados na tensão diastólica dos corações dos animais KO e WT perfundidos com A-779, bem como a participação de outros canais iônicos nas ações cardíacas da Ang(1-7). O papel cardioprotetor do eixo Ang-(1-7)/Mas também foi claramente observado nas arritmias de reperfusão induzidas pela oclusão e liberação da artéria descendente esquerda nos corações isolados dos ratos transgênicos. Estes corações apresentaram menor duração das arritmias de reperfusão e menor incidência das arritmias irreversíveis. Nossos resultados confirmam os achados anteriores que mostram a ação anti-arritmogênica da Ang-(1-7) (Ferreira et al., 2001; Santos et al., 2004). As causas das arritmias de reperfusão são multifatoriais. Uma destas causas pode ser resultado de uma súbita alteração nas concentrações iônicas na região isquêmica reperfundida (Yamazaki et al., 1986; 92 Ibuki et al., 1993). Alguns estudos também mostram que a reperfusão gera uma seqüência ordenada de eventos eletrofisiológicos que podem constituir um mecanismo importante das arritmias de reperfusão (Ferrier et al., 1985). Ferreira e colaboradores (2001) demonstraram que o efeito anti-arritmogênico da Ang-(1-7) foi completamente bloqueado pelo pré-tratamento com indometacina. Realmente, as prostaglandinas têm importante participação benéfica nas arritmias de reperfusão por estimular os receptores EP3, induzindo a ativação de correntes repolarizantes da membrana (Hohlfeld et al., 2000). Recentemente, foi demonstrado que a Ang-(1-7) promove hiperpolarização e re-estabelecimento da propagação do impulso em fibras de corações isquêmicos de ratos (De Mello, 2004). Posteriormente este mesmo grupo mostrou que a Ang-(1-7) também é capaz de induzir hiperpolarização, aumento da velocidade de condução e diminuição da duração do potencial de ação em cardiomiócitos de hamsters (De Mello et al., 2007). Em ambos os trabalhos, a ativação da bomba de sódio foi responsável pelos resultados encontrados, sugerindo que este pode ser um forte mecanismo envolvido no efeito anti-arritmogênico da Ang-(1-7). No entanto, sabendo-se que as causas das arritmias de reperfusão são multifatoriais, não se deve descartar outras possibilidades, como por exemplo, o efeito anti-oxidativo da Ang-(1-7) (Sampaio et al., 2007). Em adição a cardioproteção do eixo Ang-(1-7)/Mas nos efeitos deletérios da isquemia/reperfusão, nossos dados também mostraram que este eixo é um modulador crítico do remodelamento cardíaco. A hipertrofia dos cardiomiócitos induzida pelo tratamento diário com o isoproterenol, um agonista β-adrenérgico, foi significativamente maior nos animais KO-Mas. Além disso, a deposição de colágeno III também foi superior nos animais que não apresentavam o receptor 93 Mas. Por outro lado, a superexpressão da Ang-(1-7) nos corações dos ratos transgênicos atenuou o aumento da expressão de colágeno III e fibronectina induzido pelo isoproterenol, porém falhou em prevenir o desenvolvimento do processo hipertrófico. Diferentemente dos trabalhos anteriores (Santos et al., 2004; Santos and Ferreira, 2007), este estudo utilizou uma dose maior de isoproterenol para induzir hipertrofia cardíaca e possivelmente a quantidade de Ang-(1-7) presente no tecido cardíaco não foi suficiente para bloquear o efeito hipertrófico do isoproterenol. Em adição, o aumento plasmático de Ang-(1-7) nos animais estudados por Santos e colaboradores (2004) poderia agir em outros órgãos, contribuindo indiretamente para os efeitos anti-hipertróficos, sendo esta possibilidade improvável no modelo utilizado no presente estudo, uma vez que o aumento dos níveis de Ang-(1-7) foi limitado ao coração. No entanto, existem evidências de que os processos fibróticos e hipertróficos podem ser independentes, como mostrado por Lekgabe e colaboradores em 2005 (Lekgabe et al., 2005). A participação da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas na proteção do remodelamento cardíaco tem sido mostrado em diferentes estudos, incluindo seus efeitos anti-fibróticos (Iwata et al., 2005; Grobe et al., 2006; Santos et al., 2006; Grobe et al., 2007) e anti-hipertróficos (Loot et al., 2002; Santos et al., 2004; Iwata et al., 2005; Tallant et al., 2005). A infusão crônica de Ang-(1-7) preveniu significativamente a fibrose cardíaca em dois modelos diferentes de hipertensão, um induzido pela infusão crônica de Ang II (Grobe et al., 2007) e outro em modelo de DOCA-salt (Grobe et al., 2006). No entanto o feito anti-hipertrófico da Ang-(17) foi observado somente nos animais tratados com Ang II, sugerindo mais uma vez uma diferença no mecanismo protetor da Ang-(1-7) entre o desenvolvimento 94 de processos fibróticos e hipertróficos. Em ambos os modelos, a Ang-(1-7) promoveu seus efeitos independentemente de alterações da pressão arterial, ou seja, a dose administrada de Ang-(1-7) não inibiu o aumento da pressão arterial nos ratos tratados com DOCA-salt ou Ang II. Além da Ang-(1-7), o agonista não peptídico do receptor Mas, AVE 0991, também foi eficaz em prevenir a fibrose e a hipertrofia cardíaca induzida por isoproterenol, efeito que também foi independente de alterações na pressão arterial (Ferreira et al., 2007). Existem diversos mecanismos pelos quais a Ang-(1-7) pode agir para diminuir a deposição de proteínas da matriz extracelular. Uma primeira hipótese seria a diminuição da pressão arterial, o que diminuiria uma série de eventos sinalizadores pró-fibróticos dependentes de sobrecarga hemodinâmica. No entanto, como discutido acima, vários trabalhos (Grobe et al., 2006; Santos et al., 2006; Grobe et al., 2007) se opõem a esta possibilidade. Segundo, a Ang-(1-7) poderia inibir diretamente a secreção de colágeno ou ativação de fibroblastos ou sua diferenciação em miofibroblastos, uma vez que estes efeitos podem ser encontrados sob estímulo da Ang II (Samuel et al., 2004; Iwata et al., 2005; Olson et al., 2008; Tsai et al., 2008) e diversos trabalhos têm mostrado que a Ang-(1-7) apresenta, na maioria das vezes, efeitos opostos aos da Ang II. Terceiro, a Ang(1-7) pode estimular a degradação de colágenos ativando metaloproteinases de matriz ou inibindo os inibidores teciduais de metaloproteinases de matriz. Esta hipótese está de acordo com os resultados encontrados por Pan e colaboradores (2008), onde foi observado que a Ang-(1-7) modulou a expressão de metaloproteinases e inibidores teciduais de metaloproteinases, apesar deste efeito ter sido dependente da célula utilizada (Pan et al., 2008). Finalmente, a Ang-(1-7) poderia estar inibindo as ações de vários fatores pró-fibróticos, tais 95 como Ang II, TGF-β e ou endotelina-1. Como discutido anteriormente, a infusão crônica de Ang-(1-7) reduz os níveis cardíacos de Ang II (Mendes et al., 2005), o que colabora com os dados encontrados por Zhang e colaboradores (2007), mostrando que o receptor AT1 exerce um papel crucial no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca induzida pela estimulação β-adrenérgica (Zhang et al., 2007). Recentemente, foi mostrado que a Ang-(1-7) inibi a síntese de colágeno, mensurada pela incorporação de [3H]prolina, e diminuiu a expressão de RNA mensageiro de diferentes fatores de crescimento, tais como TGF-β e endotelina-1, além de inibir o crescimento de cardiomiócito estimulado com Ang II (Iwata et al., 2005). Embora nós não tenhamos realizado experimentos para elucidar os mecanismos pelos quais a Ang-(1-7) promove seus efeitos anti-fibróticos e antihipertróficos no coração, a interação com o receptor Mas é evidente devido aos resultados encontrados nos corações dos animais KO-Mas. Tallant e colaboradores (2005) também demonstraram que a transfecção de miócitos cardíacos com oligonucleotídeos antisense para o receptor Mas bloqueou a ação inibitória da Ang-(1-7) na fosforilação da cinase ERK1/2 (Tallant et al., 2005), uma importante proteína envolvida no desenvolvimento do processo hipertrófico, o que reforça a hipótese de uma ação protetora direta da Ang-(1-7) no remodelamento cardíaco. É importante ressaltar que a Ang-(1-7) apresenta efeitos seletivos na modulação da síntese e/ou degradação das proteínas de matriz extracelular, como observado previamente por Santos e colaboradores (2006) e confirmado por nossos resultados, pois foi observado em nosso estudo um efeito mais expressivo da Ang-(1-7) e do receptor Mas no controle da deposição de colágeno III, tanto nos camundongos diferentemente do colágeno I. KO-Mas quanto nos ratos transgênicos, 96 O eixo Ang-(1-7)/Mas exerce importantes efeitos no controle da resistência vascular sistêmica (Sampaio et al., 2003; Botelho-Santos et al., 2007; Xu et al., 2008). A alta pressão de perfusão observada nos corações isolados dos animais KO-Mas e com a presença de A-779 nos corações dos animais WT está de acordo com prévios trabalhos mostrando a atividade vasodilatadora da Ang-(1-7) no leito coronariano (Porsti et al., 1994; Brosnihan et al., 1996; Castro et al., 2005). Brosnihan e colaboradores (1996) mostraram que este peptídeo promove vasodilatação em artérias coronarianas de cães. Este efeito foi completamente bloqueado pelo antagonista não seletivo de angiotensina [Sar1Thr8]-Ang II, mas não pelos antagonistas específicos dos receptores AT1 ou AT2, sugerindo que a vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) nas artérias coronarianas é mediada por um receptor diferente de AT1 ou AT2. A pressão de perfusão elevada nos corações dos animais KO-Mas indica que o receptor Mas tem participação importante na vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) no leito coronariano de camundongos. Além disso, o antagonista do receptor Mas A-779 aboliu o efeito potencializador da Ang-(1-7) na resposta vasodilatadora da bradicinina em corações isolados de ratos (Almeida et al., 2000). Este antagonista também bloqueou a vasodilatação induzida pela Ang-(1-7) na presença de losartan em corações isolados de camundongos, efeito que também foi abolido nos corações isolados de camundongos com deleção genética para o receptor Mas (Castro et al., 2005). Na maior parte dos estudos realizados para avaliar o efeito vascular da Ang-(1-7), os inibidores da enzima eNOS foram capazes de bloquear seu efeito vasodilatador, sugerindo que a liberação de óxido nítrico é um importante mecanismo envolvido na resposta vasodilatadora da Ang-(1-7) nas artérias coronarianas. Esta modulação da Ang-(1-7) via receptor Mas na atividade da 97 eNOS foi recentemente confirmada por Sampaio e colaboradores (Sampaio et al., 2007). Nossos resultados também mostraram uma diferença na cinética do aumento da pressão de perfusão no início da reperfusão representada pelo t1/2, sugerindo que o receptor Mas está envolvido no processo de vasodilatação decorrente da hiperemia reativa pós-isquêmica, processo mediado por dois principais metabólitos vasodilatadores, a adenosina e o óxido nítrico (Otomo et al., 1997). Apesar do fluxo coronariano ter sido menor nos corações dos ratos transgênicos em condições basais, o aumento deste fluxo no período de reperfusão comparado ao período basal reforçam a hipótese de uma participação do eixo Ang-(1-7)/Mas nos mecanismos vasodilatadores na recuperação pósisquêmica. O fluxo coronariano menor nos corações dos ratos transgênicos em condições basais pode ser explicada, em parte pela maior tensão sistólica (Kajiya et al., 1989; Hiramatsu et al., 1992; Kajiya et al., 2000). No entanto, outras possibilidades, tal como alterações na expressão de receptores angiotensinérgicos, devem ser investigadas para uma melhor compreensão deste resultado. Uma vez observado o envolvimento do receptor Mas no controle da resistência arterial coronariana, nós também avaliamos a participação deste receptor na resposta vasodilatadora da acetilcolina, um potente vasodilatador dependente do endotélio. Nossos resultados mostraram que a ausência do receptor Mas aboliu a vasodilatação coronariana induzida pela acetilcolina. Estes dados estão de acordo com os resultados mostrados por Faria-Silva e colaboradores (2005), onde a infusão aguda de Ang-(1-7) ou seu análogo AVE 0991 aumentou significativamente o efeito hipotensor da administração intraarterial de acetilcolina em ratos normotensos. Similarmente, a Ang-(1-7) 98 apresentou uma ação potencializadora da vasodilatação induzida pela acetilcolina em artérias mesentérias isoladas de camundongos (Peiro et al., 2007). A participação do receptor Mas e a liberação de óxido nítrico nas ações vasodilatadoras da Ang-(1-7) foi demonstrada mais uma vez quando estes efeitos foram completamente bloqueados pelo pré-tratamento com A-779 e L-NAME (Faria-Silva et al., 2005; Peiro et al., 2007). Outros mecanismos também podem estar envolvidos na modulação dos efeitos da acetilcolina pela Ang-(1-7), pois o relaxamento vascular induzido pela acetilcolina é devido a três diferentes fatores: liberação de óxido nítrico, prostaglandinas e fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (Feletou and Vanhoutte, 2006). Por outro lado a vasodilatação coronariana promovida pela acetilcolina foi preservada nos corações de animais knockout para os receptores AT1 ou AT2, o que mostra um papel essencial do receptor Mas na preservação da função vasodilatadora do endotélio coronariano. Sumarizando, nossos resultados mostram um importante papel do eixo Ang-(1-7)Mas no controle e na preservação da função cardíaca e vascular coronariana em condições basais e pós-isquêmicas. Nossos dados também demonstram que a Ang-(1-7), via receptor Mas, modula de forma benéfica o remodelamento cardíaco, atenuando o desenvolvimento de fibrose e hipertrofia cardíaca. Isto mostra mais uma vez, que a Ang-(1-7) e seu receptor Mas apresentam grande potencial terapêutico, podendo ser essenciais para o desenvolvimento de novas ferramentas terapêuticas. 99 7. CONCLUSÕES · Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram menor função contrátil · Os ratos transgênicos TG(hA1-7)L7301 apresentaram maior função contrátil e menor incidência de arritmias de reperfusão. · Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram maior hipertrofia e fibrose quando submetidos ao tratamento com isoproterenol. · O aumento dos níveis de Ang-(1-7) no coração não alterou a hipertrofia, mas inibiu seletivamente a síntese de proteínas de matriz extracelular induzidas por isoproterenol. · Os animais com deleção genética do receptor Mas apresentaram maior pressão de perfusão coronariana. Além disso, o efeito vasodilatador da acetilcolina foi ausente nos corações destes animais. · O fluxo coronariano foi menor nos corações dos ratos transgênicos TG(hA1-7)L7301 no período pré-isquêmico, porém aumentou significativamente no período pós-isquêmico. Estes resultados mostram que o eixo Ang-(1-7)/Mas é um componente essencial no controle e preservação da função cardíaca e na modulação da função endotelial dos vasos coronarianos. Além disso, este estudo mostra uma participação cardioprotetora remodelamento cardíaco. da Ang-(1-7) e do seu receptor Mas no 100 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Allen, A. M., Zhuo, J., and Mendelsohn, F. A. (2000). Localization and function of angiotensin AT1 receptors. Am J Hypertens 13, 31S-38S. Almeida, A. P., Frabregas, B. C., Madureira, M. M., Santos, R. J., CampagnoleSantos, M. J., and Santos, R. A. (2000). Angiotensin-(1-7) potentiates the coronary vasodilatatory effect of bradykinin in the isolated rat heart. Braz J Med Biol Res 33, 709-713. Atlas, S. A. (1998). The renin-angiotensin system revisited: classical and nonclassical pathway of angiotensin formation. Mt Sinai J Med 65, 87-96. Averill, D. B., Ishiyama, Y., Chappell, M. C., and Ferrario, C. M. (2003). 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