Bedeutung Des Insulin-like Growth Factor

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Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Rinder Bedeutung des Insulin-like growth factor - Systems während der Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften - Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Friederike Poppicht Lohne Hannover 2015 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Christine Wrenzycki Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit tierärztlicher Ambulanz, Professur für Molekulare Reproduktionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen Prof. Dr. Pablo Steinberg Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Christiane Pfarrer Anatomisches Institut Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 1. Gutachter: Prof. Dr. Pablo Steinberg 2. Gutachterin: Apl. Prof. Dr. Meinecke-Tillmann Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2015 Die vorliegende Arbeit wurde durch die H. W. Schaumann Stiftung gefördert. Für Thomas in Liebe und Dankbarkeit Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................. 1 2. Literatur ............................................................................................................. 4 2.1 Insulin-like growth factor – System ................................................................... 4 2.1.1 Liganden des IGF-Systems ........................................................................ 4 2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems .................................................................... 6 2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems ........................................................... 8 2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern.......... 9 2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen ................................................................ 12 2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen Embryonalentwicklung in vitro ................................................................. 15 2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen ................................................ 24 2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Embryonen..................................................................................................... 26 2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen Embryonalentwicklung ............................................................................. 26 2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine ........................................... 27 2.3.3 Glukosetransporter ................................................................................... 28 2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie ........................... 30 2.4 Ziele des vorliegenden Projektes ................................................................... 32 3. Material und Methoden....................................................................................... 33 3.1 In-vitro-Produktion .......................................................................................... 33 3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe .............................................. 33 3.1.2 In-vitro-Maturation .................................................................................... 35 3.1.3 In-vitro-Fertilisation ................................................................................... 37 3.1.4 In-vitro-Kultivierung................................................................................... 39 3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342 ........................... 40 3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium...................... 41 3.4 Teilungs- und Entwicklungsraten.................................................................... 45 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 3.5 Lebend-Tot-Färbung mit Hoechst und Ethidium homodimer .......................... 46 3.6 Nachweis apoptotischer Zellen durch TUNEL-Färbung ................................. 48 3.7 MessengerRNA - Analyse mittels RT-qPCR .................................................. 50 3.7.1 Isolierung der mRNA ................................................................................ 50 3.7.2 Reverse Transkription .............................................................................. 52 3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion .................................................. 53 3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins..................................................................... 57 3.8.1 Gelelektrophorese .................................................................................... 57 3.8.2 Western blot ............................................................................................. 58 3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge . 59 3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind ......................................... 60 3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R ............................................................ 62 3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper .... 63 3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der Färbung ................................................................................................... 63 3.10 Statistische Auswertungen ........................................................................... 65 3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau........................................................................ 66 3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau........................................................................ 66 3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF1-Konzentrationen . 66 3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen ... 66 3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R ...................... 67 4. Ergebnisse .......................................................................................................... 68 4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten ............................................ 68 4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten ................................................................ 71 4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium .................................... 74 4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung ................................................................ 76 4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen................................................... 79 4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte .......................................... 81 4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen .......................................................................... 81 4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R ................................... 83 II Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ 4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R .................................................. 83 4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot ....................................................... 84 4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung.................................. 87 4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R ............................................................................................................ 89 5. Diskussion .......................................................................................................... 90 5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität boviner Embryonen ........................................................................................ 91 5.2 Expressionsmuster spezifischer Gentranskripte nach In-vitro-Maturation boviner KOK mit IGF1 .................................................................................... 94 5.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium...................... 97 5.4 Vergleichende Expression des IGF1R in Stadien der frühen Embryonalentwicklung ................................................................................... 99 5.5 Schlussfolgerung .......................................................................................... 102 6. Zusammenfassung ........................................................................................... 105 7. Summary ......................................................................................................... 109 8. Anhang ......................................................................................................... 112 8.1 Medien der IVP............................................................................................. 112 8.1 Medien für Proteinbestimmungen................................................................. 118 8.3 Medien für die Färbungen ............................................................................ 122 8.4 Labormaterial und Geräte............................................................................. 123 8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen ........................................ 126 9. Verzeichnisse.................................................................................................... 129 9.1 Abkürzungsverzeichnis................................................................................. 129 9.2 Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 134 9.3 Verzeichnis der Tabellen .............................................................................. 137 9.4 Literaturverzeichnis ...................................................................................... 140 Veröffentlichungen ............................................................................................... 168 Erklärung ......................................................................................................... 169 Danksagung ......................................................................................................... 170 III Einleitung ___________________________________________________________________ 1. Einleitung Beim Rind ist die Analyse der frühen embryonalen Entwicklung durch den Einsatz biotechnologische Methoden zu einem bedeutenden Bereich in der Reproduktionsmedizin geworden. Die In-vitro-Produktion (IVP) von Embryonen wird heute routinemäßig zur Gewinnung einer großen Anzahl Nachkommen bestimmter Zuchttiere genutzt und findet daher auch in der Forschung häufig Anwendung, um die daraus resultierenden Probleme und Fragestellung zu untersuchen. So können Einflüsse äußerer Einwirkungen, wie die Gaskonzentration oder die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums, auf den Embryo und dessen Genexpression analysiert werden. Diese Studien dienen dem besseren Verständnis entwicklungsrelevanter Prozesse und gestatten es, Aussagen über die Qualität der Embryonen zu treffen, da deren Entwicklung von der korrekten Ausführung des genetischen Programms abhängig ist (WRENZYCKI et al. 1998). Die meisten Untersuchungen auf molekularer Ebene fanden im bovinen Embryo bisher durch Betrachtung der relativen Menge spezifischer Gentranskripte statt. Eine Reihe von Vorgängen konnte bereits analysiert und in den Entwicklungskontext gebracht werden, da diese Methode mit einer geringen Probenmenge und einem großen Durchsatz durchführbar ist. Zur vollständigen Analyse der Qualität und Entwicklung von Embryonen sind jedoch weitere Studien notwendig, die auf die Endprodukte der Gensynthese, also die Proteine und deren Funktionalität, eingehen. Dabei kann die Lokalisation eines Proteins zur Aufklärung von dessen Funktion beitragen. Erstere wird durch die Methode der Immunhistochemie oder Immunfluoreszenzfärbung bestimmt. Die Quantität eines Proteins kann wiederum anhand der Messung der Signalintensität definiert werden. Die Methode des Western blots eignet sich ebenfalls zum Nachweis und zur Quantifizierung eines Proteins, benötigt jedoch ein großes Probenvolumen. Bisher fanden nur wenige Untersuchungen auf Proteinebene am präimplantorischen Embryo des Rindes statt. Aus diesem Grund ist das Interesse groß, das Protein genauer zu untersuchen und zu ermitteln, inwieweit sich dieses von bisherigen Studien der mRNA (messenger ribonucleic acid) unterscheidet. Gerade die Genexpression des Embryos ist im Vergleich zu somatischen Zellen in ihrer Art außergewöhnlich. Das frühe Entwicklungsprogramm 1 Einleitung ___________________________________________________________________ des Embryos wird zunächst von maternalen Transkripten und Proteinen kontrolliert und widerfährt im Rind erst im 8- bis 16-Zellstadium eine Umstellung, auf die Transkription embryo-spezifischer Gene, die sogenannte maternal-embryonic transition (MET). Das Insulin-like growth factor (IGF) - System ist eine wichtige Familie von Faktoren, die an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt sind. Sie spielen eine wesentliche Rolle beim Wachstum und der Entwicklung embryonaler, fetaler und plazentarer Gewebe (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Zusätzlich konnte bei dem Insulin-like growth factor 1 (IGF1) eine antiapoptotische Wirkung nachgewiesen werden. So führte die Zugabe von IGF1 zum Maturations- oder Kultivierungsmedium boviner Embryonen zu einer Abnahme apoptotischer Zellen (BYRNE et al. 2002, WASIELAK u. BOGACKI 2007). Die IGF1-Signalübertragung erfolgt über die spezifische Bindung an den membranständigen Insulin-like growth factor 1-Rezeptor (IGF1R). Dieser Rezeptor spielt nachweislich eine entscheidende Rolle bei der Embryonalentwicklung und ist in seiner Funktionalität entwicklungsrelevant. Die Expression des IGF1-Rezeptors gilt zudem als ein potentieller Marker für die Qualität in vitro produzierter Embryonen (LIU et al. 1997). Ein Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von IGF1 wurde unter anderem auch bei dem PCO-Syndrom (Polyzystisches Ovarsyndrom) der Frau durch Untersuchungen bei der Maus gefunden (CHI et al. 2000). So konnte nach Zugabe einer supraphysiologischen Konzentration an IGF1 zum Kultivierungsmedium während der IVP muriner Embryonen eine Herunterregulation des IGF1R-Proteins gemessen werden, was zu einer gesteigerten Apoptose führte und der Grund für erhöhte embryonale Mortalität sein könnte. Weiterhin reduzieren die Veränderungen, die während der Phase der negativen Energiebilanz bei Hochleistungsrindern kurz vor und nach der Abkalbung auftreten, die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1, was zu einer Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verspäteten Ovulation führt (WATHES et al. 2007). Ferner führen die metabolischen Veränderungen direkt oder indirekt durch Schädigung der follikulären Umgebung zu einer Verschlechterung (WATHES et al. der 2007). Oozytenqualität Für eine 2 und der Optimierung Embryonalentwicklung der Therapien von Einleitung ___________________________________________________________________ Fruchtbarkeitsstörungen und assistierten Reproduktionstechniken ist ein besseres Verständnis von Schlüsselprozessen der frühen Embryonalentwicklung von großer Bedeutung. Das Rind als Modellorganismus eignet sich besonders gut zur Untersuchung dieser Prozesse, da gerade die bovine Embryonalentwicklung der humanen in vielerlei Hinsicht ähnlich ist (WRENZYCKI et al. 2005). Ziel dieses Projektes ist es, die Proteinexpression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors während der Maturation und der frühen embryonalen Entwicklung zu untersuchen. Dafür erfolgt eine Austestung unterschiedlicher Antikörper, die einen sensitiven Nachweis des IGF1R in bovinen Embryonen ermöglichen. Es soll ein Western Blot durchgeführt werden, um spezifische Unterschiede in der Expression des IGF1R zu untersuchen. Des Weiteren wird der Effekt der Supplementation einer physiologischen oder supraphysiologischen Konzentration an IGF1 zum Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern auf die Anzahl apoptotischer Zellen und die Expression des IGF-Systems untersucht. Dabei soll gezeigt werden, ob die hinzugefügte Konzentration an IGF1 während der Eizellreifung im Medium reduziert oder gesteigert wird. Außerdem soll anhand einer Immunfluoreszenzfärbung die Lokalisation des Rezeptors in allen Stadien der embryonalen Entwicklung bestimmt werden. Die Ergebnisse werden mittels Untersuchungen des mRNA-Expressionsmusters von Genen des IGF-Systems, apoptoserelevanten Transkripten und Transkripten des Glukosestoffwechsels verglichen und könnten zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 auf die Eizellreifung und präimplantorische Entwicklung boviner Embryonen beitragen. Es könnten überdies neue Erkenntnisse über mögliche Ursachen der frühen embryonalen Mortalität bei Hochleistungsrindern nach der Abkalbung aufgedeckt werden. Letztlich sollen die Ergebnisse dabei helfen, die Kultivierungssysteme für die IVP zu verbessern und daraus resultierend zu einer Qualitätsverbesserung der Embryonen führen. 3 Literatur ___________________________________________________________________ 2. Literatur 2.1 Insulin-like growth factor – System Das Insulin-like growth factor - System gehört zu einer komplexen Familie von Wachstumsfaktoren, die an Wachstum, Entwicklung und Differenzierung von Säugerzellen beteiligt sind. Sie besteht nach heutigem Wissensstand aus zwei Liganden (IGF1 und IGF2), zwei Membranrezeptoren (IGF1R und IGF2R), spezifischen Bindungsproteinen (IGFBP) und IGFBP-assoziierten Proteinen (HWA et al. 1999). Isoliert und sequenziert wurden IGF1 und 2 erstmals 1976 von Rinderknecht und Humbel, die den Namen Insulin-like growth factor aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu Proinsulin wählten, der daraufhin deutet, dass beide Hormone aus einer Genduplikation vor über 600 Millionen Jahren hervorgegangen sind (FROESCH 1985). Im Vergleich der Aminosäuresequenzen von Rind und Mensch besteht eine 100-prozentige Homologie der Liganden IGF1 und IGF2 (HONEGGER u. HUMBEL 1986). 2.1.1 Liganden des IGF-Systems Die Liganden IGF1 und IGF2 sind Polypeptide, bestehend aus ca. 70 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von ungefähr 7000 Dalton (RINDERKNECHT u. HUMBEL 1978). Der Hauptsyntheseort von IGF1 und IGF2 als endokrine Faktoren ist die Leber. Die Synthese wird durch das Wachstumshormon [Growth Hormone (GH)] stimuliert (JONES u. CLEMMONS 1995). Weiterhin konnte eine lokale Produktion von IGF1 und IGF2 als parakrin wirkende Faktoren in einigen Geweben, wie beispielsweise der Plazenta, nachgewiesen werden, wo sie zur Zelldifferenzierung beitragen (LARON et al. 2001). Ähnlich wie Insulin können IGF1 und IGF2 die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen stimulieren (RINDERKNECHT u. HUMBEL 1978). Des Weiteren haben die Wachstumsfaktoren einen regulatorischen Einfluss auf den Metabolismus, die Mitoserate und die Steuerung des plazentaren und fetalen Wachstums (FOWDEN 2003). Die Liganden 4 Literatur ___________________________________________________________________ des IGF-Systems spielen beim Wachstum von Organismen eine entscheidende Rolle. Die Hauptfunktion von IGF1 ist die pränatale und postnatale Stimulation der Entwicklung. Eine fehlende IGF-Synthese führt sowohl prä- als auch postnatal zu einer fetalen Wachstumsretardierung (LIU et al. 1997). IGF1-null-mutante Mäuse sterben häufig schon vor der Geburt (95-prozentige perinatale Mortalität). Die wenigen überlebenden Tiere sind unfruchtbar, entwicklungsgestört und weisen zahlreiche Defekte in den Organsystemen auf (LIU et al. 1997). Der Insulin-like growth factor 1 ist ein einkettiges, basisches Polypeptid, das sich in einen A- und B-Strang gliedert, die durch drei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1A). Die Signalübertragung von IGF1 erfolgt vorwiegend durch die Bindung an den membranständigen Rezeptor Insulin-like growth factor 1 receptor (KAYE 1997). Allerdings kann IGF1 auch durch Bindung an den Insulinrezeptor metabolische Effekte, wie den Glukosetransport, steuern (KAYE 1997). A B Abbildung 1: Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B; TORRES et al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum C-Terminus (Blau) unter Verwendung eines Regenbogenfarben-Spektrums coloriert dargestellt Der Insulin-like-growth factor 2 ist in seiner Struktur und Sequenz dem IGF1 sehr ähnlich. Das einsträngige Polypeptid gliedert sich in vier Domänen, die über drei Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Abb. 1B). Die Signalübertragung von IGF2 erfolgt wie bei IGF1 durch die Bindung an den membranständigen IGF1R. Jedoch kann IGF2 auch an den Insulin-like growth factor 2 - Rezeptor (IGF2R) binden und bewirkt dort die Proliferation und Differenzierung von Zellen. Außerdem 5 Literatur ___________________________________________________________________ kommt es zu einer Art Reinigung der Umgebung von IGF2 durch die Bindung an den IGF2R (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Während der frühen Embryonalentwicklung spielt IGF2 eine große Rolle, da es das normale Plazentawachstum und die frühe Zellentwicklung fördert (HARRIS u. WESTWOOD 2012). 2.1.2 Rezeptoren des IGF-Systems Strukturell ist der membranständige IGF1R ein Heterotetramer, das aus zwei extrazellulären α-Untereinheiten und zwei transmembranen β-Untereinheiten besteht (KATO et al. 1994). Die α-Untereinheiten weisen cysteinreiche Bindungsstellen für die IGF-Liganden auf und sind durch Disulfidbrücken miteinander und zu den β-Untereinheiten verbunden. Die β-Untereinheiten setzen sich aus einer intrazellulären Domäne mit einer Tyrosinkinase, einer Transmembrandomäne und einer kurzen extrazellulären Domäne zusammen (KATO et al. 1994). Damit weist der IGF1R viele strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten zum Insulinrezeptor auf und kann neben IGF1 auch IGF2 und Insulin binden, zeigt jedoch die größte Bindungsaffinität zu IGF1 (KAYE 1997). Durch Autophosphorylierung der Tyrosinkinase des Rezeptors werden intrazellulär zwei Hauptsignalkaskaden aktiviert, der MAPK-Signalweg (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) und der PI3KSignalweg (Phosphoinositid-3-Kinase). Diese Signalkaskaden führen zur Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren und lösen so eine spezielle Zellantwort aus, die letztlich die Proliferation, das Wachstum und das Überleben der Zelle bewirken (LARON 2001). In Abbildung 2 ist Signalübertragung schematisch dargestellt. 6 das gesamte IGF-System und die Literatur ___________________________________________________________________ IGFBP-Fragmente IGFBP Protease IGF1-Rezeptor PI3K IGF2-Rezeptor MAPK Abbildung 2: Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999) Der IGF2R, auch kationunabhängiger Mannose-6-Phosphat (M6P) Rezeptor genannt, ist ein vielseitiger Proteinrezeptor, der sowohl IGF2 an der Zellmembran binden kann, als auch Mannose-6-Phosphat gebundene Proteine im Transgolgi Netzwerk (HARRIS u. WESTWOOD 2012). In seiner Struktur besteht der einsträngige IGF2R primär aus einer großen extrazellulären Domäne, die strukturell homolog zu der kollagenbindenden Domäne von Fibronectin ist, einer transmembranen Domäne und einem relativ kurzen cytoplasmatischen Schwanz (BROWN et al. 2009). Die Signaltransduktion erfolgt hauptsächlich über die Transaktivierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren, da der Rezeptor weder über eine Tyrosinkinase, noch über eine Autophosphorylierungsstelle verfügt (EL-SHEWY u. LUTTRELL 2009). Die weiteren Signalwege können sowohl fördernd auf die Proliferation und das Wachstum der Zellen wirken, als auch die Migration der Zelle auslösen (HARRIS u. WESTWOOD 2012). Insgesamt zeigt der IGF2R eine größere Bindungsaffinität gegenüber IGF2 als IGF1 und kann Insulin nicht binden (HARRIS und WESTWOOD 2012). Daher ist die Signalübertragung von IGF2 über den IGF2R einer der Hauptmediatoren für die Regulation einer normalen Embryonalentwicklung (HARRIS und WESTWOOD 2012). 7 Literatur ___________________________________________________________________ 2.1.3 Bindungsproteine des IGF-Systems Die Insulin-like growth factor-Bindungsproteine gehören zur Familie der sezernierenden Proteine, die IGF 1 und 2 mit einer höheren oder ähnlichen Wahrscheinlichkeit wie der IGF1R binden und ein Molekulargewicht zwischen 24 und 45 kDa aufweisen (DUAN u. XU 2005). Die Primärstruktur aller IGFBP ist gleich und gliedert sich in drei Domänen mit jeweils gleicher Größe: eine hoch konservierte N-terminalen Domäne, eine konservierte C-terminale Domäne und eine variierende, zentrale Domäne, auch linker (L-) Domäne genannt (HWA et al. 1999). Die N-terminale Domäne enthält die Hauptbindungsstelle für IGF1 und -2, während die C-terminale Domäne zwar zur Ligandenbindung beiträgt, aber zusätzlich mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel der unstabilen Säure-Untereinheit (acid-labile subunit), interagieren kann (CLEMMONS 2001). Die L-Domäne ist variabel und enthält Stellen mit posttranskriptionaler und –translationaler Aktivität, die Polyadenylierung, Spleißen, aber auch Glykosylierung, Phosphorylierung und Proteolyse steuern können (HWA et al. 1999). Zurzeit sind sechs verschiedene Bindungsproteine (IGFBP-1 bis -6) beim Rind, Menschen und weiteren Spezies bekannt (SATO et al. 1993, CLEMMONS 2001, DUAN u. XU 2005). Das Vorkommen eines siebten IGFBP wird weiterhin kontrovers diskutiert (LI et al. 2012). Das IGFBP-7, ebenso bekannt unter IGFBP-related protein 1, mac25/angiomodulin oder tumor-derived adhesion factor, ist ein Protein, welches eine hohe Strukturähnlichkeit zu den IGFBP-1 bis -6 aufweist, jedoch in seiner Funktion vorwiegend Insulin bindet und daher eine bisher noch unbekannte biologische Rolle spielt (AKAOGI et al. 1996, OH et al. 1996, LI et al. 2012). In extrazellulären Flüssigkeiten kommen die Liganden IGF1 und IGF2 zu 99 % gebunden an eines der sechs IGFBP vor (LARON 2001). Der Hauptteil des zirkulierenden IGF1 ist an das IGFBP3 gebunden. Die Bindeproteine helfen beim Transport der Liganden im Plasma und bei der Bindung der freien IGFs an ihre Rezeptoren, um so ihre Verfügbarkeit für das Gewebe zu vermitteln (JONES u. CLEMMONS 1995). Sie verlängern die Halbwertszeit des zirkulierenden IGF1 oder IGF2 und regulieren ihre biologische Aktivität (JONES u. CLEMMONS 1995). 8 Literatur ___________________________________________________________________ 2.1.4 Rolle des IGF1 während der Pubertät und Trächtigkeit von Rindern Im Verlauf der Entwicklung des weiblichen Hausrindes bis zum Beginn der Pubertät konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration registriert werden (ARMSTRONG et al. 1992, GARCIA u. SANTISTEBAN 2002). So steigt der IGF1-Serumgehalt im Vergleich zu jüngeren Tieren kurz vor der Pubertät um mehr als 20 % an (GARCIA u. SANTISTEBAN 2002). In Studien, bei denen die IGF1-Serumwerte durch eine aktive Immunisierung gegen den Growth Hormone Releasing Factor (GRFi) herabgesetzt wurden, zeigten die Tiere eine verspätet einsetzende Pubertät (SCHOPPEE et al. 1996, KÖLLE et al. 2003). Eine mögliche Ursache ist laut der Autoren die niedrige IGF1-Konzentration, die eine Beeinträchtigung der Östradiol-17β (E₂)-Synthese im Ovar bewirkt, was zu einer Verzögerung des LH-Anstiegs (Luteinisierendes Hormon) führt und auf diese Weise die Heranreifung von Follikeln beeinflusst (SCHOPPEE et al. 1996, KÖLLE et al. 2003). Zudem richtet sich die IGF1-Konzentration im Blut nach der metabolischen Situation des Tieres und lässt sich durch das Futtermanagement verändern (YAMBAYAMBA et al. 1996). Es wurde beobachtet, dass bei Tieren, die ad libitum gefüttert werden, höhere IGF1-Konzentrationen im Blut messbar waren und die Pubertät früher einsetzte als bei Tieren nach restriktiver Fütterung (YELICH et al. 1996). Nicht nur während der Pubertät, sondern auch bei der Trächtigkeit von Rindern, spielt IGF1 eine entscheidende Rolle. In der späten Phase der Trächtigkeit und der frühen Laktationsphase steigen die Nährstoffbedürfnisse des Rindes drastisch an. Zum einen benötigt das Rind mehr Nährstoffe, um das fetale Wachstum zu gewährleisten und zum anderen, um (Abbildung 3). 9 die Milchsynthese zu ermöglichen Literatur ___________________________________________________________________ Energie (Kcal pro Tag) Milchproduktion Futter Energiespeicher des Körpers Laktationstrimester Abbildung 3: Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase des Rindes (mod. Nach EMMICK et al. 2000) In dieser Situation ist das Rind außerstande, den Bedarf über die Nahrungsaufnahme sicherzustellen. Daher wurde dieser Zustand als negative Energiebilanz definiert (MCCLURE 1965). Besonders nach der Abkalbung wirkt sich diese negative Energiebilanz bei Hochleistungsrindern direkt auf die Fertilität aus (WATHES et al. 2007). In dieser Phase findet ein Zusammenspiel vieler einzelner Faktoren statt. Die Veränderungen, die währenddessen auf der GH-IGF-Achse auftreten, reduzieren zum einen durch eine verminderte Produktion von IGF1 in der Leber die Bioverfügbarkeit von zirkulierendem IGF1 (FENWICK et al. 2008). Zum anderen bewirkt eine verringerte Ausschüttung von IGFBPs eine Verkürzung der Halbwertszeit von IGF1, wodurch weniger IGF1 zur Verfügung steht (LEROY et al. 2008). Außerdem bewirkt ein erhöhter Blutfluss durch die Leber, eine gesteigerte Verstoffwechselung von IGF1, womit ebenfalls weniger zirkulierendes IGF1 vorhanden ist. Letztlich führen die Änderungen auf IGF1-Ebene zu einer Verlangsamung des follikulären Wachstums und einer verzögerten Ovulation 10 Literatur ___________________________________________________________________ (WATHES et al. 2007). Ausschlaggebend für die Fruchtbarkeit des Hochleistungsrindes und dementsprechend wichtig für eine normale follikuläre Entwicklung ist die IGF1-Konzentration im Serum (LEROY et al. 2008). Bei Rindern mit einer stark ausgeprägten negativen Energiebilanz (SNEB) wurde ein reduzierter IGF1-Gehalt im Serum beobachtet (FENWICK et al. 2008). Dieser lässt sich durch eine reduzierte Verfügbarkeit von Glukose erklären, wodurch die Produktion von IGF1 eingeschränkt wird. Aber auch die IGF1-Konzentration in der Follikelflüssigkeit ist von entscheidender Bedeutung. Die metabolischen Veränderungen, die während der NEB auftreten, können direkt oder indirekt durch Beeinträchtigung der follikulären Umgebung zu einer Verschlechterung der Oozytenqualität führen (WATHES et al. 2007). Sogar wenn anschließend eine korrekte Fertilisierung stattgefunden hat, können vorherige schlechte follikuläre Bedingungen während Eizellwachstum und – reifung die Viabilität des resultierenden Embryos beeinflussen und damit zu einer frühen embryonalen Mortalität führen (LEROY et al. 2011). Aus diesem Grund wurden bereits zahlreiche Versuche durchgeführt, die an dieser Stelle in vitro ansetzen, um möglichst genau die Zusammensetzung der Follikelflüssigkeit zu definieren und den Einfluss auf die Eizelle zu untersuchen. Im Nachfolgenden Kapitel (2.2.1) wird hierauf detaillierter eingegangen. 11 Literatur ___________________________________________________________________ 2.2 In-vitro-Produktion von Embryonen Die In-vitro-Produktion von Embryonen ist zu einer bedeutenden Methode der assistierten Reproduktion bei Rindern geworden und gliedert sich in die drei aufeinanderfolgenden Schritte der In-vitro-Reifung oder -Maturation (IVM), der Invitro-Befruchtung oder -Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultivierung (IVC; BAVISTER 1995; Abb. 4). Durch die Weiterentwicklungen in der Biotechnologie werden mittlerweile jährlich eine große Anzahl kommerzieller Embryonen erzeugt. Im Jahr 2013 wurden weltweit 546.628 transfertaugliche bovine Embryonen in vitro produziert, von denen knapp 410.000 transferiert wurden (PERRY 2014). Die ersten erfolgreichen In-vitro-Fertilisationen fanden beim Kaninchen in den späten 50er Jahren statt (CHANG 1959). Ein Jahrzehnt später konnten Erfolge bei der Maus verzeichnet werden (WHITTINGHAM 1968), worauf folgend die ersten humanen Eizellen in vitro gereift und erfolgreich fertilisiert wurden (EDWARDS et al. 1969). Beim Rind beschrieben Iritani und Niwa (1977) die erste Fertilisation einer Eizelle in vitro. Das erste Kalb aus einem in vitro produzierten Embryo kam im Januar 1981 zur Welt (BRACKETT et al. 1982). Seitdem erfolgte eine stetige Weiterentwicklung der IVP, die heute hauptsächlich zur assistierten Reproduktion beim Menschen, Pferd und beim Rind Anwendung findet. Eizellwachstum im Follikel Unreife Eizelle Reife Eizelle Zygote 2-Zeller 4-Zeller 8-Zeller 16-Zeller Morula Blastozyste Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner Embryonen (mod. nach LONERGAN 2007) 12 Literatur ___________________________________________________________________ Für Forschungszwecke hat sich die Entnahme von Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK) aus Ovarien geschlachteter Tiere bewährt. Durch Isolierung, Aspiration oder „Slicen“ von Follikeln können unterschiedliche Mengen an KOK gewonnen werden (GALLI et al. 2003). Im Anschluss an die Gewinnung erfolgt die Bewertung und Selektion der KOK nach morphologischen Kriterien. Dabei kommt es nur zur Verwendung von den KOK, die sich als IVP-tauglich einordnen lassen. Maßgebend dafür sind ein homogenes Ooplasma und die Anzahl der die Eizelle umgebenden Kumuluszellen(KASTROP et al. 1990). Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Entwicklung zur Blastozyste in vitro steigt mit der Anzahl an Kumuluszellschichten signifikant an (KHURANA u. NIEMANN 2000). Anschließend findet die Reifung der KOK in einem spezifischen Medium statt. Während der Maturation der Eizelle wird die Meiose fortgeführt. Unter natürlichen Bedingungen erfolgt dies unter Einfluss eines LH-Peaks (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Nach 20-24 Stunden Inkubation ist die Mehrzahl der Oozyten vollständig gereift und bereit, fertilisiert zu werden. Unter optimalen Bedingungen erreichen mehr als 90 % der Eizellen das Metaphase-II– Stadium (GALLI et al. 2003). Für die darauf folgende Befruchtung der gereiften Oozyten wird hauptsächlich tiefgefrorenes Sperma verwendet. Dies wird zum Beispiel mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation aufbereitet, bei der sich die lebenden, motilen Spermien in der Fraktion mit der höheren Dichte konzentrieren und die toten Spermien daher leicht mit dem Überstand abpipettiert werden können. Des Weiteren sind zur Spermienbehandlung Substanzen wie Heparin, Hypotaurin und Epinephrin wichtig, um unter anderem die Kapazitation der bovinen Spermien einzuleiten und sie so für die Befruchtung vorzubereiten. Die eigentliche Fertilisation erfolgt während einer 19-stündigen Ko-Inkubation von KOK und Spermien, wodurch Befruchtungsraten von 70-90 % erzielt werden können (WRENZYCKI et al. 2007). Im Anschluss findet die Kultivierung der befruchteten Eizellen unter kontrollierten physikalischen Bedingungen statt. Die Zygote beginnt sich anfänglich in jeweils gleich große Zellen zu teilen. Im weiteren Verlauf dieser sogenannten Furchungsteilung kommt es zur Kompaktierung der Zellen zu einer Morula, die im Rind aus etwa 32 Zellen besteht (VAN SOOM et al. 1997). Anschließend wird von 13 Literatur ___________________________________________________________________ den Zellen Flüssigkeit sezerniert, die zur Bildung eines Blastozoels führt. Während der Blastulierung kommt es dann erstmals zu einer Differenzierung von Zellen in den Trophoblasten, der sich später zum Chorion- und Amnionepithel entwickelt und der inneren Zellmasse, dem sogenannten Embryoblasten, aus dem in der folgenden Entwicklung der Embryo bzw. Fetus entsteht (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Die Invitro-Kultivierung von Rinderembryonen erfolgt in den meisten Fällen bis zum siebten Tag, zum Stadium der expandierten Blastozyste. Bis zu diesem Zeitpunkt können Entwicklungsraten von 20-40 % erzielt werden (RIZOS et al. 2002). Bei der IVP haben primär die Kultivierungsmedien, einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklung der Embryonen. Bei der Reifung boviner KOK kommt es vorwiegend zur Verwendung komplexer Medien, wie das kommerziell erhältliche Tissue Culture Medium 199 (TCM199), das für die Kultivierung somatischer Zellen entwickelt wurde (SUTTON et al. 2003). Üblicherweise werden dem Maturationsmedium Hormone, wie humanes Choriongonadotropin (hCG) zugesetzt, das die natürlichen Hormone FSH (follikelstimulierendes Hormon) und LH ersetzt und zum Prozess der Reifung beiträgt (SCHNORR u. KRESSIN 2011). Zusätzlich findet eine Supplementation des Mediums mit Proteinen statt. Die häufigsten Proteinzusätze sind dabei fetales Kälberserum (FCS) oder bovines Serumalbumin (BSA) unterschiedlicher Reinheit (FARIN et al. 2001). Neben der Qualität der Eizelle hat das Kultivierungsmedium den größten Einfluss auf die Qualität der sich entwickelnden Embryonen. Bis heute gibt es zahlreiche Studien, die den Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsmedien und Zusätze auf die Entwicklung boviner Embryonen untersucht haben (WRENZYCKI et al. 1999, NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al. 2003). Kultivierungsmedien können ganz unterschiedlich zusammengesetzt sein. Einfach balancierte Salzlösungen mit Kohlenhydraten bis hin zu komplexen Medien mit vielen verschiedenen Inhaltsstoffen wurden bereits getestet (SAGIRKAYA et al. 2006). Eines der am häufigsten genutzten Medien für die In-vitro-Kultivierung boviner Embryonen ist SOF-Medium (synthetic oviduct fluid). Die Basis dafür bildete eine Untersuchung der ovinen Eileiterflüssigkeit auf biochemischer Ebene (TERVIT et al. 1972). In den letzten Jahrzehnten 14 fand eine stetige Optimierung der Literatur ___________________________________________________________________ Zusammensetzung durch empirische Modifikationen wie z.B. durch die Zugabe von Aminosäuren (FEUGANG et al. 2009) oder Wachstumshormonen (SIRISATHIEN u. BRACKETT 2003) statt. 2.2.1 Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen bovinen Embryonalentwicklung in vitro Der Insulin-like growth factor 1 hat einen entscheidenden Einfluss auf das follikuläre Wachstum und damit auf die Eizellreifung. Mit Zunahme des Follikeldurchmessers ließ sich ein Anstieg der IGF1-Konzentration im Follikel von Rindern erkennen, der wiederum mit der Plasmakonzentration korrelierte (SPICER u. ECHTERNKAMP 1995). Im Ovar verstärkt IGF1 die Wirkung von Gonadotropinen, die das Follikelwachstum stimulieren (GIUDICE 1992). In einer Studie, in der IGF1 kontinuierlich intraovariell durch eine osmotische Minipumpe verabreicht wurde, konnte gezeigt werden, dass die E2-Synthese in kleinen Follikeln (2-5 mm) anstieg und die Follikelgröße dabei stetig zunahm (SPICER et al. 2000). IGF1 fördert daneben die Proliferation der Granulosazellen im Follikel und die Eizellreifung (KHAMSI et al. 2001). In einer anderen Studie, in der weibliche Rinder nach intraovarieller IGF1-Injektion (500 ng/ml) besamt wurden, konnten keine Unterschiede in der Entwicklungsrate oder der Gesamtanzahl an embryonalen Zellen entdeckt werden, allerdings zeigte sich ein Anstieg der Proliferation des Embryoblasten (VELAZQUEZ et al. 2012). Bei der Untersuchung des Einflusses einer intrafollikulären Injektion von IGF1 (200 µg/ml) in den subdominanten Follikel von Rindern während des physiologischen Östrus konnte beobachtet werden, dass es zu einer Stimulation des subdominanten Follikels, bei gleichzeitiger Inhibierung des dominanten Follikels, kam (SHAHIDUZZAMAN et al. 2010). Eine Stimulation kennzeichnete sich hierbei durch ein voranschreitendes Wachstum mit Vergrößerung des Gesamtdurchmessers und eine ansteigende Durchblutung der Follikelwand, gemessen mit einer Doppler-Sonografie. Die Autoren bestätigten dadurch die 15 Literatur ___________________________________________________________________ stimulierende Funktion von IGF1 während des Follikelwachstums (SHAHIDUZZAMAN et al. 2010). Die Expression von IGF1 auf mRNA-Ebene in der bovinen Eizelle wird bis heute kontrovers diskutiert. Zum einen konnte gezeigt werden, dass IGF1 in der Oozyte exprimiert wird und daher eine wichtige Rolle während des Follikelwachstums spielt (WATSON et al. 1992). Zum anderen führten Untersuchungen an Rindereizellen nicht zu einem Nachweis von IGF1, weshalb auf eine parakrine Wirkungsweise von IGF1 in Oozyten geschlossen wurde (YASEEN et al. 2001). Während der frühen Embryonalentwicklung führten Studien zur mRNA-Expression von IGF1 in Embryonen ebenfalls zu gegensätzlichen Ergebnissen. In einigen Studien konnte IGF1 in allen Stadien der präimplantatorischen Entwicklung nachgewiesen werden (WATSON et al. 1992, MOORE et al. 2007). Andere Arbeitsgruppen konnten dieses Ergebnis allerdings nicht bestätigen (LONERGAN et al. 2000, YASEEN et al. 2001, WANG et al. 2009). Hier weisen die Autoren auf eine parakrine Wirkungsweise von IGF1 über den IGF1R hin, der kontinuiertlich im Embryo exprimiert wird (YASEEN et al. 2001). Grundsätzlich stimuliert IGF1 im Embryo die DNA-Synthese und steigert dadurch die Mitoserate (FOWDEN 2003). Darüber hinaus vermittelt IGF1 die Nährstoffaufnahme und reguliert den Glukosestoffwechsel in Embryonen (KAYE 1997). Weiterhin trägt IGF1 zur Blastozystenbildung bei und fördert die Zellproliferation in der Inneren Zellmasse (KAYE 1997). Zusätzlich wirkt IGF1 antiapoptotisch und kann die Anzahl an apoptotischen Zellen im Embryo verringern (JOUSAN u. HANSEN 2007). Zur Untersuchung des Einflusses von IGF1 auf die Oozytenreifung und frühe Embryonalentwicklung wurden in der Vergangenheit zahlreiche Versuche durchgeführt, die sich mit der Supplementation von IGF1 zur Maturation boviner Eizellen (Tabelle 1) oder Kultivierung boviner Embryonen beschäftigten (Tabelle 2). Bei einem Zusatz von 100 ng/ml IGF1 zum Maturationsmedium (TCM199) wurde untersucht, ob dieser die Fortführung der zweiten Reifeteilung boviner Oozyten beeinflusst. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen den Oozyten der Supplementationsgruppe und denen der Kontrollgruppe gefunden werden (RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Ferner erfolgte die Analyse der Wirkung 16 Literatur ___________________________________________________________________ von IGF1 im Medium auf die Gesamtzellzahl und das Vorkommen von Apoptose während der Maturation. Dabei zeigte sich, dass IGF1 die Anzahl apoptotischer Kumuluszellen (KÖLLE et al. 2003) bzw. die Apoptose in den Eizellen reduziert (WASIELAK u. BOGACKI 2007), aber keinen Einfluss auf die Gesamtzellzahl der resultierenden Embryonen ausübt. Des Weiteren wurde untersucht, ob IGF1 die Anzahl an Embryonen, die sich nach einer In-vitro-Fertilisation weiter entwickeln, verändert und damit die sogenannte Entwicklungsrate beeinflusst. Allerdings konnten auch hier keine signifikanten Veränderungen der Anzahl an Morulae und Blastozysten erzielt werden (RIEGER et al. 1998, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002). Insgesamt wirkt IGF1 positiv auf Eizellen während der Maturation und fördert ihren Stoffwechsel (RIEGER et al. 1998). Tabelle 1: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Maturationsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung Parameter Maturations- Teilungs- Entwicklungsrate rate rate Zellzahl Apoptose Autor KÖLLE et al. (2003) 100 ng/ml - ↓(Kumuluszellen) - - - MAKAREVICH u. MARKKULA (2002) 100 ng/ml n.s. n.s. (Eizellen) - n.s. n.s. MEIYU et al. (2014) 100 ng/ml - n.s. (Eizellen) n.s. n.s. - RIEGER et al. (1998) 100 ng/ml n.s. - n.s. n.s. n.s. WASIELAK u. ↓ (Eizellen) BOGACKI (2007) 100 ng/ml n.s. = nicht signifikant; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht 17 - Literatur ___________________________________________________________________ Bei der Untersuchung des Einflusses von IGF1 während der Kultivierung boviner Embryonen wurden unterschiedliche Konzentrationen an IGF1 (50, 100, 200, 1000 ng/ml) dem Kultivierungsmedium zugesetzt, die alle zu einer Steigerung der Entwicklungsrate von Embryonen führten (Tabelle 2). Lediglich eine Studie konnte auch eine Steigerung der Teilungsrate nach Supplementation von 50 ng/ml IGF1 zum Kultivierungsmedium beobachten (SIRISATHIEN u. BRACKETT 2003). Außerdem wurde gezeigt, dass die Zugabe von IGF1 zu einer beschleunigten Entwicklung führt (PALMA et al. 1997). Beim Zusatz von 50 und 100 ng/ml IGF1 erfolgte eine Erhöhung der Gesamtzellzahl boviner Blastozysten. Gleichzeitig kam es zu einer Reduzierung der Anzahl apoptotischer Zellen. In einer Studie, in der dem Kultivierungsmedium 1000 ng/ml IGF1 zugesetzt wurde, konnte allerdings eine erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen bei gesteigerter Gesamtzellzahl gefunden werden (VELAZQUEZ et al. 2011). Weiterhin zeigte die Supplementation von 100 ng/ml IGF1 im Kultivierungsmedium, dass es zu einer Verminderung der Anzahl an IGF1R-Transkripten um 20 % kommt (BLOCK et al. 2008). 18 Literatur ___________________________________________________________________ Tabelle 2: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Kultivierungsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung Parameter Medium Zellzahl Apoptotische Teilungs- EntwicklungsZellen rate rate BLOCK et al. (2008) 100 ng/ml SOFaa - - - ↑ BONILLA et al. (2011) 100 ng/ml KSOM - - n.s. ↑ BYRNE et al. (2002) 100 ng/ml SOFaa-BSA ↑ ↓ - ↑ MAKAREVICH u. MARKKULA (2002) 100 ng/ml SOFaaci ↑ ↓ n.s. ↑ MATSUI et al. (1997) 200 ng/ml SOFaa n.s. - - ↑ NEIRA et al. (2010) 50 ng/ml SOFaa ↑ - - ↑ PALMA et al. (1997) 100 ng/ml TCM199 - - n.s. ↑ PRELLE et al. (2001) 100 ng/ml SOF+ Polyvinylalkohol n.s. (PVA) - - ↑ SIRISATHIEN u. BRACKETT (2003) 50 ng/ml SOFaa+Citrat ↑ ↓ ↑ ↑ SIRISATHIEN et al. (2003) 50 ng/ml SOFaa+Citrat ↑ - - ↑ VELAZQUEZ et al. (2011) 100 ng/ml SOFaa n.s. n.s. n.s. ↑ Autor VELAZQUEZ et al. SOFaa ↑ ↑ n.s. ↑ (2011) 1000 ng/ml n.s. = nicht signifikant; ↑ = signifikant gesteigert; ↓ = signifikant reduziert; - = nicht untersucht SOFaa = synthetic oviduct fluid with amino acids KSOM = potassium simplex optimization medium 19 Literatur ___________________________________________________________________ 2.2.2 Apoptose während der frühen bovinen Embryonalentwicklung Der programmierte Zelltod beschreibt die Steuerung des eigenen Todes einer Zelle über genetisch festgelegte Programme. Im Gegensatz dazu kann die Zelle eines Organismus auch durch ungeregelte Mechanismen, der sogenannten Nekrose sterben. Hierbei kommt es zu einem Zerfall der Zelle durch eine unkontrollierte Volumenzunahme und Ruptur der Zellmembranen. Die zellulären Bestandteile werden freigesetzt und können benachbarte Zellen schädigen und Entzündungsreaktionen auslösen (MAJNO u. JORIS 1995). Dagegen dient der programmierte Zelltod der gezielten Entfernung von einzelnen, abnormalen oder nicht benötigten Zellen, ohne dabei angrenzende Zellen zu beschädigen. Bis heute sind acht verschiedene Formen des Zelltods bekannt, die durch das Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) nach morphologischen Kriterien unterschieden werden (KROEMER et al. 2005). Die bekannteste Form des programmierten Zelltods ist die Apoptose. Dieser Begriff wurde erstmals 1972 eingeführt und lässt sich vom griechischen Wort apoptosis (= Absterben) ableiten (KERR et al. 1972). Apoptose beschreibt den häufig spontan oder als Antwort auf einen physiologischen Stimulus auftretenden programmierten Zelltod einzelner Zellen. Die Definition dieses Vorgangs fand aufgrund morphologischer Veränderungen der Zelle statt und gliedert sich in eine Abfolge mehrerer Schritte (Abb. 6). Zunächst kommt es zum Schrumpfen des Zellvolumens mit Abrundung der Zelle (‚Pyknose‘). Anschließend erfolgt eine Kondensierung des Chromatins und Fragmentierung des Zellkerns (‚Karyorrhexis‘), wobei die DNA durch Endonukleasen in definierte Stücke abgebaut wird. Letztlich zerfällt die Zelle in ‚apoptotische Körperchen‘, die von benachbarten Zellen oder Makrophagen phagozytiert werden (KROEMER et al. 2005). 20 Literatur ___________________________________________________________________ tierische Zelle Pyknose Karyorrhexis Zerfall in apoptotische Körperchen Phagozytose von benachbarten Zellen oder Makrophagen Abbildung 6: Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod. nach WEEDON et al. 1979) Diese Prozesse sind sehr komplex und bedingen eine große Anzahl genetischer Komponenten und Proteine. Als Hauptmediatoren der Apoptose wurden spezifische, hoch konservierte Proteasen, sogenannte Caspasen, entdeckt, deren Aktivierung für die korrekte Durchführung der Apoptose notwendig ist (EARNSHAW et al. 1999). Des Weiteren kam es zur Identifikation von anti- (B-cell lymphoma 2-Familie) und pro-apoptotischen (Bcl2-assoziiertes X Protein) Proteinen, deren Verhältnis zueinander zur Auslösung von Apoptose in Zellen führen kann (WYLLIE 1995). 21 Literatur ___________________________________________________________________ In der frühen Embryonalentwicklung tritt Apoptose als physiologischer Prozess auf, um eine normale Entwicklung zu garantieren und geschädigte oder fehlerhafte Zellen zu entfernen (MATWEE et al. 2000). Allerdings wird auch der Arrest in der Entwicklung boviner Embryonen mit Vorgängen der Apoptose verbunden (ANTUNES et al. 2010). Im Stadium der Blastozyste findet zudem eine Regulierung der Zellzahl mittels Apoptose statt (FABIAN et al. 2007). Die wichtigste Methode zur Darstellung von Apoptose ist die mikroskopische Analyse von Zellkernen mit Hilfe spezifischer Färbungen, wie die TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling) – Analyse. Diese In-situ-Färbung von DNA-Brüchen in Zellkernen basiert auf der Bindung markierter dUTP (deoxyuridin) gekoppelt an terminale TdT (deoxynucleotidyl transferase) an freie 3`-OH Enden der DNA, welche aufgrund von Fluoreszenz sichtbar gemacht werden (GAVRIELI et al. 1992). Allerdings ist diese Untersuchung kritisch zu beurteilen, da eine Unterscheidung zwischen nekrotischen und apoptotischen Zelluntergängen nur bedingt möglich ist. Bei TUNEL-positiven Nuclei, die keine apoptotische Morphologie aufweisen, kann eine Ursache für den Zelltod auch Nekrose sein (GJORRET et al. 2003). Des Weiteren kann durch die Untersuchung der Genexpression der aktiven Caspasen eine Aussage über den Grad an Apoptose getroffen werden. Sowohl auf mRNAEbene, als auch auf Proteinebene lässt sich insbesondere die Caspase 3 als Apoptosemarker gut darstellen. Jedoch kommt es hier zu widersprüchlichen Ergebnissen, die auf eine Aktivität von Caspase 3 ohne Apoptose hinweisen (GJORRET et al. 2007). In Eizellen und frühen embryonalen Stadien bis zum 8-Zellstadium wurde bisher keine Apoptose beobachtet. Gründe dafür könnten das Fehlen bestimmter Transkripte, wie beispielsweise das für das BCL2-assoziierte X Protein (BAX) sein, die für die Induktion der Apoptose notwendig sind und erst nach Aktivierung des embryonalen Genoms exprimiert werden (MATWEE et al. 2000). Ein erster Nachweis von Apoptose während der Embryonalentwicklung des Rindes erfolgte in vitro zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium, während in vivo erstmals bei Stadien mit mindestens 21 Zellen Apoptose zu verzeichnen war (GJORRET et al. 2003). In bovinen Blastozysten kommt es zu einem Anstieg der Menge apoptotischer Zellen, 22 Literatur ___________________________________________________________________ die sich hauptsächlich in der Inneren Zellmasse lokalisieren (BYRNE et al. 1999). Blastozysten aus einer In-vitro-Kultivierung weisen dabei eine größere Anzahl apoptotischer Zellen im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen auf (MATWEE et al. 2000, GJORRET et al. 2003). Bei der Gegenüberstellung der Anzahl apoptotischer Zellen in parthenogenetischen und in vitro fertilisierten Embryonen wurden in den parthenogenetischen Embryonen mehr apoptotische Zellen bei einer insgesamt niedrigeren Zellzahl registriert (NEUBER et al. 2002). Auch die Zeit der Entwicklung spielt eine wichtige Rolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass in sich schnell teilenden Embryonen weniger apoptotische Zellen als in sich langsam teilenden vorkommen (BYRNE et al. 1999, GUTIERREZ-ADAN et al. 2004). Das Kultivierungsmedium hat ebenfalls einen entscheidenden Einfluss auf das Vorkommen von Apoptose in Embryonen. So zeigt sich beispielsweise ein größeres Vorkommen von Zelltod in bovinen Blastozysten, die aus der Kultivierung mit Serum stammen (BYRNE et al. 1999). Ebenso zeigen Kumuluszellen während der Eizellreifung in vitro Anzeichen von Apoptose. Im Durchschnitt weist ein kompakter Cumulus oophorus weniger als 15 % apoptotische Zellen auf (WARZYCH et al. 2013). Allerdings konnte eine negative Korrelation zwischen der Entwicklungskompetenz der Eizelle und der Anzahl apoptotischer Zellen in ihrem Cumulus oophorus entdeckt werden (YUAN et al. 2005). Kumuluszellen, die entwicklungskompetente Eizellen umschlossen, wiesen dabei ein höheres Level an Apoptose auf und zeigten ein verändertes Genexpressionsmuster (JANOWSKI et al. 2012). Allerdings ist der Grad der Apoptose weder verbunden mit der Morphologie, noch mit dem Maturationsstadium der Eizelle (WARZYCH et al. 2013). Die Maturationsbedingungen bewirken auch hier Unterschiede in der Ausprägung von Apoptose, so reduziert eine Maturation mit Serum beispielweise die Apoptoserate in Kumuluszellen im Vergleich zur Reifung ohne Serum (IKEDA et al. 2003). Insgesamt kann die Untersuchung von Apoptose Auskunft über physiologische Prozesse während der Embryonalentwicklung geben, die zu einer verbesserten Qualität und Überlebensrate führen könnten (FABIAN et al. 2007). 23 Literatur ___________________________________________________________________ 2.2.3 Genomaktivierung in bovinen Embryonen Das frühe embryonale Entwicklungsprogramm wird durch maternale Transkripte und Proteine kontrolliert, die bereits während der Oogenese produziert und bevorratet wurden (TELFORD et al. 1990). Erst im 8- bis 16-Zellstadium findet beim Rind die maternal-embryonic transition (MET) statt (Abb. 5). Dieser entscheidende Prozess gliedert sich in den Abbau maternaler Transkripte durch Degradierung und Translation, die Erzeugung neuer, embryo-spezifischer Transkripte und den Austausch durch embryonale Transkripte (TELFORD et al. 1990). maternal embryonal Befruchtung kleine Aktivierung GV MII-Eizelle 2-Zeller Hauptaktivierung 4-Zeller 8-Zeller 16-Zeller Blastozyste Abbildung 5: Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition während der präimplantatorischen Entwicklung boviner Embryonen (mod. nach GRAF et al. 2014) Nach heutigem Wissensstand wird die MET in eine kleine Aktivierung und eine große oder Hauptaktivierung unterteilt (MEMILI u. FIRST 1999). Während der kleinen Aktivierung zwischen dem 2- und 4-Zellstadium kommt es zur Expression von Genen, die an der Transkription, der Translation und dem Transport von RNA beteiligt sind (VIGNEAULT et al. 2009). Später zur Hauptaktivierung zwischen dem 8- und 16-Zellstadium werden Gene exprimiert, die für die Fortführung der embryonalen Transkription und Translation, für die Protein-Ubiquitinierung, sowie für die Einleitung epigenetischer Prozesse verantwortlich sind (GRAF et al. 2014). 24 Literatur ___________________________________________________________________ Im Stadium der Blastozyste werden Gene exprimiert, die zur Regulation der frühen Zelldifferenzierung und des intrazellulären Transports beitragen (GRAF et al. 2014). Diese Vorgänge erfordern eine gut koordinierte Abfolge von nukleären und zytoplasmatischen Prozessen, die gewährleisten, dass eine normale Reprogrammierung der elterlichen Genome erfolgt (LATHAM 1999). Ohne die Aktivierung der embryonalen Transkription ist die Embryonalentwicklung gestört. So zeigte eine Untersuchung, dass Embryonen, deren Transkription mit Hilfe von α-Amanitin inhibiert wurde, sich nur bis zum 8-Zellstadium teilen und nicht weiter entwickeln können, da ab diesem Entwicklungsstadium embryonale Transkripte notwendig sind (BARNES u. FIRST 1991). 25 Literatur ___________________________________________________________________ 2.3 MessengerRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene in bovinen Embryonen Die frühe embryonale Entwicklung ist abhängig von der korrekten Durchführung des genetischen Programms. Dazu zählt sowohl die Transkription der DNA in RNA, als auch die spätere Translation der mRNA in Proteine und die epigenetischen Modifikationen. Ein suboptimales Umfeld des Embryos kann die Transkription der Gene beeinflussen und damit zu einer Veränderung des Proteingehaltes führen. Ein Unterschied zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen wurde im Transkriptionsmuster entwicklungsrelevanter Gene bereits beobachtet (WRENZYCKI et al. 1998). Weiterhin konnte ein Einfluss unterschiedlicher Kultivierungsbedingungen, wie der Zusatz von synthetischen Makromolekülen oder Serum (WRENZYCKI et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, RIZOS et al. 2003), sowie unterschiedlicher Sauerstoffkonzentrationen auf die Genexpression gezeigt werden (HARVEY et al. 2004). Aus diesem Grund ist es möglich, Aussagen über die Qualität von Embryonen zu treffen, da Unterschiede in der Expression einiger Transkripte als Qualitätsmerkmal definiert wurden. Nachfolgend wird auf die Transkription ausgewählter Gene, die an der Signalübertragung von IGF1 (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), am Glukosestoffwechsel (SLC2A1, SLC2A3) und am Vorgang der Apoptose (BAX, BCL2L1) beteiligt sind, näher eingegangen. 2.3.1 Insulin-like growth factor 1 - Rezeptor während der bovinen Embryonalentwicklung Wie bereits unter 2.1.2 beschrieben, findet die Signalübertragung von IGF1 größtenteils durch die Bindung an den membranständigen IGF1R statt. Auf mRNAEbene konnte der IGF1R zuvor in allen präimplantatorischen Stadien der Embryonalentwicklung in vitro und in vivo produzierter Embryonen detektiert werden und wurde daher als Qualitätsmarker definiert (YASEEN et al. 2001). Während 26 Literatur ___________________________________________________________________ dieser frühen Entwicklungsschritte konnte beim Rind eine stadienspezifische Expression des IGF1R beobachtet werden. Dabei zeigte sich, dass die relative Anzahl an Transkripten zunächst vom 2- bis zum 8-Zellstadium signifikant abnimmt und anschließend bis zum Stadium der Blastozyste wieder ansteigt (LONERGAN et al. 2000, YASEEN et al. 2001). Diese Ergebnisse stellen einen Zusammenhang der Genexpression mit den Vorgängen her, die zwischen dem 8- und 16-Zellstadium bei der MET stattfinden. Aus der spezifischen Expression wird ersichtlich, dass die Anzahl maternaler Transkripte aus der Eizelle in frühen Teilungsstadien bis zum 8-Zeller abnimmt, es dann zur Aktivierung des embryonalen Genoms kommt und damit die Transkription wieder ansteigt (YASEEN et al. 2001). Überdies konnte ein Unterschied der IGF1R-Expression zwischen in vivo und in vitro generierten Embryonen nachgewiesen werden. In vivo generierte Blastozysten zeigten eine höhere Anzahl an IGF1R-Transkripten im Gegensatz zu in vitro generierten (BERTOLINI et al. 2002). Im Vergleich zwischen In-vitro-Embryonen zu somatischen Kerntransfer-Embryonen konnte kein Unterschied der Expression gefunden werden (MOORE et al. 2007, SAWAI et al. 2007). Zusätzlich wurde entdeckt, dass die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten in Blastozysten aus IGF1-Kultivierung (100 ng/ml) signifikant geringer war als in denen der Kontrollgruppe (PRELLE et al. 2001, BLOCK et al. 2008). Demnach würden bereits im frühen Embryo die Komponenten des IGF-Systems von exogenem IGF1 gesteuert (PRELLE et al. 2001). Eine mögliche Erklärung der Herunterregulation des Rezeptors ist, dass die embryonale Zellantwort als Reaktion auf das verfügbare IGF1 abgeschwächt wird (BLOCK et al. 2008). 2.3.2 Insulin-like growth factor – Bindungsproteine Die Bindungsproteine des IGF-Systems regulieren, wie zuvor unter 2.1.3 beschrieben, die Aktivität von IGF1 in unterschiedlicher Art und Weise. So verlängern sie beispielsweise die Halbwertszeit von IGF1, helfen beim Transport zu den Wirkungsorten und stimulieren oder inhibieren Effekte von IGF1 auf zellulärer Ebene 27 Literatur ___________________________________________________________________ (JONES u. CLEMMONS 1995). Während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes konnten die kodierenden mRNAs der Bindungsproteine 2 und 3 in allen Stadien bis zur Blastozyste aufgezeigt werden (WINGER et al. 1997). Exogenes IGF1 (100 ng/ml), das der In-vitro-Kultivierung zugesetzt wurde, führte in Rinderembryonen zu einer signifikanten Steigerung der IGFBP3-Expression (BLOCK et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Die embryonale Antwort wird mit einer Reduzierung des verfügbaren IGF1 durch Steigerung der Anzahl an IGFBP3 beschrieben, was letztlich dazu führt, dass mehr IGF1 in seiner gebundenen und damit inaktiven Form vorliegt (BLOCK et al. 2008). Darüber hinaus kommt es zu einer 1,6-fachen Hochregulation der IGFBP2-Transkripte in Blastozysten, generiert mit IGF1-Supplementation in vitro (PRELLE et al. 2001). Weiterhin wurde festgestellt, dass der Zusatz des Lösungsvermittlers DMSO (Dimethylsulfoxid; 14 mM) während der Kultivierung boviner Embryonen zu einer signifikant gesteigerten Expression des IGFBP2 führt (STINSHOFF 2009). Allerdings ist bekannt, dass weder eine Überschuss noch ein Mangel an IGFBP2 einen Effekt auf eine normale embryonale Entwicklung ausüben (PRELLE et al. 2001). 2.3.3 Glukosetransporter Die Familie der Glukosetransporter (GLUT), die heute als Solute Carrier (SLC) bezeichnet werden, ist eine Familie natriumunabhängiger Membranproteine, die den Transport von Glukose entlang eines Konzentrationsgradienten vermitteln. Dabei regulieren die Transporter energieunabhängig den Austausch von Glukose zwischen inner- und extrazellulärer Matrix (OLSON u. PESSIN 1996). Beim Rind sind insgesamt 13 unterschiedliche Isoformen der Glukosetransporter bekannt (JOOST et al. 2002). Die Isoformen setzen sich zusammen aus 12 Transmembrandomänen, den intrazellulär liegenden N- und C-Terminus, einer intrazellulären Schleife und einer extrazellulären Domäne (MUECKLER et al. 1985). Zwischen den verschiedenen Isoformen gibt es Unterschiede hinsichtlich ihrer Kinetik und ihrer Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen auf hormoneller oder metabolischer 28 Literatur ___________________________________________________________________ Ebene (PANTALEON u. KAYE 1998). Die Glukosetransporter Typ 1 (SLC2A1) und Typ 3 (SLC2A3) werden in der frühen bovinen Embryonalentwicklung in allen Stadien exprimiert und wurden daher als Haupttransporter für Glukose im Embryo definiert (AUGUSTIN et al. 2001). Dabei ist die Hauptaufgabe von SLC2A3 der Transport von Glukose aus der Umgebung in den Embryo, während SLC2A1 den Transport an lateralen Membranen des Trophoblasten vermittelt und damit für den interzellulären Transport verantwortlich ist (AUGUSTIN et al. 2001). Vom 2-Zeller bis zur Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der SLC2A1- und SLC2A3Transkriptmenge beobachtet werden (LEQUARRE et al. 1997). Dieser ist dadurch zu erklären, dass der Energiebedarf des Embryos mit vermehrten Furchungsteilungen zunimmt. Die höchsten Anstiege sind dabei mit der Aktivierung des embryonalen Genoms zwischen dem 8- bis 16-Zellstadium und der Kompaktierung des Embryos im Stadium der Morula verbunden (LEQUARRE et al. 1997). Letzteres wurde als das Stadium definiert, in welchem der Embryo von Pyruvat und Laktat auf Glukose als Energiequelle wechselt (RIEGER et al. 1992). Zudem steigt der Energiebedarf des bovinen Embryos in Form von ATP während der Blastulierung an, um damit den erhöhten Bedarf für die höhere Proteinsynthese zu kompensieren (THOMPSON et al. 1996). Beim Vergleich in vivo und in vitro produzierter Embryonen des Rindes konnte ein Unterschied in der Expression von Blastozysten an Tag sieben nachgewiesen werden (WRENZYCKI et al. 2001, BERTOLINI et al. 2002, KNIJN et al. 2002). IVPEmbryonen weisen eine deutlich geringere Transkriptmenge im Vergleich zu In-vivoEmbryonen auf, die nach Meinung der Autoren auf eine reduzierte Viabilität der Invitro-Blastozysten hindeutet (BERTOLINI et al. 2002). Eine höhere Anzahl der SLC2A1-mRNA konnte aber nach Anreicherung des Kultivierungsmediums mit Serum gezeigt werden (WRENZYCKI et al. 1999, WRENZYCKI et al. 2001). Ebenfalls positiv auf die Expression der Glukosetransporter wirkte sich die Supplementation des Kultivierungsmediums mit IGF1 (100 ng/ml) aus und zeigte eine Tendenz, sie zu steigern (VELAZQUEZ et al. 2011). Auch das Geschlecht scheint einen Einfluss auf die Transkription von SLC2A1 auszuüben. So kam es zu einem Anstieg des Vorkommens männlicher Embryonen, wenn Eizellen aus Follikeln 29 Literatur ___________________________________________________________________ mit einer höheren Glukosekonzentrationen (>1,1 mM) stammen (ABELE et al. 2014). Außerdem wurde herausgefunden, dass männliche Embryonen eine deutlich höhere SLC2A1-Transkriptmenge aufweisen als weibliche (LOPES et al. 2007). Dies ist wahrscheinlich auf die schnellere Entwicklung männlicher Embryonen unter In-vitroBedingungen zurückzuführen (AVERY et al. 1991). Zusätzlich konnte ein Einfluss der Sauerstoffkonzentration auf die Expression der Glukosetransporter registriert werden (HARVEY et al. 2004). Es wurde gezeigt, dass die Menge von SLC2A1-mRNA bei einer Kultivierung der Embryonen mit 2 % O2 signifikant geringer ist als bei einer Kultivierung mit 20 % O2. Allerdings ist die Expression der Glukosetransporter nicht nur abhängig von äußeren Bedingungen oder dem Geschlecht, sondern auch von der Qualität der Embryonen. So konnte eine höhere Glukoseaufnahmerate und eine größere SLC2A1-Transkriptmenge in Embryonen von morphologisch guter Qualität aufgezeigt werden (RENARD et al. 1980, WRENZYCKI et al. 2001, HARVEY et al. 2004, LOPES et al. 2007). 2.3.4 Anti-apototische (B-cell CLL/lymphoma 2 like 1) und pro-apoptotische Gene (BCL2-assoziiertes X Protein) der BCL2-Familie Mitglieder der BCL2-Familie spielen eine entscheidende Rolle in der Regulierung von Apoptose. Hierzu zählen sowohl anti-apoptotische Gene, wie z.B. das B-cell CLL/lymphoma 2 like 1 (BCL2L1), deren Synthese das Auftreten der Apoptose verhindert, als auch pro-apoptotische Gene, wie das BCL2-assoziierte X Protein (BAX), deren Transkription die Apoptose in Zellen fördert. In Eizellen und embryonalen Entwicklungsstadien konnten BAX-Transkripte bereits nachgewiesen werden, was auf eine besondere Bedeutung der BCL2-Familie während der bovinen Embryonalentwicklung schließen lässt (MELKA et al. 2010). Im Vergleich zu in vivo generierten Embryonen kam es zur Detektion größerer Transkriptmengen für BAX in In-vitro-Embryonen. Diese deuten auf ein häufigeres Vorkommen der Apoptose in IVP-Embryonen hin (RIZOS et al. 2002). Bei der IVP wird die Expression anti- und pro-apoptotischer Gene zusätzlich durch verschiedene 30 Literatur ___________________________________________________________________ Kultivierungsbedingungen beeinflusst (RIZOS et al. 2002, WARZYCH et al. 2007). So kam es zu einem gesteigerten Vorkommen von BAX-Transkripten nach Kultivierung der Embryonen in SOF-Medium im Vergleich zu solchen aus einer Kultivierung in TCM (RIZOS et al. 2002). Bei der Untersuchung unterschiedlicher Supplementationen (FBS, PVA oder fatty acid free BSA) während der Kultivierung boviner Embryonen wurde jedoch kein Unterschied in der Expression von BCL2L1oder BAX-Transkripten gefunden (WARZYCH et al. 2007). Weiterhin konnte bei einer gezielten Induktion von Apoptose mit Staurosporin keine Veränderung der BCL2L1oder BAX-Transkripte beobachtet werden (VANDAELE et al. 2008). Insgesamt kam es zum Nachweis einer Korrelation zwischen der Qualität und der BAX-Expression, die sich besonders im 4-Zellstadium äußerte (MELKA et al. 2010). Zu diesem Entwicklungszeitpunkt wurden signifikant höhere BAX-Transkriptmengen in Embryonen mit einer schlechteren Morphologie detektiert. Des Weiteren zeigte sich, dass die IGF1-Supplementation keinen Einfluss auf das Vorkommen des antiapoptotischen Gens BCL2L1 ausübt, aber die Expression des pro-apoptotischen Gens BAX steigert. Dabei bewirkt IGF1 jedoch keine Veränderung des Vorkommens von Apoptose, welches mit einer TUNEL-Analyse untersucht wurde (BLOCK et al. 2011). 31 Literatur ___________________________________________________________________ 2.4 Ziele des vorliegenden Projektes Da die Rolle von IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung des Rindes kontrovers diskutiert wird (WATSON et al. 1992, YASEEN et al. 2001), soll die vorliegende Arbeit zur Aufklärung des Einflusses von IGF1 beitragen. Dazu soll das Proteinexpressionsmuster und die -lokalisation des IGF1R anhand verschiedener Methoden (Western blot, Immunfluoreszenzfärbung) in bovinen präimplantatorischen Embryonalstadien untersucht und mit dem stadienspezifischen mRNA-Expressionsmuster verglichen werden. Weiterhin soll der Effekt des Zusatzes einer physiologischen (100 ng/ml) oder supraphysiologischen IGF1-Konzentration (1000 ng/ml) zum In-vitro- Reifungsmedium bei Ab- bzw. Anwesenheit von Apoptoseinduzierern (Actinomycin D und Campothecin) untersucht werden. Dabei wird eine Analyse des Einflusses auf die Gesamtzellzahl, die Lebend-Tot-Ratio und die Anzahl apoptotischer Zellen erfolgen. Außerdem wird mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay) und IRMA (Immunoradiometrischen Assay) untersucht, inwieweit die hinzugegebene Konzentration IGF1 während der Eizellreifung beeinflusst wird. Die Ergebnisse sollen mit Hilfe von Untersuchungen der mRNA-Expression von spezifischen Gentranskripten des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), apoptoserelevanten Transkripten (BAX, BCL2L1) und Transkripten des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) verglichen werden. Damit könnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, ein besseres Verständnis des IGF-Systems und dessen Wirkung auf die Eizellreifung und die frühe Embryonalentwicklung zu erhalten. 32 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3. Material und Methoden Die verwendeten Chemikalien stammten, sofern nicht anders angegeben, von der Firma Sigma Aldrich (Steinheim, Deutschland). Eine Zusammenfassung der verwendeten Geräte und Medien ist im Anhang zu finden. 3.1 In-vitro-Produktion Die In-vitro-Produktion setzt sich aus den drei aufeinanderfolgenden Schritten der Invitro-Maturation, der In-vitro-Fertilisation und der In-vitro-Kultivierung zusammen. 3.1.1 Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe Die Kumulus-Oozyten-Komplexe für die IVP boviner Embryonen wurden aus Ovarien frisch geschlachteter Tiere eines nahe gelegenen Schlachthofes gewonnen. Zum einen handelte es sich hierbei um die VION GmbH (Bad Bramstedt, Deutschland) und zum anderen um den Fleischmarkt Olpe (Olpe, Deutschland). Bei der Auswahl der Ovarien wurde darauf geachtet, dass die Tiere weder krank noch trächtig und die Ovarien frei von Zysten waren. Der Transport der abgetrennten Ovarien zum Labor erfolgte in 37°C warmer PBS Complete in einem Thermobehälter (Duwer, KGW Isotherm, Karlsruhe) in einer Zeit von ein bis zwei Stunden. Dort wurden sie dreimal mit je 350 ml einer auf 37°C erwärmten 0,9%igen Natrium-Chlorid-Lösung gewaschen. Mit Hilfe der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) konnten die Kumulus-Oozyten-Komplexe anschließend aus den Follikeln der Ovarien isoliert werden. Die Ovarien wurden dafür in einer Glas-Petrischale (150 mm), in der sich 100 ml 37 °C warmes PBS Complete befand, durch eine Arterienklemme am Mesovarium fixiert und mit einem Schneideblock bestehend aus zehn dicht nebeneinander liegenden Rasierklingen angeschnitten, um die oberflächlichen und tiefer liegenden Follikel zu öffnen und die KOK freizusetzen. Danach wurde die gewonnene Flüssigkeit durch ein Teesieb in ein 500 ml Becherglas überführt, um 33 Material und Methoden ___________________________________________________________________ größere Gewebeteile aus der Flüssigkeit zu entfernen. Nach einer Sedimentationsdauer von etwa 10 Minuten (min) bei Raumtemperatur wurde der Überstand im Becherglas mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport, Freiburg) bis auf ca. 80 ml abgesaugt und der Bodensatz auf mehrere 15 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) mit einem Volumen von 15 ml verteilt. Nach einer erneuten Sedimentationsdauer von etwa 10 min auf einer Wärmeplatte (minitube, Tiefenbach) bei 37°C wurde das Sediment mit einer Pasteurpipette (Carl Roth, Karlsruhe) in eine große Petrischale (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) überführt und mit PBS Complete aufgefüllt. Die Durchsuchung der Petrischale erfolgte unter einem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg), integriert in einen beheizten Tisch. Das Heraussammeln und Überführen der gefundenen KOK in TCM air (bei Luftsauerstoff pH-stabiles Tissue Culture Medium) erfolgte mit einer 25 µl Glaskapillare und einem Pipettierhelfer (Brand, Wertheim). Dort verblieben sie, bis die Sedimente aller Zentrifugenröhrchen durchsucht wurden, um sie anschließend gemäß ihrer Qualität zu selektieren (KHURANA u. NIEMANN 2000). Durch fünf Kategorien (Tab. 3 und Abb. 7) konnten die KOK ihrer Qualität nach eingeteilt werden, wobei für die weitere IVP nur solche verwendet wurden, die in die Kategorien 1, 2 oder 3 einzuordnen waren. Tabelle 3: Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe Kategorien 1. Kategorie 2. Kategorie 3. Kategorie 4. Kategorie 5. Kategorie Beschreibung Homogenes, dunkles Ooplasma; kompakter drei- bis vierlagiger Cumulus oophorus (Abb. 7: A) Homogenes, dunkles Ooplasma; mindestens eine durchgehende Schicht an Kumuluszellen (Abb. 7: B) Homogenes, dunkles oder helles Ooplasma oder abweichend heterogenes Ooplasma; einzelne anhaftende Kumuluszellen (Abb. 7: C) Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; keine anhaftenden Kumuluszellen (Abb. 7: D) Beschaffenheit des Ooplasmas wie in Kategorien 1 bis 3; deutliche Expandierung des Cumulus oophorus (Abb. 7: E) 34 Material und Methoden ___________________________________________________________________ B A C D E Abbildung 7: Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis 5 (E) 3.1.2 In-vitro-Maturation Die IVP-tauglichen KOK wurden nach der Selektion zufällig in Gruppen von 20 Oozyten zusammengeführt und dreimal in unter Siliconöl befindlichen 100 µl-Tropfen TCM + BSA pipettiert, um Zellreste und das TCM air durch Ausverdünnung zu entfernen. Die so gewaschenen KOK konnten nun in das Reifungsmedium überführt werden, das aus TCM + BSA + Suigonan® bestand und ebenfalls mit Siliconöl überschichtet war. Suigonan® ist eine kommerziell erhältliche Lösung, die sowohl 10 IE Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG), als auch 5 IE humanes Choriongonadotropin pro ml enthält. Für die Supplementationsversuche fand ein ölfreies Kultivierungssystem Verwendung, da einige der eingesetzten Substanzen lipophile Eigenschaften besitzen. Hierzu fanden einzelne Wells einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Anwendung, die mit jeweils 200 µl des Reifungsmediums befüllt wurden. Um einer eventuellen Verdunstung des Mediums vorzubeugen, wurden die einzelnen Wells in eine kleine Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, 35 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Kremsmünster, Österreich), in der sich 1 bis 2 ml destilliertes Wasser befanden, gestellt (Abb. 8). Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner Oozyten Bei den Supplementationsversuchen kam es zu einer zufälligen Aufteilung der KOK in 7 verschiedene Gruppen, mit je 30 Oozyten pro Well. Eine Auflistung der einzelnen Versuchsgruppen ist in Tabelle 4 zu finden. Kumulus-Oozyten-Komplexe, die in Reifungsmedium ohne weitere Zusätze kultiviert wurden, dienten als Kontrollgruppe. Supplementiert wurde sowohl eine physiologische Konzentration (100 ng/ml), als auch eine supraphysiologische Konzentration IGF1 (1000 ng/ml; recombinant human IGF-I, Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland). Um gezielt den Einfluss von IGF1 auf die Unterbindung von Apoptose zu untersuchen, kam es zur Supplementation einer Kombination zweier Apoptoseinduzierer zum Reifungsmedium. Zum einen handelte es sich hierbei um Actinomycin D, zum anderen um S-(+)-Camptothecin (beides von Enzo Life Sciences, Lörrach, Deutschland), die in einer Konzentration von 0,005 µg/ml bzw. 0,01 µg/ml eingesetzt wurden. Da diese Komponenten in dem Lösungsvermittler DMSO gelöst wurden, erfolgte die Untersuchung einer weiteren, sogenannten Vehikel-Kontrolle, in der dem Reifungsmedium DMSO in der gleichen Konzentration zugesetzt wurde, wie zum Lösen der Apoptoseinduzierer. Mindestens für eine Stunde vor Verwendung fand eine Äqulibrierung des Reifungsmediums im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2 statt. Die Reifung der KOK erfolgte für 24 Stunden unter einer feuchtigkeitsgesättigten Atmosphäre im CO2-Inkubator (Heracell 150i, Thermo Fisher, Braunschweig) bei 39°C und 5 % CO2. Im Anschluss an die Maturation kam 36 Material und Methoden ___________________________________________________________________ es zur Vorbereitung der Oozyten für die Fertilisierung. Das Maturationsmedium wurde bis zur Messung der IGF1-Konzentration bei -20°C in sterilen 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) gelagert. Tabelle 4: Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen Mediumszusätze während der Maturation boviner Oozyten Versuchsgruppe Kürzel Zusatz Konzentration 1 Kontrolle K - - 2 DMSO D DMSO 12,8 mM Actinomycin 0,005 µg/ml S-(+)-Camptothecin 0,01 µg/ml DMSO 12,8 mM 3 Apoptoseinduzierer A 4 IGF1 100 I 100 IGF1 100 ng/ml 5 IGF1 1000 I 1000 IGF1 1000 ng/ml IGF1 100 ng/ml + Actinomycin 0,005 µg/ml S-(+)-Camptothecin 0,01 µg/ml DMSO 12,8 mM IGF1 1000 ng/ml + Actinomycin 0,005 µg/ml S-(+)-Camptothecin 0,01 µg/ml DMSO 12,8 mM 6 IGF1 100 + Apoptoseinduzierer IGF1 1000 + 7 Apoptoseinduzierer I+A 100 I+A 1000 IGF1 = Insulin-like growth factor 1 DMSO = Dimethylsulfoxid 3.1.3 In-vitro-Fertilisation Für die Befruchtung der gereiften Oozyten wurde tiefgefrorenes bzw. aufgetautes Sperma eines im Vorfeld auf seine IVF-Tauglichkeit getesteten Bullen verwendet. Das Auftauen des Tiefgefrierspermas fand in einem Wasserbad (Memmert, Schwabach) bei 30°C für 30 Sekunden (s) statt. Nach dem Auftauen erfolgte die Beurteilung der Qualität von etwa 5 µl des Spermas unter dem Mikroskop bei 37 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 100-facher Vergrößerung nach den Kriterien Motilität und Morphologie. Anschließend wurden die Spermien auf einen 90-prozentigen Gradienten aus Spermfilter® und Fert-TALP-Gebrauchslösung in ein 2 ml Eppendorfgefäß geschichtet und bei 380 g für 16 min in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert. Danach wurde der Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Es folgte ein Resuspendieren des verbliebenen Restes mit 750 µl Fert-TALPGebrauchslösung und Zentrifugation für 3 min bei 380 g. Im Anschluss wurde der Überstand bis auf etwa 50 µl abgenommen und verworfen. Durch diese Zentrifugation trennten sich die motilen Spermien von den toten und nicht motilen Spermien (ECKERT u. NIEMANN 1995). Daraufhin kam es zu einer Resuspension des Pellets mit 750 µl Fertilisationsmedium, bestehend aus Heparin, Hypotaurin und Epinephrin (HHE), gelöst in Fert-TALP-Gebrauchslösung, um unter anderem die Kapazitation auszulösen. Nachdem die letzte Zentrifugation für 3 min bei 380 g beendet war, wurde der Überstand bis auf etwa 100 µl abgenommen. Es folgte die Beurteilung der Gesamtmotilität und Kapazitation der verbliebenen Spermien bei 100-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop. Die Bestimmung der Spermiendichte fand mit Hilfe der Auszählung einer 1:50 mit destilliertem Wasser verdünnten Spermiensuspension in einer Thoma-Kammer (Carl Roth, Karlsruhe) statt. Dafür wurden beide Seiten der Thoma-Kammer mit je 10 µl verdünnter Suspension befüllt und je 5 Großquadrate des Sichtfeldes ausgezählt. Unter Berücksichtigung der Verdünnung der Spermiensuspension und des Volumens pro ausgezähltem Großquadrat konnte die einzusetzende Menge berechnet werden, welche dem Fertilisationsmedium zugegeben werden musste, um eine Dichte von einer Million Spermien pro Milliliter Medium zu erhalten [einzusetzende Menge Spermien (µl) = (gezählte Spermien x Verdünnung) / (Anzahl Kästchen x Volumen)]. Die gereiften KOK wurden inzwischen dreimalig durch 100 µl Tropfen Fert-TALPGebrauchslösung unter Siliconöl pipettiert und anschließend in 100 µl Fertilisationsmedium unter Siliconöl überführt, das zuvor mindestens eine Stunde im CO2-Inkubator bei 39°C und 5 % CO2 äquilibrierte. Nachdem die Aufbereitung der Spermien abgeschlossen war, wurde die berechnete Menge an Spermien zu den KOK in die Fertilisationstropfen pipettiert. Die Kokultivierung der Spermien und KOK 38 Material und Methoden ___________________________________________________________________ erfolgte für 19 Stunden im Kulturschrank bei 39°C und 5 % CO2 unter feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre. 3.1.4 In-vitro-Kultivierung Im Anschluss an die Fertilisation wurden die vermeintlichen Zygoten in eine kleine Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die 2 ml 37°C warmes TCM air enthielt, überführt. Es folgte die Entfernung der Kumuluszellen, die sogenannte Denudierung unter dem Stereomikroskop (Olympus, Hamburg) durch Verwendung einer Mikropipette mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 135 µm (Stripper®, Gynemed GmbH, Lensahn). Dieser Vorgang ist wichtig für die nachfolgende Kultivierung der Zygoten. Da Kumuluszellen ebenfalls einen Stoffwechsel aufweisen, bei dem Nährstoffe verbraucht werden und Stoffwechselendprodukte entstehen, würde die weitere Kultivierung mit den Kumuluszellen zu einer Nährstoffknappheit und gleichzeitiger Anreicherung von schädlichen Stoffwechselendprodukten im Medium führen. Nach dem Entfernen der Kumuluszellen wurden die vermeintlichen Zygoten durch drei Tropfen TCM air pipettiert und außerdem dreimal in 80 µl Tropfen des Kultivierungsmediums SOFaa unter Siliconöl gewaschen. Anschließend kamen die Embryonen in einer Gruppengröße von sechs in die vorbereiteten 30 µl-Tropfen des Kultivierungsmediums unter Siliconöl und wurden unter feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im CO2-Inkubator bei 39°C, 5 % O2, 5 % CO2 und 90 % N2 für bis zu 8 Tage kultiviert. 39 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.2 Beurteilung der Reifung durch Färbung mit Hoechst 33342 Die Beurteilung des Maturationserfolges fand mit Hilfe einer Hoechst 33342 Färbung, modifiziert nach RACEDO et al. (2008), statt. Dazu wurden die Oozyten nach 22- bis 24-stündiger Reifung zunächst wie unter 3.1.4 beschrieben denudiert und in drei Tropfen einer PVA/PBS-Lösung (0,1 % PVA in PBS) gewaschen. Die Färbung erfolgte in 0,002 % Hoechst 33342 für drei Minuten. Nach einem erneuten Waschschritt in PVA/PBS wurden die Eizellen auf Objektträger (Carl Roth, Karlsruhe) verbracht und mit Vaseline als Abstandshalter mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen. Die Beurteilung der angefärbten Oozyten fand bei 20- bis 40-facher Vergrößerung unter dem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland) durch Einsatz eines UV-Filters (Olympus, Hamburg) statt. Als gereift wurden solche Oozyten klassifiziert, die sich im Metaphase-II-Stadium befanden und eine Metaphasenplatte, sowie ein sichtbares, ausgeschleustes Polkörperchen aufwiesen. Eizellen mit einzeln vorliegenden Chromosomen, die sich noch in der Metaphase-I befanden, galten als unreif. Abbildung 9 zeigt eine beispielhafte Darstellung zur Beurteilung der Maturation. Polkörper Metaphasenplatte Abbildung 9: Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II Stadium angefärbt mit Hoechst 33342; 40 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium Für die Messung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium wurden insgesamt vier kommerziell erhältliche Kits ausgetestet, deren Antikörper alle gegen den humanen IGF1 gerichtet waren (Tab. 5). Zum einen fand die Methode des ELISA Anwendung, die auf dem „Sandwichprinzip“ basiert, bei der die Bindung des zu untersuchenden Antigens an den spezifischen Antikörper mit einem zweiten Antikörper zu einer enzymatischen Farbreaktion führt. Zum anderen wurde ein IRMA verwendet, bei dem das zu untersuchende Antigen mit einem radioaktiv markierten Antigen um die Bindungsstellen am Antikörper konkurriert. Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1 Testbezeichnung Hersteller EIA-4140 UK58011 RIA-4701 A15729 DRG Instruments IBL International DRG Instruments Beckman Coulter Testprinzip Nachweisgrenzen Kreuzreaktivität (ng/ml) ELISA 9,75 – 600,0 ELISA 3,1 – 1137,0 Keine IRMA 23,0 – 1200,0 Keine IGF2 1,02 % Insulin 3,3 % Extrem niedrig IRMA 2,0 – 1200,0 gegen Insulin, Proinsulin, GH, IGF2 ELISA = Enzym-linked Immunosorbent Assay Bei allen Tests wurden die Proben des Maturationsmediums in Eppendorfgefäßen aufgetaut, auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und zentrifugiert. Alle nachfolgenden Schritte fanden bei Raumtemperatur statt. Zunächst fand die Austestung des ELISA IGF-I 600 (EIA-4140, DRG Instruments GmbH, Marburg, Deutschland) nach Herstellerangaben im Hormonlabor der Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Justus-Liebig-Universität Gießen statt. 41 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Dafür wurden zu 200 µl der Proben 20 µl 1N HCl zur Probenansäuerung hinzugegeben und für 15 min inkubiert. Anschließend kam es zum Versetzen der Proben mit 20 µl Neutralisierungspuffer. Dieser Schritt diente der pH-Neutralisierung. Zur Berechnung der Messergebnisse wurde eine vom Hersteller empfohlene Standardreihe mit einem Nullwert und 6 verschiedenen Konzentrationen (5, 10, 50, 150, 300 und 600 ng/ml) angesetzt. Außerdem dienten zwei Proben des Herstellers mit einer Konzentration von 29,5 und 320,3 ng/ml als Kontrollproben. In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich), die mit einem gegen das IGF1-Protein gerichteten Antikörper beschichtet war, wurden 50 µl der zu untersuchenden Proben, sowie der Standardproben und Kontrollen pipettiert. Dort hinzu kamen 100 µl eines Enzymkonjugats, das nach kurzem Schütteln für 2 Stunden inkubierte. Während dieser Zeit kam es zur spezifischen Anlagerung des IGF1 aus dem Medium an die Bindungsstellen des Antikörpers. Anschließend erfolgte die Entfernung des gesamten Inhalts der Platte und ein Ausspülen der Wells mit 200 µl einer Waschlösung. Zum Schluss wurde die Platte ein letztes Mal kräftig auf Saugtüchern ausgeklopft, um die Pufferreste gründlich zu entfernen. Mit der Hinzugabe und Inkubation 100 µl eines Enzymkomplexes für eine Stunde kam es zur spezifischen Anlagerung eines Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Zweitantikörpers an das gebundene IGF1. Es folgte eine Wiederholung des Waschschrittes. Durch die Zugabe von 200 µl des spezifischen Substrates TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin) wurde ein Farbumschlag ausgelöst, der nach einer Inkubation von 30 min mit 100 µl einer schwefelsäurehaltigen Stopplösung angehalten wurde. Die optische Dichte der Proben, Kontrollen und Standards konnte sofort im Anschluss mit Hilfe eines Dynex MRXe Mikrotiterplatten-Photometers (Magellan Biosciences, VA, USA) gemessen und mit dem Programm Magellan Software (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet werden. Anhand der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben berechnet wurden. Der Messbereich dieses Kits lag zwischen 1,29 und 600 ng/ml mit einem Interassaybzw. Intraassay-Koeffizienten von 7,22 bzw. 4,72 %. 42 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Ein weiterer ELISA (IGF-1 ELISA, UK58011, IBL International GmbH, Hamburg, Deutschland) wurde im endokrinologischen Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover unter der Leitung von Juniorprofessorin Dr. Marion Piechotta durchgeführt. Für die Messung kam es ebenfalls zum Ansatz einer Standardreihe mit den Konzentrationen 0, 16, 32, 107, 357 und 1137 ng/ml. Als Kontrollproben dienten zwei Proben des Herstellers, die auf eine Konzentration von 59,2 – 81,8 ng/ml bzw. 158 – 215 ng/ml eingestellt waren. Im Gegensatz zu dem in Gießen durchgeführten Test fand in Hannover zunächst eine Vorbehandlung der Proben statt. Dafür wurden je 100 µl der Proben mit 100 µl Verdünnungspuffer versetzt, 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt und für 10 min inkubiert. Die weitere Vorgehensweise dieses ELISA ist mit dem bereits beschriebenen identisch. Die optische Dichte der Proben, Standards und Kontrollen wurde in Hannover mittels Spectra II (Tecan Group, Männedorf, Schweiz) bestimmt und mit dem Programm Magellan Software ausgewertet. Eine Standardreihe konnte erstellt und die Konzentrationen der untersuchten Proben konnten abgelesen werden. Der Messbereich lag zwischen 10 und 450 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,03 ng/ml. Der Intra-Assaykoeffizient betrug 3,5 % und der InterAssaykoeffizient 8,5 %. Kreuzreaktionen zu IGF2, Insulin und Proinsulin können aufgrund der hohen Spezifität des Antikörpers ausgeschlossen werden. Weiterhin kam es zur Austestung eines IRMA in Gießen (IGF-I RIA, RIA-4701, DRG Instruments GmbH, Marburg, Deutschland). Auch hier wurde für die Bestimmung der IGF1-Konzentration zunächst eine Standardreihe angesetzt. Diese bestand aus einem Nullwert und 5 weiteren Konzentrationen (23, 67, 168, 438 und 1200 ng/ml). Zusätzlich kamen zwei Kontrollproben zum Einsatz, die eine Konzentration an IGF1 von 158 ± 63 ng/ml bzw. 258 ± 77 ng/ml enthielten. Für den Test wurden 50 µl der Proben vorab mit 50 µl einer Pretreatment-Lösung vermischt und für 30 min inkubiert. Anschließend erfolgte die Hinzugabe von 1 ml Verdünnungspuffer. Bei diesem Kit kamen 10 ml Röhrchen zum Einsatz, die mit einem spezifischen anti-IGF1 Antikörper beschichtet waren. Dort hinein wurden sowohl 100 µl der Proben, Kontrollen und Standards pipettiert, als auch 200 µl Tracer-Lösung, die den 125 I-markierten Anti-IGF1-Antikörper enthielt. Zwei unbeschichtete Röhrchen wurden 43 Material und Methoden ___________________________________________________________________ ebenfalls mit der Tracer-Lösung befüllt und dienten der Auswertung der Totalaktivität. In einer zweistündigen Inkubationszeit auf einem Rüttler bei 400 rpm konnte nun das IGF1 in der Probe mit dem radioaktiv markierten IGF1 um die Bindungsstellen des Antikörpers konkurrieren. Anschließend wurde der Inhalt der Röhrchen dekantiert und mit 2 ml Waschlösung ausgespült. Die Röhrchen zur Bestimmung der Totalaktivität waren von diesem Waschschritt ausgenommen. Daraufhin konnten die gebundenen radioaktiv-markierten IGF1 in einem Gammacounter (LB200, Berthold Technologies, Gütersloh, Deutschland) für je 60 s gemessen werden. Anhand der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben abgelesen werden konnten. Ein zusätzlicher immunoradiometrischer Assay (IRMA IGF-1, A15729, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) wurde in den Laboren der Klinik für Rinder getestet. Für die Messung erfolgte ebenfalls der Ansatz einer Standardreihe mit den Konzentrationen 0, 30, 100, 300, 600 und 1200 ng/ml. Als Kontrollprobe diente eine Probe des Herstellers, die auf eine Konzentration von 275 bis 413 ng/ml eingestellt war. Zunächst fand eine Vorbehandlung der Proben und Kontrollen statt. Dafür wurden je 25 µl der Proben und Kontrollen mit 500 µl Dissoziationspuffer versetzt und 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt. Danach kamen nacheinander 300 µl Tracer, und 50 µl der vorbereiteten Proben, Kontrollen und Standards im Doppelansatz in die beschichteten Röhrchen dazu. Ebenso dienten hier zwei weitere Röhrchen dem Nachweis der Totalaktivität der Antikörper und waren nur mit 300 µl Tracer befüllt. Es folgte eine einstündige Inkubation auf einem Schüttler (Peqlab, Erlangen) bei 350 rpm. Der gesamte Inhalt der Röhrchen wurde daraufhin entfernt, indem die Flüssigkeit mit einer Vakuumpumpe (KNF Laboport, Freiburg) abgesaugt und verworfen wurde. Anschließend erfolgte ein Waschschritt der Röhrchen zweimal mit 2 ml Waschlösung. Daraufhin konnte das gebundene radioaktiv-markierte IGF1 in einem Gammacounter (Perkin Elmer, MA, USA) für je 60 s gemessen werden. Die Menge des gemessenen markierten IGF1 war dabei umgekehrt proportional zur Konzentration des IGF1 im Maturationsmedium. Anhand der Messergebnisse der Standardreihe erfolgte die Erstellung einer Standardkurve, aus der die Konzentrationen der untersuchten Proben abgelesen werden konnten. 44 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Der verwendete Antikörper ist höchst spezifisch für IGF1 und zeigt keine Kreuzreaktionen gegen verwandte Moleküle (Insulin, Proinsulin, IGF2 und GH). Die analytische Sensitivität, definiert als Mittelwert minus der zweifachen Standardabweichung des Standards 0, betrug 2 ng/ml. Der Intra-Assaykoeffizient betrug 5,1 % und der Inter-Assaykoeffizient 9,3 %. 3.4 Teilungs- und Entwicklungsraten Die Beurteilung der Entwicklung der Embryonen erfolgte sowohl am 7. Tag als auch am 8. Tag der Kultivierung. An Tag 7 wurde zunächst die Teilungsrate der Embryonen ermittelt, wofür sie aus dem Kulturschrank genommen und unter einem Stereomikroskop auf einer 37°C vorgewärmten Heizplatte beobachtet wurden. Die Anzahl der geteilten Embryonen wurde vermerkt, sodass die Teilungsrate bezogen auf die Anzahl der eingesetzten vermeintlichen Zygoten in Prozent berechnet werden konnte. Außerdem wurde die Anzahl an Embryonen notiert, die sich bereits im Stadium der Morula oder Blastozyste befanden, um die Entwicklungsrate in Prozent zu berechnen. Befanden sich am 7. Tag der Kultivierung bereits Embryonen im Stadium der expandierten Blastozyste, so wurden sie direkt gefärbt oder dreimalig durch 0,1 % PVA/PBS pipettiert und in einem möglichst geringen Volumen in sterilen 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei -80 °C bis zur Analyse in der RT-qPCR eingefroren. An Tag 8 erfolgte eine erneute Begutachtung der Entwicklungsstadien für die Berechnung der Entwicklungsrate von Tag 7 und Tag 8. Waren zu diesem Zeitpunkt geschlüpfte Blastozysten zu sehen, wurden diese in Gruppen von bis zu 10 dreimal in PVA/PBS gewaschen und in sterilen Reaktionsgefäßen bei -80°C für die Western blot – Versuche eingefroren. 45 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.5 Lebend-Tot-Färbung mit Hoechst und Ethidium homodimer Embryonen im Stadium der expandierten Blastozyste wurden in einer Lebend-TotFärbung durch die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33342 und Ethidium homodimer gefärbt (STINSHOFF et al. 2011). Hoechst ist in der Lage intakte Zellmembranen zu überwinden und sich an die DNA anzulagern. Ethidium homodimer kann dagegen nur Membranen passieren, die aufgrund von Zelltod bereits permeabel sind und bindet ebenfalls an die DNA. Für die Färbung wurden die Embryonen zunächst dreimal in 0,1 % PVA/PBS gewaschen und dann für 15 min in 0,01 % Ethidium homodimer in PVA/PBS bei RT unter Lichtausschluss gefärbt. Darauf folgte ein dreimaliges Waschen der Embryonen in PVA/PBS und die Inkubation für 3 min in einer Hoechst 33342 - Lösung mit einer Konzentration von 0,002 % in PVA/PBS. Nach erneutem Waschen in PVA/PBS wurden die Embryonen auf einen Objektträger (Carl Roth, Karlsruhe) übertragen und unter Verwendung von Vaseline als Abstandshalter mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen. Mit Hilfe zweier Kanülen (20 Gauge, B. Braun, Melsungen) wurden die Embryonen unter dem Deckgläschen zerdrückt, sodass alle Zellen in einer Ebene lagen und dadurch besser gezählt werden konnten. Unter dem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland) bei einer 20- bis 40-fachen Vergrößerung mit Hilfe eines Grün- bzw. UV-Filters (Olympus, Hamburg) erfolgte die Beurteilung und Dokumentation der Embryonen mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus, Hamburg) durch Einsatz einer monochromen CCD (chargecoupled device)-Kamera (Olympus, Hamburg). Durch die verschiedenen Farbstoffe konnte zwischen lebenden und toten Zellen unterschieden werden, wobei sich die lebenden Zellen durch Hoechst 33342 blau fluoreszierend darstellten und die toten Zellen durch die Anlagerung von Hoechst und Ethidium homodimer rot. Die Gesamtzellzahl ergab sich aus der Summe beider Auszählungen. Beispielhaft für eine Aufnahme ist in Abbildung 10 ein Embryo dargestellt. 46 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Abbildung 10: Repräsentative Darstellung der Lebend-Tot-Färbung einer expandierten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen (Hoechst 33342); Rot: Tote Zellen (Ethidium homodimer und Hoechst 33342) 47 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.6 Nachweis apoptotischer Zellen durch TUNEL-Färbung Die Darstellung apoptotischer Zellen erfolgte mit einer TUNEL-Analyse, durchgeführt mit dem in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach BYRNE et al. (1999). Dafür wurden die Embryonen am 7. Tag aus dem Kultivierungsmedium entnommen und dreimalig in 100 µl Tropfen 0,1 % PVA/PBS in einer kleinen Petrischale (35 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) gewaschen. Anschließend fand eine Fixierung der Embryonen in 500 µl 4 % Paraformaldehyd für eine Stunde statt, woraufhin sie in PVA/PBS erneut gewaschen wurden. Zur Permeabilisierung der Blastomeren folgte eine Inkubation der Embryonen in 100 µl 0,1 % Triton X-100 in PBS für 30 min. Nach einem Waschen in PVA/PBS konnten die Embryonen in 500 µl der TUNEL-Reaktionslösung überführt und für eine Stunde bei 37°C im Dunkeln gefärbt werden. Bei dieser Inkubation kommt es mit Hilfe eines Substrates zur Anlagerung des TUNEL-Farbstoffes an die DNA, die aufgrund von Apoptose fragmentiert vorliegt. Während für die Positivkontrolle einige Embryonen zunächst in50 µl DNase I (50 U/ml) inkubiert und anschließend in die TUNELReaktionslösung pipettiert wurden, um eine DNA-Fragmentierung auszulösen, fand für die Negativkontrolle eine Inkubation der Embryonen in Abwesenheit von TdT statt, ohne das es nicht zur Anlagerung des Farbstoffes kommen konnte. Im Anschluss wurde die Färbelösung mit PVA/PBS herausgewaschen und alle Zellen der Embryonen mit 100 µl Hoechst 33342 (0,002 % in PVA/PBS) für 3 min bei 37°C gegengefärbt. Nach Entfernen des Hoechst-Farbstoffes durch mehrmaliges Pipettieren in PVA/PBS konnten die Embryonen auf einen Objektträger transferiert und mit 4-5 µl Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, USA) überschichtet werden. Nun wurden sie mit einem Deckgläschen (Carl Roth, Karlsruhe) versehen und dieses durch zwei Kanülen (20 Gauge) angedrückt, sodass sich die Zellen in einer Ebene darstellten und auszählen ließen. Mit Hilfe eines UV-Filters unter dem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland) bei einer 20- bis 40-fachen Vergrößerung wurden die Embryonen angeschaut und durch eine integrierte Kamera (Olympus, Hamburg) fotografiert. Durch Hoechst waren alle Zellen durch eine blaue Fluoreszenz deutlich zu erkennen, während apoptotische 48 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Zellen grün fluoreszierten. Bei Anregung beider Fluoreszenzen erfolgte eine gelbe Darstellung der Zellkerne. Mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus, Hamburg, Deutschland) wurde die Gesamtzellzahl und die Anzahl apoptotischer Zellen ausgezählt. In Abbildung 11 ist beispielhaft eine expandierte Blastozyste zu sehen, die mit Hilfe des TUNEL-Assays spezifisch angefärbt wurde. Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der TUNEL-Färbung einer expandierten Blastozyste; Blau: TUNEL-negative Zellen (Hoechst 33342); Grün: TUNEL-positive Zellen (TUNEL-Reaktionslösung) 49 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.7 MessengerRNA - Analyse mittels RT-qPCR Zur vergleichenden Untersuchung des mRNA-Expressionsmusters von generierten Embryonen, aus Oozyten, die unter unterschiedlichen Maturationsbedingungen kultiviert wurden und von Embryonen für die Analyse der stadienspezifischen Expression des IGF1R erfolgte eine Reverse Transkription mit anschließender quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) nach STINSHOFF et al. (2011). Dafür wurden Tag 7-Embryonen dreimal in 0,1 % PVA in PBS gewaschen und einzeln in silikonisierten 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäßen bei -80°C eingefroren. 3.7.1 Isolierung der mRNA Die Isolierung der mRNA aus Embryonen erfolgte mit dem Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Purification Kit (Life technologies, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt). Zunächst wurde die Dynabeads-Suspension auf einem Vortexer (Peqlab, Erlangen) homogenisiert und je 10 µl pro zu untersuchende Probe in ein Reaktionsgefäß überführt. Es folgte ein Waschen der Suspension mit Hilfe eines Magnetic Particle Concentrators (MPC, Life Technologies, Darmstadt). Dafür wurde das Reaktionsgefäß in den MPC gestellt und 10 s gewartet, bis sich die Dynabeads durch die magnetische Wirkung deutlich sichtbar an einer Seite konzentrierten (Abb. 12). Nun konnte der Überstand abgenommen und durch die gleiche Menge Lysis/Binding-Puffer ersetzt werden. Nach einem erneuten Waschschritt war die Vorbereitung der Dynabeads abgeschlossen und es wurde mit der Isolierung der mRNA aus den Proben begonnen. 50 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit Dynabead-Lösung (Pfeil) Zu Beginn wurden zu jeder zu untersuchenden Probe 150 µl Lysis/Binding-Puffer und als interner Standard 1 µl Kaninchen-Globin-mRNA (1 pg/µl) hinzugegeben, 5 s auf dem Vortexer (Peqlab, Erlangen) geschüttelt, zentrifugiert und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte die Zugabe von je 10 µl der zuvor präparierten Dynabeads zu jeder Probe und Inkubation für 5 min auf einem Thermoschüttler (Peqlab, Erlangen) bei Raumtemperatur, bei der es zu einer Bindung der Dynabeads an den PolyA-Schwanz der embryonalen mRNA kam. Nach diesem Inkubationsschritt wurden die Reaktionsgefäße in den MPC gestellt, der Überstand abgenommen und die Proben mehrmals gewaschen. Dafür wurden die Proben einmal mit 100 µl des Waschpuffers A versetzt und in den MPC gestellt, um den Überstand abzupipettieren. Anschließend folgte eine dreimalige Resuspension der Proben mit 100 µl des Waschpuffers B mit Verwerfung des Überstandes. Nach dem letzten Waschschritt erfolgte die Trennung der mRNA von den Dynabeads mit 11 µl RNase-freiem Wasser (Ampuwa, Fresenius, Deutschland) für 3 min bei 65°C. Im Anschluss an die Eluierung der mRNA wurden die Reaktionsgefäße in den MPC auf Eis gestellt und der Überstand, der nun die isolierte mRNA enthielt, direkt für die Reverse Transkription verwendet. 51 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.7.2 Reverse Transkription Für die RT-Reaktion wurden zunächst zwei Mastermixe für fünf unterschiedliche Ansätze mit Hilfe des GeneAmp® RNA PCR Core Kits (Life technologies, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) pipettiert. Die fünf Ansätze setzten sich zusammen aus dem des Globin-Standards, der Proben und der Negativkontrolle der Reagenzien, bei der Wasser statt RNA eingesetzt wurde (Mastermix I), sowie der Negativkontrolle für Globin und der Negativkontrolle der Proben, bei denen keine RNAse-Inhibitoren und keine Reverse Transkriptase hinzugegeben wurden (Mastermix II) und demnach keine Umwandlung der mRNA in cDNA erfolgte. Nachfolgend dargestellt sind die Mastermixe für eine Platte mit vier Embryonen (Tab. 6). Das Pipettieren der Reagenzien fand stets auf Eis statt. Tabelle 6: Mastermixe für die Reverse Transkription Mastermix I Konzentration Endkonzentration in µl (7fach-Ansatz) Mastermix II in µl MgCl2 50 mM 5 mM 14 12 PCR-Puffer 10 x 1x 14 12 dNTPs 10 mM 1 mM 14 12 Random Hexamers 50 mM 2,5 µM 7 6 RNAse Inhibitoren 20 U/µl 20 U 7 - MuLV-RT 50 U/µl 50 U 7 - Zusatz (6fach-Ansatz) Im Anschluss an das Pipettieren der Mastermixe erfolgte die Vorbereitung der fünf unterschiedlichen Ansätze zusammen mit der präparierten mRNA. Die Ansätze wurden mit Ampuwa auf ein Endvolumen von 20 µl gebracht (Tab. 7). 52 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Tabelle 7: Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem Volumen von 20 µl Zusatz Globin Standard Embryo Neg. Reagenzien Neg. RI/RT Embryo Neg. RI/RT Mastermix I (µl) 9 9 9 - - Mastermix II (µl) - - - 7 7 RNA (µl) 1 10,7 - 0,3 1 Add 20 µl H2O 10 0,3 11 12,7 12 Globin Die Reverse Transkription fand in einem Thermocycler (T1, Biometra, Göttingen, Deutschland) statt und gliederte sich in folgende Schritte: • 10 min bei 25°C • 60 min bei 42°C • 5 min bei 99°C Anschließend wurden die Proben direkt auf Eis gestellt und für die qPCR verwendet. 3.7.3 Quantitative Polymerase-Kettenreaktion Die gewonnene cDNA wurde zur Quantifizierung der Expressionsintensitäten unterschiedlicher Gene in einer qPCR eingesetzt. Untersucht wurden sowohl Gentranskripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3), als auch apoptose(BAX, BCL2) und entwicklungsrelevante (SLC2A1, SLC2A3). Die Primersequenzen der untersuchten Gene sind in Tabelle 8 dargestellt. 53 Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Primer für die RT-qPCR von Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen Position des Amplifikatgröße Datenbanknummer (bp) (NCBI) Primers IGF1R forward CCA AAA CCG AAG CTG AGA AG 1619 reverse TCC GGG TCT GTG ATG TTG TA 1817 IGFBP2 forward GAC GGG AAC GTG AAC TTG AT 466 reverse ACC TGG TCC AAT TCC TGC T 677 IGFBP3 forward AAC TTC TCC TCT GAG TCC AAG C 714 reverse CGT ACT TAT CCA CAC ACC AGC 904 BAX forward TCT GAC GGC AAC TTC AAC TG 301 reverse TGG GTG TCC CAA AGT AGG AG 505 54 BCL2 forward ATG GAG CCA CTG GCC ACA GCA GAA G 514 reverse GTT GCG ATC CGA CTC ACC AAT ACC 820 SLC2A1 forward CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC 894 reverse CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT 1151 SLC2A3 forward ATC CCT GTG GTC CTT GTC TG 295 reverse GAT AAT CAG TCG GCC CAA GA 496 Globin forward GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT 241 reverse GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT 555 199 NM_001244612 212 NM_174555.1 210 NM_174556.1 205 NM_173894 307 NM_001077486 256 M60448 202 NM_174603 257 X04751 Material und Methoden Primersequenz (5‘-3‘) Gen Material und Methoden ___________________________________________________________________ Die qPCR wurde mit dem kommerziell erhältlichen Kit iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, CA, USA) durchgeführt, dessen Mastermix sich aus Reaktionspuffer, dNTPs, iTaq DNA Polymerase, MgCl2, SYBR Green I und Fluoreszein zusammensetzt. Pro eingesetztem Primerpaar wurde ein Ansatz auf Eis pipettiert, der aus dem Mastermix und dem jeweiligen Primerpaar bestand (Tab. 9). Tabelle 9: Ansätze für die qPCR Zusatz Endkonzentration Mastermix in µl Mastermix 1x 10 Primer forward 0,2 µM 0,4 Primer reverse 0,2 µM 0,4 Nachdem der Mastermix auf die einzelnen Wells von sogenannten Einzelstreifen (single stripes, Biozym, Hessisch Oldendorf) verteilt wurde, konnte die cDNA hinzugefügt und auf ein Endvolumen von 20 µl mit Ampuwa aufgefüllt werden. Abhängig von der Expressionsintensität des jeweiligen Gens wurde die eingesetzte Menge an cDNA, als sogenanntes Embryonenäquivalent (EA), angepasst. Die einzelnen Äquivalente sind in Tabelle 10 aufgelistet. Tabelle 10: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte Embryonenäquivalent Embryonenäquivalent (einfacher Ansatz) (doppelter Ansatz) IGF1R 0,1 0,2 IGFBP2 0,05 0,1 IGFBP3 0,1 0,2 BAX 0,025 0,05 BCL2 0,025 0,05 SLC2A1 0,1 0,2 SLC2A3 0,025 0,05 Globin 0,05 0,1 Gen 55 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Nachdem alles in die Wells pipettiert worden war, konnten diese mit Deckeln versehen und direkt in einen Thermocycler mit integrierter Real-time Einheit (Bio-Rad C1000 mit CFX96, Bio-Rad Laboratories GmbH, München) verbracht werden. Das qPCR-Programm startete zunächst mit einem 10minütigen Denaturierungsschritt bei 95°C bevor sich 43 Zyklen anschlossen, die sich wie folgt zusammensetzen: • 15 s bei 95°C • 30 s bei 60°C • 30 s bei 72°C Während dieser Zyklen kam es zu einer Anlagerung sequenzspezifischer Primer an die cDNA und einer Interkalation des SYBR Green Farbstoffes an die resultierende doppelsträngige DNA. Durch die kontinuierliche Messung der Fluoreszenz nach jedem Zyklus konnte die DNA quantifiziert werden. Die Verifizierung der PCRProdukte erfolgte mit Hilfe einer Schmelzkurve, die der Cycler durch schrittweise Erhöhung der Temperatur um 0,5°C von 55°C auf 95°C erstellte. Für die Quantifizierung der spezifischen mRNA-Expression wurden zunächst die Schwellenwerte (Threshold Cycle, ct) der einzelnen Embryonen mit den ct des internen Standards Globin zu einem Δct verrechnet [∆ct (Globin) = ct (Globin) Standard (50 fg) - ct (Globin) Embryo]. Des Weiteren erfolgte die Berechnung des ∆ct der einzelnen Gentranskripte (Gene of interest, GOI) zu einem ∆ct [∆ct (GOI) = ct (GOI) – ct (Globin) Embryo]. Zum Schluss wurde die Tageseffizienz (E) des Standards und des GOI mit den ∆cts verrechnet, um eine relative Häufigkeit (fold difference, FD) zu erhalten [FD = E(GOI)^-Δct (GOI) / E(Globin)^-Δct (Globin) ] (PFAFFL 2001). Die Untersuchung jedes Gentranskriptes erfolgte mit mindestens 5 Wiederholungen. 56 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.8 Darstellung des IGF1R-Proteins Für den semi-quantitativen Nachweis des IGF1R-Proteins in Embryonen fand die Methode des Western blots Anwendung. Bei einem Western blot werden die Proben mit einer Gelelektrophorese aufgetrennt und danach auf eine Membran übertragen. Schließlich erfolgt die Detektion des zu untersuchenden Proteins durch spezifische Antikörper. 3.8.1 Gelelektrophorese Zunächst erfolgte eine elektrophoretische Auftrennung der Proben mit einer SDSPAGE (sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese) nach LAEMMLI (1970) unter denaturierenden Bedingungen. Hierzu wurden Polyacryamidgele in einer Mini-Protean Tetra Cell Apparatur (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) erstellt. Erst kam es zur Produktion eines 8%igen Trenngels mit einer Geldicke von 1 mm, das mit Isopropanol überschichtet wurde, um ein Zurückbleiben von Luftbläschen an der Oberfläche des Gels zu verhindern. Nach der Polymerisation des Gels folgte die Entfernung des Isopropanols und Trocknung der Kammer mit Whatmanpapier (Sigma Aldrich, Steinheim). Das Sammelgel wurde auf das Trenngel gefüllt und ein Teflonkamm zur Formung der Ladungstaschen eingesetzt. Nach dem Auspolymerisieren des Sammelgels kam es zur Positionierung des Gels in der Gelelektrophoresekammer und Befüllung mit SDS-Laufpuffer. Jetzt konnte der Kamm entfernt und das Gel mit den Proben und einem entsprechenden Größenstandard (Marker) beladen werden. Zum Austesten der unterschiedlichen Antikörper wurden gefrorene Gewebebiopsien boviner Leber, Kotyledone, Karunkel und humaner Plazenta als Kontrollen verwendet und Gruppen von jeweils 10 eingefrorenen Embryonen genutzt. Das Gewebe wurde zum einen am Schlachthof gewonnen und wurde zum anderen von der Frauenklinik Hannover zur Verfügung gestellt. Um einen Aufschluss der Zellen zu erreichen, wurde eine Lyse durchgeführt. Der dafür angefertigte Puffer bestand aus Boehringer Lysepuffer und den Inhibitoren 57 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Leupeptin, AEBSF (4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid), Pepstatin und Phosphatase-Inhibitoren (Phosphatase Inhibitor Cocktail 2). Anschließend konnten die Proben mit 4x SDS-Probenpuffer verdünnt und für 5 min auf 95°C erhitzt werden, um eine vollständige Denaturierung der Proteine zu erreichen. Nach einer 10 sekündigen Zentrifugation bei 400 g wurden die Proben auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese im SDS-Laufpuffer erfolgte bis zum Einlaufen der Proben in das Trenngel bei 100 V. Danach wurde die Spannung auf 150 V erhöht und bei Erreichen des Gelendes nach etwa einer Stunde gestoppt. 3.8.2 Western blot Nach der Gelelektrophorese erfolgte die Übertragung der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Sigma-Aldrich, Steinheim) mit einer Porengröße von 0,45 µm durch einen Western blot. Hierzu fand anfangs eine 10 minütige Äquilibrierung des Gels und der Membran in Blotpuffer statt. Anschließend folgte der Aufbau des Blots. Es wurden zwei Whatmanpapiere luftblasenfrei auf die Kathode aufgebracht, gefolgt von dem Gel, der Nitrocellulosemembran und zwei weiteren Whatmanpapieren. Als zusätzliche Schicht auf jeder Seite kam ein Fiberpad zum Einsatz. Unter Berücksichtigung der Polung wurde der Aufbau fest in die MiniTransblot-Zelle eingesetzt und die Kühlung auf Raumtempertur durch ein Kühlaggregat im Behälter gewährleistet. Die Blotdauer betrug eine Stunde bei 100 V. Auf den Blot folgte das Blockieren der Membran in 5 % Magermilch, gelöst in TBS-T (Tris-buffered Saline-Tween) für 45 min bei Raumtemperatur. Zur Immundetektion wurde nun der primäre Antikörper hinzugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T erfolgte eine einstündige Inkubation mit dem Sekundärantikörper bei Raumtemperatur. Als Sekundärantikörper fand ein Meerretichperoxidase (HRP) gekoppelter Antikörper Anwendung. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 10 min mit TBS-T und einmaligem Waschen für 10 min mit TBS wurde das Zweikomponentensubstrat (Thermo Fisher Scientific) für 3 min über die Membran gegeben. Die an den 58 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Zweitantikörper gekoppelte HRP katalysierte die Umsetzung von Luminol im Substrat in seine oxidierte Form, bei der eine Chemilumineszenz sichtbar wird, die detektiert werden kann. Die Detektion erfolgte mittels eines Chemilumineszenz-Imagingsystem (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland). 3.8.3 Ladungskontrolle zur semi-quantitativen Auswertung der Proteinmenge Für die Kontrolle des korrekten Ablaufs und zur semi-quantitativen Auswertung des Western blots erfolgte eine Redetektion der Nitrocellulosemembran mit einem Antikörper, der sich gegen β-Aktin richtet. Als Bestandteil des Zytoskeletts gehört β-Aktin zu den sogenannten Housekeeping-Proteinen und kommt in allen Zellen vor (MASSICOTTE et al. 2006). Die Nitrocellulosemembran wurde zunächst nach der Detektion des IGF1RAntikörpers in TBS-T gewaschen. Für die Entfernung der gebundenen Antikörper, fand eine Inkubation der Membran in Strippingpuffer mit einem pH von 2,2 für 30 min statt. Nach erneutem Waschen in TBS wurden die freien Bindungsstellen für eine Stunde mit 5%iger Magermilchlösung blockiert, bevor es zur Inkubation des β-AktinAntikörpers (sc47778, mouse anti- β-actin, Santa cruz biotechnology, CA, USA) für eine Stunde bei Raumtemperatur kam. Die Behandlung mit dem Sekundärantikörper fand wie zuvor für eine Stunde bei Raumtemperatur statt. Nach drei Waschschritten in TBS-T wurde das Chemilumineszenzsubstrat aufgetragen und die Membran mit Hilfe des Imagingsystems untersucht. 59 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.8.4 Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Rind Im Zuge einer Masterthese (POPPICHT 2010) wurde der Nachweis des IGF1R via Western blot mittels unterschiedlicher kommerziell erhältlicher Antikörper getestet. Es konnte festgestellt werden, dass der Anti-IGF1-Rezeptor-Antikörper (Fa. Thermo Fisher Scientific, MA, USA) zur Detektion eines schwachen Signals in einem Pool von 100 Embryonen führte, das allerdings nicht zu einer quantitativen Auswertung geeignet war (Abb. 13, orange Markierung). Aus diesem Grund wurde für die vorliegende Arbeit ein Peptidantikörper von der Firma Seqlab (Göttingen, Germany) im Kaninchen produziert, der speziell auf die Peptidsequenz der α-Untereinheit des bovinen IGF1R abgestimmt ist (anti-popp IGF1R). Der Peptidantikörper setzte sich aus zwei Peptidsequenzen zusammen, die eine Länge von 16 bzw. 19 Aminosäuren vorweisen und keine Kreuzreaktionen zu anderen Sequenzen zeigen (Abb. 13, rote Markierungen). Zusätzlich zu diesem Antikörper erfolgte die Austestung von drei weiteren kommerziell erhältlichen Antikörpern beim Rind. Der erste Antikörper richtet sich gegen die α-Untereinheit des IGF1R (IGF1Rα, Abb. 13 grüne Markierung), während der zweite (IGF1Rβ, schwarze Markierung) und dritte Antikörper (Anti-IGF1R antibody, blaue Markierung) spezifisch für die β-Untereinheit sind. Die Antikörper wurden zunächst in bovinem Gewebe (Leber und Plazenta) getestet, bevor sie zum Einsatz mit bovinen Embryonen kamen. 60 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure 1-710), weiß: β- Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau: Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929) Getestete Antikörper aus der Masterarbeit (POPPICHT 2010) Anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen, Germany) IGF1Rα (Santa cruz biotechnology, CA, USA) IGF1Rβ (Santa cruz biotechnology, CA, USA) Anti-IGF1R antibody (AVIVA systems biology, CA, USA) 61 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.9 Immunfluoreszenzfärbung des IGF1R Für die Darstellung des IGF1R-Proteins in Embryonen wurde eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt. Dafür kam als primärer Antikörper der spezifisch produzierte Kaninchen-Antikörper der Firma Seqlab zum Einsatz (s. 3.8.4). Der eingesetzte Zweitantikörper war an das Fluorochrom Alexa Fluor 488 gekoppelt und richtete sich spezifisch gegen Kaninchen-Antikörper (goat anti-rabbit IgG-CFL 488, sc-362262, Santa cruz biotechnology, CA, USA). Die Immunfluoreszenzfärbung setzte sich aus vier Schritten zusammen: 1. Vorbehandlung der Embryonen 2. Inkubation des 1. Antikörpers 3. Inkubation des 2. Antikörpers 4. Darstellung und Auswertung der Färbung Mit Ausnahme der Blockierung und Inkubation des Erstantikörpers (4°C) und dem RNase-Verdau (37°C) fanden alle Schritte bei Raumtemperatur statt. Für die unterschiedlichen Inkubations- und Waschschritte fanden Petrischalen (60 mm, Greiner Bio one, Kremsmünster, Österreich) Verwendung. Das Umsetzen der Embryonen fand mit Hilfe eines Strippers® (Gynemed GmbH, Lensahn) mit flexibler Pipettenspitze mit einem Durchmesser von 200 µm statt. Eine Negativkontrolle wurde bei jedem Färbedurchgang mitgeführt, die weder im Erst-, noch im Zweitantikörper inkubierte, um eine Eigenfluoreszenz oder unspezifische Fluoreszenz der Embryonen auszuschließen. Außerdem wurde eine zweite Kontrolle eingesetzt, bei der es nur zur Inkubation mit dem sekundären Antikörper kam, um unspezifische Bindungen nachzuweisen. 62 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.9.1 Vorbehandlung der Embryonen und Inkubation mit dem 1. Antikörper Die Embryonen wurden je nach zu untersuchendem Stadium am 2. bis 8. Tagen der Kultivierung entnommen und dreimal in 100 µl PVP (Polyvinylpyrrolidon) in PBS (1 mg/ml) in einer Petrischale gewaschen. Die Untersuchung von 2-Zellern erfolgte an Tag 2, 4-Zeller an Tag 3 und 8-Zeller an Tag 4 der Kultivierung. Embryonen im 16-Zellstadium wurden an Tag fünf und Morulae an Tag sechs analysiert. An Tag sieben und acht kam es zur Entnahme von Blastozysten und expandierten Blastozysten. Die Färbung begann mit einem Fixierungsschritt der Embryonen in 500 µl 4 % Paraformaldehyd in PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur. Es folgte ein erneutes dreimaliges Waschen in PVP/PBS. Zur Permeabilisierung kam es zur Inkubation der Embryonen für eine Stunde in 500 µl 0,1 % Triton-X 100 in PBS. Nachdem sie erneut dreimal in PVP/PBS gewaschen wurden, folgte ein Blockierungsschritt, in dem unspezifische Bindungsstellen mit 500 µl 3 % BSA in PBS für eine Stunde blockiert wurden. Jetzt konnte mit dem 1. Antikörper inkubiert werden. Dafür kamen 500 µl des spezifisch produzierten anti-popp IGF1R in einer Verdünnung von 1:100 in 3 % BSA/PBS über Nacht bei 4°C in einer Feuchtekammer zum Einsatz, um eine mögliche Verdunstung zu verhindern. 3.9.2 Inkubation mit dem 2. Antikörper, Zellkernfärbung und Darstellung der Färbung Nach Ende der Inkubation mit dem 1. Antikörper wurden die Embryonen dreimal in 3 % BSA/PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. Im Anschluss erfolgte die Verdünnung des sekundären Antikörpers 1:200 in 3 % BSA und Inkubation in 500 µl für 2 Stunden im Dunkeln. Nach dem Waschen in BSA/PBS kam es zum RNase-Verdau für eine Stunde im Dunkeln bei 37°C in 50 µl einer 50 µg/ml RNase A-Lösung. Die Zellkernfärbung fand mittels 100 µl Propidiumiodid in einer Konzentration von 25 µg/ml für 5 min im Dunkeln statt. Nach Entfernen des PI 63 Material und Methoden ___________________________________________________________________ durch dreimaliges Waschen in PVP/PBS wurden die Embryonen auf einen Objektträger gebracht und mit 4-5 µl Vectashield überschichtet. Die Darstellung der Immunfluoreszenzfärbung erfolgte direkt im Anschluss an die Färbung bei 10-facher Vergrößerung mit einem Blau-Filter bzw. Grün-Filter (Olympus, Hamburg) an einem Fluoreszenzmikroskop (IX73, Olympus, Hamburg, Deutschland). Die Auswertung fand mit der Aufnahme- und Auswertesoftware CellSens Dimension (Olympus, Hamburg, Deutschland) statt. Zunächst wurde für jeden Embryo ein Bild zur Darstellung der Zellkerne und ein Bild zur Darstellung der Immunfluoreszenz mit Hilfe einer am Mikroskop integrierten Kamera aufgenommen. Zusätzlich konnte für jeden Embryo eine Aufnahme der Immunfluoreszenz in Graustufen erstellt werden, um an dieser die Verteilung der Graustufenintensitäten zu messen (TOLIVIA et al. 2006). Dazu wurde die Fläche umfahren, die von den Blastomeren eingenommen wurde und die Intensität aller Graustufen dieser Fläche erfasst. Von diesem Wert konnte die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz abgezogen werden, die sich durch Umfahren einer kreisrunden Fläche am Rand ergab, die in etwa der Größe des Embryos entsprach. Der so korrigierte Wert wurde daraufhin für den Vergleich der Fluoreszenzintensitäten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien verwendet. Eine beispielhafte Auswertung eines Graustufenbildes ist in Abbildung 14 dargestellt. 64 Material und Methoden ___________________________________________________________________ Abbildung 14: Repräsentative Darstellung einer beispielhaften Auswertung der relativen Signalstärke der IGF1R-Fluoreszenz einer expandierten Blastozyste 3.10 Statistische Auswertungen Für die statistischen Auswertungen wurde die Software SigmaStat 3.5 genutzt (Fa. Systat Software GmbH). Dabei wurde zunächst auf die Normalverteilung der Werte mit Hilfe eines Kolmogorov-Smirnov-Tests geprüft. Anschließend fand für alle Untersuchungen eine einseitige Varianzanalyse (One-way ANOVA) mit anschließendem Tukey-Test statt. Unterschiede von P ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Unterschiede mit P ≤ 0,07 galten als Tendenz. 65 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.11 Allgemeiner Versuchsaufbau 3.11.1 Einfluss der Supplementation unterschiedlicher IGF-1 Konzentrationen In der nachfolgenden Grafik sind die Abläufe der Versuche zur Supplementation von IGF1 während der Oozytenreifung schematisch dargestellt. 66 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 3.11.2 Vergleichende Untersuchung der Expression des IGF1R Das nachfolgende Schema stellt die Einzelheiten zum Versuchsaufbau für die vergleichende Untersuchung der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene dar. 67 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4. Ergebnisse 4.1 Ermittlung der Teilungs- und Entwicklungsraten Während der Zeit von Februar 2011 bis einschließlich Juni 2012 wurden im Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Embryonen in vitro produziert. In 60 Durchgängen wurden insgesamt 4800 Kumulus-OozytenKomplexe gewonnen und in der IVP eingesetzt (Tab. 11). Mit einer durchschnittlichen Teilungsrate von 57,4 ± 1,8 % und einer Entwicklungsrate von 27,6 ± 1,7 % an Tag acht entstanden insgesamt 1325 Embryonen, die in Gruppen von bis zu 10 Embryonen bei -80°C für die Western blot – Analysen gelagert wurden. Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVPVersuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - Versuche Raten [%] Anzahl [n] (MW ± SD) KOK in der IVC 4800 Teilung 2755 57,4 ± 7,3 Entwicklung Tag 8 1325 27,6 ± 8,1 Durch den Ortswechsel der Arbeitsgruppe an die Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere der Justus-Liebig-Universität Gießen im Jahr 2012, kam es, bedingt durch den Umbau von Laborräumen, zu einer Unterbrechung der Versuche. Im April 2013 begann die routinemäßige Produktion von Embryonen in vitro in den neuen Räumlichkeiten, sodass ab August 2013 die Versuche wieder aufgenommen wurden. In insgesamt 61 Durchgängen wurden 8072 KOK gewonnen, in vitro gereift, befruchtet und kultiviert. Insgesamt teilten sich in der Kontrollgruppe 953 der vermeintlichen Zygoten, was einer durchschnittlichen Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % entsprach. Bis zu Tag sieben entwickelten sich 68 Ergebnisse ___________________________________________________________________ durchschnittlich 22,1 ± 6,4 % der Embryonen zum Stadium der Morula oder Blastozyste. An Tag acht der IVC stieg die durchschnittliche Entwicklungsrate auf 24,1 ± 8,5 % an. Die Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung Behandlungsgruppe KOK in Teilungsrate Entwicklungsrate Entwicklungsrate während der der IVC [%] Tag 7 [%] Tag 8 [%] Oozytenreifung (n) (MW ± SD) (MW ± SD) (MW ± SD) Kontrolle 1573 60,6 ± 8,1 a 22,1 ± 6,4 a 24,1 ± 8,5 a DMSO 1191 62,2 ± 8,4 a 18,5 ± 8,0 ac 19,6 ± 8,1 ab* Apoptoseind. 1192 59,1 ± 8,1 ab 15,1 ± 7,5 ab 16,8 ± 9,3 ab IGF 100 1010 60,9 ± 8,6 ab 19,5 ± 6,4 ac 19,7 ± 8,8 ab* IGF 100 + Apop. 938 60,2 ± 9,6 ab 13,5 ± 7,4 bc 15,4 ± 8,2 b IGF 1000 1010 55,6 ± 7,3 ab 13,6 ± 6,2 bc 15,9 ± 7,6 ab IGF 1000 + Apop. 1158 52,7 ± 6,9 b 7,9 ± 4,7 b 10,0 ± 4,8 b** a:b:c P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07 Zwischen Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen konnten statistisch signifikante Unterschiede in den Teilungsraten beobachtet werden (P ≤ 0,05). So zeigte sich, dass die Supplementation des Medium mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Teilungsrate signifikant im Vergleich zu Embryonen der Kontroll- und DMSO-Gruppe reduziert. Beim Vergleich der Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung konnten ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen Embryonen einiger Gruppen 69 Ergebnisse ___________________________________________________________________ nachgewiesen werden (Abb. 15). An Tag sieben erreichten Embryonen der Kontrollgruppe eine signifikant höhere Entwicklungsrate als die der IGF1Supplementationsgruppen IGF 100 + Apoptoseinduzierer, IGF 1000 und IGF 1000 + Apoptoseinduzierer. Zudem konnten signifikant mehr Morulae und Blastozysten in der DMSO- und der IGF 100 – Gruppe als in der IGF 1000 + Apoptoseinduzierer beobachtet werden. An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern. Außerdem wurde eine tendenziell reduzierte Anzahl an Morulae und Blastozysten in der Gruppe IGF 1000 + Apoptoseinduzierer im Vergleich zur Gruppe mit DMSO oder IGF 100-Supplementation gefunden (P ≤ 0,07). a ab* a ab* ac ac ab b ab bc ab bc b** b Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05 70 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.2 Bestimmung der Kernreifungsraten Nach 24-stündiger Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe in Maturationsmedium mit unterschiedlichen Zusätzen wurde die Kernreifungsrate bestimmt. Zunächst fand eine mikroskopische unterschieden sich Untersuchung die des einzelnen Cumulus oophorus Versuchsgruppen statt. optisch Dabei in der Kumulusexpansion, wie in Abbildung 16 deutlich zu erkennen ist. KOK der Kontrollgruppe, sowie der Supplementationsgruppen mit IGF in einer Konzentration von 100 ng/ml und 1000 ng/ml wiesen eine deutliche Expansion des Kumulus oophorus auf. Dagegen bewirkte der Zusatz von DMSO eine Reduktion der Kumulus-Expansion (Abb. 16, B). Bei der Maturation mit Apoptoseinduzierern konnte demgegenüber nur eine geringgradige bis keine Expansion identifiziert werden (Abb. 16, C, E, G). B A D Abbildung C E 16: Repräsentative F Illustration G der Kumuluszellexpansion in den unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation; A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000 71 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Im Anschluss an die Kumulusentfernung wurde aus durchschnittlich acht IVMDurchgängen die Maturationsrate von Oozyten der Kontroll- und der einzelnen Versuchsgruppen mit einer Hoechst 33342-Färbung bestimmt. Es konnten unterschiedliche Reifungsgrade registriert werden. Die zu erwartenden Stadien sind beispielhaft in Abbildung 17 dargestellt. A B C Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A: Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II Die Auszählung der Metaphase II-Oozyten nach Färbung mit Hoechst 33342 ergab für die Oozyten der Kontrollgruppe eine durchschnittliche Maturationsrate von 83,5 ± 6,9 %. Beim Vergleich der Maturationsraten von Oozyten aus der Kontrollgruppe mit Oozyten aus den unterschiedlichen Supplementationsgruppen kam es zu einer signifikanten Verringerung der nukleären Maturation in den Versuchsgruppen, denen Apoptoseinduzierer hinzugefügt wurden (Tab. 13). IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml als Zusatz in der Reifung verursachte ebenfalls eine signifikante Abnahme der Maturationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Supplementation mit DMSO bewirkte eine tendenzielle Reduzierung der Anzahl reifer Eizellen (P ≤ 0,07). Hingegen konnte kein Einfluss eines IGF1-Zusatzes von 100 ng/ml zum Maturationsmedium beobachtet werden. 72 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten der unterschiedlichen Versuchsgruppen Maturationsrate [%] KOK in der IVC (n) (MW ± SD) Kontrolle 242 83,5 ± 6,9 a* DMSO 168 72,1 ± 5,4 ab** Apoptoseind. 182 68,5 ± 8,3 b IGF 100 199 75,1 ± 7,1 ab IGF 100 + Apop. 190 69,5 ± 7,3 b IGF 1000 186 70,2 ± 6,0 b IGF 1000 + Apop. 191 70,9 ± 10,9 b a:b P ≤ 0,05; *:** P ≤ 0,07 73 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.3 Untersuchung der IGF1-Konzentrationen im Medium Die IGF1-Konzentration im Maturationsmedium der unterschiedlichen Versuchsgruppen wurde sowohl vor als auch nach 24-stündiger Inkubation in mindestens drei Wiederholungen gemessen. Für die Untersuchung kamen insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits zum Einsatz, die auf zwei Methoden beruhten, ELISA und IRMA. Der erste ELISA, der Firma DRG Instruments GmbH erzielte als Messergebnis Werte zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation und 54,8 und 367,4 ng/ml nach der Maturation. Dabei konnte ein Anstieg der IGF1-Konzentration in allen Proben nach 24-stündiger Maturation gezeigt werden. Dieser Test erzielte als einziger Werte für IGF1 in den Kontrollgruppen, denen kein IGF1 hinzugeführt wurde. Der zweite ELISA (IBL International GmbH) erreichte Messwerte zwischen 837,8 und 1295,3 ng/ml vor Beginn der Maturation für die IGF1-supplementierten Gruppen. Nach 24-stündiger Maturation wurden Konzentrationen zwischen 761,2 und 1416,0 ng/ml gemessen. Die Werte für die Kontroll-, die DMSO- und die Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen hierbei unterhalb der Nachweisgrenze des Tests. Für einige Gruppen konnte ein Anstieg in der IGF1-Konzentration verzeichnet werden, während andere einen Abfall der Konzentration zeigten. Die erwarteten Messwerte von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml in den Gruppen, denen diese Konzentration hinzugefügt wurde, konnten anhand des Tests nicht bestätigt werden. Des Weiteren wurde ein IRMA der Firma DRG Instruments GmbH ausgetestet, der allerdings nicht zu einer Auswertung der Messung führte, da die Werte der Standardkurve nicht linear ausfielen. Mit Hilfe des zweiten IRMA (Beckman Coulter) konnten allerdings Werte erzielt werden, die zu Beginn der Maturation zwischen 18,8 und 30,0 ng/ml in den Gruppen mit IGF1-Zusatz lagen. Nach der Maturation wurden Konzentrationen zwischen 14,6 und 22,3 ng/ml gemessen. Bis auf eine Ausnahme konnte ein Abfall in der IGF1-Konzentration durch die Maturation über 24 Stunden beobachtet werden. Die Werte für die Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe lagen auch hier unterhalb der Nachweisgrenze. 74 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Eine Übersicht aller Ergebnisse ist in Tabelle 14 dargestellt. Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24-stündiger Oozytenmaturation IGF1-Konzentration [ng/ml] (MW ± SD) ELISA IGF-I 600 DRG Instruments Sollwert Kontrolle DMSO Apoptoseind. IGF 100 IGF 100 + IGF 1000 + IBL International vorher IRMA IGF-1 Beckman Coulter nachher vorher nachher (n=5) (n=5) (n=3) (n=3) (n=3) (n=3) - 0,7 ± 0,01 207,5 ± 12,1 na na na na - 4,3 ± 0,4 197,4 ± 1,4 na na na na - 2,2 ± 0,04 54,8 ± 0,9 na na na na 100 15,5 ± 0,2 367,4 ± 10,7 837,8 ± 137,3 938,5 ±194,4 25,8 ± 2,9 22,3 ± 3,3 100 25,0 ± 0,1 147,8 ± 6,6 1044,6 ± 177,4 761,2 ± 101,1 30,0 ± 1,4 20,3 ± 1,5 1000 2,9 ± 0,1 154,1 ± 1,2 1238,5 ± 342,5 1170,7 ± 45,0 29,5 ± 1,7 14,6 ± 1,6 1000 2,1 ± 0,2 133,4 ± 0,1 1295,3 ± 280,0 1416,0 ± 22,0 18,8 ± 8,4 20,9 ± 0,5 Apop. IGF 1000 vorher nachher IGF-1 ELISA Apop. na = nicht auswertbar 75 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.4 Resultate der Lebend-Tot-Färbung Die Zellzahlfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 von expandierten Blastozysten an Tag sieben der Kultivierung (Abb. 18) ergab für Embryonen der Kontrollgruppe eine mittlere Gesamtzellzahl von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste. Dabei lag die Anzahl toter Zellen bei durchschnittlich 7,4 ± 2,4 Zellen pro Blastozyste. Daraus ergab sich für die Lebend-Tot-Zellratio ein Mittelwert von 19,1 ± 6,8. Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen Beim Vergleich expandierter Blastozysten hinsichtlich ihrer Gesamtzellzahl konnte eine statistisch signifikante Reduzierung in Blastozysten aus der Maturation mit IGF1 in einer Konzentration von 1000 ng/ml mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet werden (Tab. 15). Die Untersuchung der Anzahl toter Zellen in expandierten Blastozysten der einzelnen Supplementationsgruppen ergab keine signifikanten Unterschiede. 76 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben Gesamtzellzahl Tote Zellen (MW ± SD) (MW ± SD) Kontrolle (n=16) 134,9 ± 18,6 a 7,4 ± 2,4 DMSO (n=10) 116,8 ± 19,0 ab 10,0 ± 4,4 Apoptoseind. (n=11) 132,8 ± 21,4 ab 11,3 ± 4,9 IGF 100 (n=8) 111,1 ± 21,9 ab 11,8 ± 5,6 IGF 100 + Apop. (n=8) 112,0 ± 9,4 ab 8,1 ± 2,4 IGF 1000 (n=8) 134,4 ± 27,0 ab 9,6 ± 7,8 IGF 1000 + Apop. (n=11) 110,7 ± 20,3 b 10,6 ± 5,1 a:b P ≤ 0,05 Aus der Berechnung der Lebend-Tot-Ratio ging hervor, dass der höchste Wert in der Kontrollgruppe erzielt wurde (Abb. 19). Demnach wiesen Blastozysten aus der Kontrollgruppe die wenigsten toten Zellen im Verhältnis zur Gesamtzellzahl auf. Sowohl der Zusatz von IGF1 (100 ng/ml), als auch IGF1 (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern, führte zu einer signifikanten Reduzierung der Lebend-TotRatio. Weiterhin bewirkte die Supplementation mit DMSO und Apoptoseinduzierern allein eine signifikant geringere Lebend-Tot-Ratio. 77 die mit Ergebnisse ___________________________________________________________________ a ab b ab b b b n=16 n=10 n=11 n=8 n=8 n=8 n=11 Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05 78 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.5 Resultate der Färbung apoptotischer Zellen Bei der Untersuchung von Apoptose in mindestens sechs expandierten Blastozysten pro Supplementationsgruppe wurden mit Hilfe einer TUNEL-Analyse durchschnittliche Gesamtzellzahlen zwischen 127,0 und 143,4 Zellen pro Blastozyste erzielt. In der Kontrollgruppe waren davon durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % der Zellen TUNEL-positiv (Abb. 20, A). Eine Positivkontrolle, bei der Blastozysten mit DNase behandelt wurden, um DNA-Brüche hervorzurufen, lief standardmäßig bei jeder Färbung mit, um die Spezifität des Tests zu garantieren (Abb. 20, B). B A Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNELund Zellkernfärbung; A: Blastozyste der Kontrollgruppe; B: Positivkontrolle einer DNase-behandelten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen; Grün: TUNEL-positive Zelle Das Verhältnis des prozentualen Anteils TUNEL-positiver zu –negativer Zellen ist in Abbildung 21 dargestellt. Es zeigte sich, dass in Embryonen der Gruppe, in der Apoptoseinduzierer allein dem Maturationsmedium zugesetzt wurde, statistisch signifikant mehr TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste vorkamen als in Embryonen der Kontrollgruppe (Tab. 16). Es konnte kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil TUNEL-positiver Zellen zwischen Embryonen der anderen Supplementationsgruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Außerdem war die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in Embryonen der Gruppen, denen IGF1 zugesetzt wurde, im Vergleich zu denen der Gruppen, deren Maturationsmedien neben IGF1 auch Apoptoseinduzierer enthielten, ähnlich. 79 Ergebnisse ___________________________________________________________________ n=14 n=8 n=9 n=10 n=6 n=9 n=7 Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben TUNEL-negative [%] TUNEL-positive [%] (MW ± SD) Kontrolle (n=14) DMSO (n=8) Apoptoseind. (n=9) IGF 100 (n=10) IGF 100 + Apop. (n=6) IGF 1000 (n=9) IGF 1000 + Apop. (n=7) (MW ± SD) 97,9 ± 1,1 2,1 ± 1,1 a 96,8 ± 1,0 3,2 ± 1,0 ab 95,5 ± 2,1 4,5 ± 2,1 b 96,3 ± 1,6 3,7 ± 1,8 ab 95,7 ± 2,1 4,3 ± 2,1 ab 96,0 ± 1,7 4,0 ± 1,7 ab 96,5 ± 1,9 3,6 ± 1,9 ab a:b P ≤ 0,05 80 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.6 Nachweis entwicklungsrelevanter Gentranskripte 4.6.1 MessengerRNA-Expression ausgewählter Gene nach IVM mit verschiedenen Zusätzen Für die Untersuchung der Expression ausgewählter Gentranskripte wurde eine RT-qPCR mit mindestens zwei Wiederholungen durchgeführt. Dabei konnten für das anti-apoptotische Gen BCL2L1 statistisch signifikante Unterschiede in der Expression zwischen Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen nachgewiesen werden. Bei Betrachtung der relativen Transkriptmenge von BCL2L1 wird deutlich, dass das anti-apoptotische Gen in Embryonen aus der Maturation mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen aus allen anderen Supplementationsgruppen signifikant häufiger vorkommt (Abb. 22). a b b n=4 n=3 b b b n=4 n=2 n=5 b n=3 n=2 Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 Für Transkripte des IGF-Systems (IGF1R, IGFBP2, IGFBP4), des Glukosestoffwechsels (SLC2A1, SLC2A3) und für das pro-apoptotische Transkript BAX wurden keine signifikanten Einflüsse der verschiedenen Zusätze während der IVM in expandierten Blastozysten detektiert (Abb. 23 und 24). 81 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM) Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM) 82 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.6.2 Stadienspezifische mRNA-Expression des IGF1R Bei der Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R mit mindestens zwei Wiederholungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten der frühen Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden (Abb. 25). Zu Beginn der Furchungsteilungen, während des 2-Zellstadiums, wurde die größte relative Anzahl an IGF1R-Transkripten gemessen (62,9 ± 24,3). Daraufhin folgte ein Abfall der Transkriptmenge mit einem Minimum im 8-Zellstadium (4,1 ± 2,1). Vom 16-Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der relativen Menge an IGF1R-Transkripten erkannt werden. Dabei wurden signifikante Unterschiede zwischen der mRNA-Expression des IGF1R im 2-Zellstadium und der im 8-Zellstadium entdekt. Des Weiteren wurden signifikant niedrigere Transkriptmengen des IGF1R im 16-Zeller und dem Stadium der Morula im Vergleich zum 2-Zellstadium gezeigt. a ab ab ab b n=3 n=2 b b n=3 n=3 n=5 n=5 n=3 Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 83 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.7 Nachweis der Proteinexpression des IGF1R 4.7.1 Proteinnachweis mittels Western blot In insgesamt 24 Western blot-Analysen mit vier verschiedenen Antikörpern wurden zum Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins 440 Embryonen im Stadium der geschlüpften Blastozyste eingesetzt. Der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R wurde zunächst an Proteinextrakten von bovinem Gewebe getestet. Hierfür wurden Proben aus boviner Leber, Karunkel und Kotyledone verwendet, die nachweislich den IGF1R enthielten (BAUER et al. 1998, FOWDEN 2003). Nach der Lyse der Gewebeproben wurden die Proteinkonzentrationen mittels BCA-Assay bestimmt, sodass eine Menge von 20 µg eingesetzt werden konnte. Als zum wiederholten Mal ein Signal mit korrekter Molekülmasse aufgezeigt wurde, folgte die Durchführung eines Western blots mit bovinen Embryonen (Abb. 26). 1 2 3 4 125 kDa 44 kDa Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4: Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone) In insgesamt acht Wiederholungen konnte kein Signal des IGF1R in einer Gruppe von 50 bovinen Blastozysten beobachtet werden. Auch durch das Heraufsetzen der Anzahl an Embryonen auf 100 pro Versuch konnte der IGF1-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. 84 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Aus diesem Grund wurden drei weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum Nachweis des IGF1R im Western blot getestet. Zunächst erfolgte die Austestung des IGF-1Rα-Antikörpers (santa cruz biotechnology, CA, USA) in bovinen Gewebeproben aus Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta. Im Western blot wurde durch diesen Antikörper ein schwaches Signal in 20 µg Proteinextrakten detektiert (Abb. 27). Allerdings konnte dieses Signal durch Variationen in den Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen nicht verstärkt werden. Eine semi-quantitativen Auswertung des IGF1R-Proteins in insgesamt drei Durchgängen erfolgte deshalb nicht. 1 2 3 4 100 kDa 44 kDa Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta Daraufhin kam ein weiterer Antikörper der Firma santa cruz biotechnology zum Einsatz (IGF-1Rβ Antikörper). Dieser Antikörper wurde ebenfalls eingangs in 20 µg Proteinextrakten aus boviner Leber und Plazenta, sowie in humaner Plazenta untersucht. Nach insgesamt drei Wiederholungen des Western blots konnte nur in der humanen Plazenta ein Signal aufgezeigt werden (Abb. 28). Der Antikörper konnte in bovinen Gewebeproben das Protein des IGF1R nicht nachweisen und wurde daher nicht für den Nachweis in bovinen Embryonen eingesetzt. 85 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 1 2 3 4 200 kDa 44 kDa Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta Als dritter Antikörper kam der Anti-IGF1 Antikörper der Firma AVIVA systems biotechnology (CA, USA) zum Einsatz, der ebenfalls in Proteinextrakten aus Gewebeproben ausgetestet wurde. Nach dreimaligem Wiederholen des Western blots mit Anpassung der Protein- und/oder Antikörperkonzentrationen konnte kein Signal in den Positivkontrollen detektiert werden. Der Antikörper führte nicht zu einem Nachweis des IGF1R in Gewebeproben und wurde daher nicht zum Nachweis in bovinen Embryonen herangezogen. Zusammenfassend konnte mit Hilfe des speziell produzierten Peptidantikörpers anti-popp IGF1R der Firma Seqlab eine qualitative Aussage über das Vorhandensein des IGF1R in bovinen Embryonen getroffen werden. Allerdings konnte weder dieser Antikörper, noch einer der kommerziell erhältlichen zur Quantifizierung des IGF1Rezeptorproteins eingesetzt werden. 86 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.7.2 Proteinnachweis mittels Immunfluoreszenzfärbung Zur Bestimmung der Lokalisation des IGF1R und für die semi-quantitative Auswertung der Graustufenintensitäten in insgesamt 61 bovinen Embryonen unterschiedler Stadien wurde der spezifische Peptidantikörper anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) verwendet. Lokalisiert wurde der IGF1R hauptsächlich in der Plasmamembran der einzelnen Blastomeren, sowie im Zytoplasma (Abb. 29). A C B D F E G Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im 2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot: Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün: spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) 87 Ergebnisse ___________________________________________________________________ Bei der Messung der Graustufenintensitäten konnte eine stadienspezifische Expression des IGF1R beobachtet werden (Abb. 30). Dabei wurde die größte Graustufenintensität im 2-Zellstadium gemessen (1007,8 ± 123,8), woraufhin es zu einem signifikanten Abfall der Signalstärke bis zum 16-Zellstadium kam (417,6 ± 54,3). Das stärkste Fluoreszenzsignal konnte im Stadium der Blastozyste detektiert werden (1319,6 ± 116,3). Es wurde eine signifikant größere Proteinexpression des IGF1R im 2- und 4-Zeller im Vergleich zum 16-Zeller nachgewiesen. Weiterhin kam es zur Detektion eines signifikant höheren IGF1RFluoreszenzsignals in Blastozysten und expandierten Blastozysten im Unterschied zum 16-Zellstadium. a ac a ac bc bc b n=8 n=9 n=8 n=8 n=9 n=9 n=10 Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05 88 Ergebnisse ___________________________________________________________________ 4.8 Vergleich der stadienspezifischen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R Beim Vergleich der mRNA-Expression des IGF1R mit dessen Proteinexpression konnten Übereinstimmungen in der stadienspezifischen Verteilung der Signalstärken herausgefunden werden (Abb. 31). Die jeweils stärkste Expression konnte zu Beginn der Entwicklung im 2- und 4-Zellstadium detektiert werden. Während die relative Anzahl an IGF1R-Transkripten die geringste Intensität im 8-Zellstadium aufwies, zeigte die Proteinexpression ein Minimum im 16-Zellstadium. Bei beiden Untersuchungen konnte daraufhin ein Anstieg der Expression bis zum Stadium der Blastozyste gezeigt werden. F Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein Zehnfaches verringert 89 Diskussion ___________________________________________________________________ 5. Diskussion In den letzten Jahren konnte in der Reproduktionsmedizin eine deutliche Weiterentwicklung biotechnologischer Methoden beobachtet werden, die zu einer gesteigerten Produktion qualitativ hochwertiger Embryonen, vor allem bei der Spezies Rind, geführt hat. Dennoch unterscheiden sich in vitro produzierte Embryonen von ihren in vivo generierten Gegenstücken in vielerlei Hinsicht. So wurden Unterschiede in der Morphologie und im Genexpressionsmuster, sowie in der Einfrierbarkeit und der resultierenden Trächtigkeitsrate nachgewiesen (GREVE et al. 1987, WRENZYCKI et al. 1998). Es fanden bereits zahlreiche Versuche statt, die Qualität der in vitro produzierten Embryonen zu verbessern. Zum einen wurde versucht, die Auswahl der KOK nach morphologischen Kriterien zu standardisieren, da die Entwicklungskompetenz der Oozyte nachweislich die weitere Entwicklung des Embryos bestimmt (LONERGAN et al. 2003). Zum anderen wurde durch die Optimierung des Kultivierungsmediums mit unterschiedlichen Zusätzen versucht, die Qualität der resultierenden Embryonen zu erhöhen (WRENZYCKI et al. 1999, NATALE et al. 2001, WRENZYCKI et al. 2001, RIZOS et al. 2002, LONERGAN et al. 2003). Auch in der Grundlagenforschung findet die IVP boviner Embryonen häufig Anwendung. Dabei werden oft bestimmte Mechanismen nachgestellt, um spezifische Funktionen und Wirkungsweisen von Einflussfaktoren zu untersuchen. So wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe der IVP die Funktion des Wachstumsfaktors IGF1 während der Eizellreifung und frühen Embryonalentwicklung untersucht. Im Detail wurde die Aufgabe von IGF1 in Bezug auf das Auftreten von Apoptose in bovinen Embryonen dargestellt. Weiterhin erfolgte die Untersuchung des Einflusses einer supraphysiologischen Konzentration IGF1. Außerdem wurde untersucht, ob es zu einer Verbesserung der Qualität boviner Embryonen durch den Zusatz einer physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung kommt. Die Qualität der Oozyten und der sich entwickelnden Embryonen wurde mit morphologischen Methoden, wie der Bestimmung der Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsrate, aber auch der Auszählung der Gesamtzellzahl und der Anzahl apoptotischer Zellen ermittelt. Des Weiteren erfolgten Untersuchungen auf molekularer Ebene, wie die 90 Diskussion ___________________________________________________________________ Analyse des Expressionsmusters entwicklungsrelevanter Gentranskripte und das des IGF1R-Proteins. Überdies fand eine vergleichende Analyse des Expressionsmusters des Insulin-like growth factor 1-Rezeptors auf mRNA- und Proteinebene während der frühen bovinen Embryonalentwicklung statt. 5.1 Einfluss einer IGF1-Supplementation auf die morphologische Qualität boviner Embryonen Die in dieser Arbeit erzielten Maturationsraten in Oozyten der Kontrollgruppe von 83,5 ± 2,3 % lagen im Durchschnitt der für die In-vitro-Maturation zu erwarteten Werte von 80 bis 90 % (GALLI et al. 2003). Der Zusatz von IGF1 in einer Konzentration von 100 ng/ml führte nicht zu einer Beeinflussung der Maturationsrate und entspricht bisherigen Untersuchungen, die zu dem gleichen Ergebnis führten (RIEGER et al. 1998, MEIYU et al. 2014). Da reduzierte IGF1-Werte im Blut allerdings nachweislich zu einer Verzögerung der Ovulation in vivo führen (WATHES et al. 2007), wäre es interessant zu untersuchen, inwiefern in vitro der Zeitpunkt der zweiten Reifeteilung durch die Supplementation des Maturationsmediums mit IGF1 beeinflusst wird. Dies könnte in einer nachfolgenden Arbeit durch Untersuchungen der Maturationsstadien zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen. Außerdem stehen die Vorgänge während der negativen Energiebilanz in direkter Verbindung zur Fruchtbarkeit. So konnte gezeigt werden, dass eine geringere IGF1-Produktion in der Leber zu einer reduzierten Verfügbarkeit von IGF1 im Blut führt, was wiederum einen Einfluss auf die GnRH-FSH/LH-Achse ausübt. Damit kommt es direkt zu einer Verschlechterung der Eizellqualität durch Beeinflussung der follikulären Umgebung, was indirekt zu einer Verringerung der Fruchtbarkeit des Rindes führt (ZULU et al. 2002, WATHES et al. 2007). Letztlich beeinflusst die follikuläre Umgebung der Eizelle auch nach einer erfolgreichen Befruchtung die Viabilität des resultierenden Embryos und fördert damit die frühe embryonale Mortalität (BROWN et al. 2009). Ferner kam es in der Gruppe von Eizellen, die 1000 ng/ml IGF1 ausgesetzt waren, zu einer signifikanten Reduzierung der Reifungsrate. Zudem bewirkte die Zugabe 91 Diskussion ___________________________________________________________________ von Apoptoseinduzierern allein, ebenso wie zusammen mit IGF1, eine signifikant geringere Maturationsrate. Diese Ergebnisse in bovinen Oozyten sind bisher die ersten ihrer Art und weisen auf einen negativen Einfluss der Apoptoseinduzierer Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin, sowie der supraphysiologischen IGF1Konzentration auf die nukleäre Maturation boviner Eizellen hin. Weiterhin konnten in Embryonen der Kontrollgruppe durchschnittliche Teilungsraten von 60,6 ± 8,1 % und Entwicklungsraten von 22,1 ± 6,4 % an Tag sieben und 24,1 ± 8,5 % an Tag acht der Kultivierung erzielt werden. Diese Werte liegen im Durchschnitt der zu erwartenden Werte von 20 bis 40 %, die mit dem angewendeten Kultursystem erzielt werden können (RIZOS et al. 2002). Die Supplementation von 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu einer Veränderung der Teilungs- und Entwicklungsraten boviner Embryonen und stimmt mit Ergebnissen aus vorherigen Studien überein (RIEGER et al. 1998, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002, MEIYU et al. 2014). Jedoch konnte ein negativer Einfluss des IGF1-Zusatzes (1000 ng/ml) zusammen mit Apoptoseinduzierern auf die Teilungs- und Entwicklungsrate beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde für das Rind erstmals in der vorliegenden Arbeit gezeigt und bestätigt, dass eine Veränderung der Maturationsbedingungen, die Entwicklungskompetenz der Eizelle negativ beeinflussen kann (LONERGAN et al. 2003). Bisherige Untersuchungen dieser Art beim Rind, aber auch bei der Maus, behandelten vorwiegend den Einfluss einer IGF1- und/oder ApoptoseinduziererSupplementation während der In-vitro-Kultivierung von Embryonen, wo ebenfalls eine negative Beeinflussung der Teilungs- und Entwicklungsraten nachgewiesen werden konnte (FABIAN et al. 2004, BLOCK et al. 2007). Als weiterer Parameter zur Untersuchung der Embryonenqualität wurden die Gesamtzellzahl und das Verhältnis von lebenden zu toten Zellen in expandierten Blastozysten bestimmt. In Embryonen der Kontrollgruppe konnte eine durchschnittliche Gesamtzellzahl von 134,9 ± 4,7 Zellen pro Blastozyste erreicht werden. Auch hier lagen die Werte im Bereich derer, die bereits in anderen Arbeiten veröffentlicht wurden (NEDAMBALE et al. 2004). Erneut zeigte sich allein ein Einfluss der Zugabe von 1000 ng/ml IGF1 mit Apoptoseinduzierern. Dieser Zusatz führte zu einer signifikanten Verringerung der Gesamtzellzahl und zu einer 92 Diskussion ___________________________________________________________________ gesteigerten Anzahl toter Zellen pro Blastozyste, was erneut auf die negative Beeinflussung der Entwicklungskompetenz der Eizelle während der Maturation hindeutet und erstmals auf diese Art untersucht wurde. Die Untersuchung des Auftretens von Apoptose während der frühen Embryonalentwicklung stellt einen weiteren Parameter dar, anhand dessen externe Einflüsse auf in vitro produzierte Embryonen geprüft werden können. Zu diesem Zweck fand die Methode der TUNEL-Analyse Anwendung, die mit Hilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes apoptose-spezifische DNA-Brüche in Zellkernen sichtbar macht. Allerdings ist diese Untersuchung nur bedingt spezifisch für Apoptose, da es auch während des Vorgangs der Nekrose zum Zerfall von DNA kommt. Aus diesem Grund wurde darauf geachtet, dass nur solche Zellen als TUNEL-positiv bezeichnet wurden, die eine apoptotische Morphologie aufwiesen. Eine Supplementation des IVM-Mediums mit 100 ng/ml IGF1 führte nicht zu einer Veränderung des Auftretens von Apoptose in Blastozysten. Dieses Ergebnis bestätigt vorherige Arbeiten mit einem vergleichbaren Versuchsaufbau (MAKAREVICH u. MARKKULA 2002). Allerdings konnten andere Studien zeigen, dass die Anzahl TUNEL-positiver Eizellen und der sie umgebenden Kumuluszellen durch die Hinzugabe von IGF1 deutlich gesenkt wird (KÖLLE et al. 2003, WASIELAK u. BOGACKI 2007). Diese antiapoptotische Wirkung von IGF1 konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Ein Grund dafür könnte sein, dass in diesem Versuchsaufbau ein anderes Kultivierungsmedium verwendet wurde. Nachweislich haben die Medien, in denen die Einzelschritte der IVP stattfinden, einen großen Einfluss auf die Entwicklung und auch das Auftreten von Apoptose (LONERGAN et al. 2003). Die Anzahl TUNELpositiver Nuclei war dagegen in Blastozysten, resultierend aus Oozyten der IVMGruppe mit Apoptoseinduzierern, signifikant erhöht. Dies bestätigt die erwartete Wirkung der Apoptoseinduzierer Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin und ist mit Resultaten bisheriger Studien bei der Maus, beim Hamster und beim Rind zu vergleichen (ALEXANDRE et al. 2000, MATWEE et al. 2000, FABIAN et al. 2004). Gleichzeitig zeigte sich aber kein Einfluss der Apoptoseinduzierer auf die Gesamtzellzahl in Blastozysten, was darauf hindeutet, dass Apoptose in Blastozysten zur natürlichen Regulierung der Zellzahl auftritt (BYRNE et al. 1999, 93 Diskussion ___________________________________________________________________ MATWEE et al. 2000, GJORRET et al. 2003). Beim Vergleich der Embryonen aus den Eizellen der IGF1-Supplementationsgruppen, die mit IGF1 allein oder zusammen mit Apoptoseinduzierern inkubiert wurden, zeigten sich keine Unterschiede in der Anzahl TUNEL-positiver Zellen in expandierten Blastozysten. Damit kann die antiapoptotische Wirkung von IGF1, die in vorherigen Arbeiten definiert wurde, nicht bestätigt werden (BYRNE et al. 1999, MAKAREVICH u. MARKKULA 2002). Hinzu kommt, dass die Entwicklungszeit der Embryonen in diesem Versuch nicht berücksichtigt wurde. Nachweislich beschleunigt IGF1 die Eizellreifung und die sich schneller teilenden Embryonen weisen eine geringere Anzahl TUNEL-positiver Zellen auf (GUTIERREZ-ADAN et al. 2004, WATHES et al. 2007). Diese Art der Untersuchung könnte in einer nachfolgenden Arbeit durchgeführt werden, um zu klären, ob IGF1 auch in vitro eine Beschleunigung der Maturation hervorruft und damit eine Reduzierung der Anzahl apoptotischer Zellen bewirkt. 5.2 Expressionsmuster spezifischer Gentranskripte nach In-vitro-Maturation boviner KOK mit IGF1 Um die Expression spezifischer Gentranskripte in bovinen Embryonen zu untersuchen, wurde die Methode der RT-qPCR gewählt. Diese Methode eignet sich besonders, um den Einfluss externer Faktoren auf spezifische Vorgänge während der Embryonalentwicklung zu detektieren. Allerdings muss bei der Interpretation der Daten darauf geachtet werden, dass eine Relevanz für die Proteinebene nur angenommen und nicht nachgewiesen werden kann (WRENZYCKI et al. 2007). Weiterhin können mittels dieser Methode keine Aussagen über eine Beeinflussung der RNA-Stabilität oder beispielsweise Veränderungen der Poly(A)-Schwanzlänge getroffen werden (WRENZYCKI et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt sieben spezifische Transkripte in expandierten Blastozysten untersucht, die aus einer Eizellreifung mit IGF1 und weiteren Zusätzen resultierten. Davon zeigte das Transkript BCL2L1 signifikante Unterschiede zwischen Embryonen der einzelnen Supplementationsgruppen. Es konnte beobachtet werden, dass in Blastozysten aus 94 Diskussion ___________________________________________________________________ einer Eizellreifung mit IGF1 (1000 ng/ml) und Apoptoseinduzierern die Expression des anti-apoptotischen Transkripts im Vergleich zu allen anderen Embryonen der verschiedenen Versuchsgruppen signifikant gesteigert wurde. Dieses Ergebnis geht einher mit einer signifikant reduzierten Gesamtzellzahl, was darauf hindeutet, dass IGF1 zusammen mit Apoptoseinduzierern die Entwicklung des Embryos beeinflusst, während der Embryo versucht, dies mit einer veränderten Expression des antiapoptotischen Gens BCL2L1 zu regulieren. Gleichzeitig konnte jedoch kein Einfluss auf die mRNA-Expression des pro-apoptotischen Gens BAX oder des Vorkommens von Apoptose in den resultierenden Embryonen gefunden werden. Daher könnte davon ausgegangen werden, dass die Reduzierung der Gesamtzellzahl nicht durch ein gesteigertes Vorkommen von Apoptose ausgelöst wird. Im Vergleich zu den TUNEL-Ergebnissen kann durch den Nachweis der apoptosespezifischen Gentranskripte keine genaue Aussage über das Auftreten von Apoptose getroffen werden. Auch bisherige Studien zeigten, dass sich die Expression dieser Gene nicht zur Analyse von Apoptose in bovinen Embryonen eignete (YANG u. RAJAMAHENDRAN 2002, VANDAELE et al. 2008). Dies wurde in der vorliegenden Studie bestätigt. Nach Zusatz von Apoptoseinduzierern kam es nicht zu einer spezifischen Veränderung der Transkripte von BAX und BCL2L1. Der Insulin-like growth factor 1 – Rezeptor, der als Hauptaufgabe die spezifische Signalweiterleitung von IGF1 hat, zeigte keine veränderte mRNA-Expression durch die IGF1-Supplementation während der In-vitro-Maturation. Anders als zuvor in einer Studie, in der eine physiologische Konzentration von IGF1 (100 ng/ml) zum Kultivierungsmedium hinzugegeben wurde, kam es nicht zu einer Herunterregulation des Rezeptors im Vergleich zu Embryonen der Kontrollgruppe (BLOCK et al. 2008). Des Weiteren wurde nach Supplementation von IGF1 keine veränderte Expression des IGFBP3 gefunden, dessen Hauptfunktion die Bindung von IGF1 darstellt, um es in extrazellulären Flüssigkeiten zu transportieren und es für Gewebe verfügbar zu machen. Dagegen zeigten andere Studien mit IGF1-Zusatz im Kultivierungsmedium, dass die relative IGFBP3-Transkriptmenge signifikant gesteigert wurde (BLOCK et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Die Autoren erklären dieses Vorkommen damit, dass die Bioverfügbarkeit der größeren zur Verfügung stehenden Menge IGF1 95 Diskussion ___________________________________________________________________ dadurch verlängert wird. Allerdings könnte dieses Ergebnis in der vorliegenden Arbeit über die Zeit in der Kultivierung abgeklungen sein. Denn sowohl nach der Maturation, als auch nach der Fertilisierung kam es zu einem Medienwechsel ohne erneute IGF1-Supplementation. In einer weiterführenden Studie könnte durch einen kontinuierlichen Zusatz von IGF1 während der gesamten Kultivierung in vitro dieses Phänomen weiter untersucht werden. Die relativen mRNA-Gehalte für die Transkripte SLC2A1 und SLC2A3, deren Aufgabe der Glukosetransport ist, zeigten keine Unterschiede im Vergleich von Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen. Demnach wurde der Glukosemetabolismus durch die Zugabe von IGF1 und/oder Apoptoseinduzierern nicht beeinflusst. Wie bereits vorherige Studien zeigten, wird die Expression der Glukosetransporter nicht durch ein vermehrtes Vorkommen von IGF1 in der IVP verändert (BLOCK et al. 2008, VELAZQUEZ et al. 2011). Ein Grund dafür könnte sein, dass auch andere Transporter und damit andere Signalwege zur Regulierung des Glukosestoffwechsels genutzt werden (AUGUSTIN et al. 2001). Da bei mehreren untersuchten Transkripten keine signifikanten Unterschiede zwischen Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen nachgewiesen wurde, kann schlussfolgernd zusammengefasst werden, dass die Zugabe von IGF1 in einer physiologischen oder supraphysiologischen Konzentration und/oder Apoptoseinduzierern nicht zur Veränderung der Genexpression spezifischer Transkripte in bovinen Embryonen führt. Dies könnte vor allem an der großen interembryonalen Variabilität liegen. Allerdings könnten sich die Unterschiede, die direkt nach der Eizellreifung aufgetreten sind, auch durch die In-vitro-Kultivierung unter gleichen Bedingungen wieder aufgelöst haben, da keine Unterschiede in den nachfolgenden Teilungs- und Entwicklungsraten auftraten. Neben der Entwicklungskompetenz der Eizelle haben die Kultivierungsbedingungen einen großen Einfluss auf die Qualität der resultierenden Embryonen (RIZOS et al. 2002). Interessant wäre es daher an dieser Stelle, die Beurteilung der Qualität der Eizelle nach Supplementation mit IGF1 und Apoptoseinduzierern auf molekularer Ebene zu untersuchen und mit In-vivo-Oozyten zu vergleichen. 96 Diskussion ___________________________________________________________________ 5.3 Untersuchung der IGF1-Konzentration im Maturationsmedium In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal untersucht, ob die hinzugegebene Menge IGF1 im Maturationsmedium nachweisbar ist und wie sie sich nach 24-stündiger Inkubation verhält. Zunächst kam es daher zu einer Austestung unterschiedlicher Nachweismethoden von IGF1 im Medium. Insgesamt vier verschiedene kommerzielle Kits wurden in zwei unterschiedlichen endokrinologischen Laboren getestet. Bis auf einen Test führten alle Methoden zu einem Nachweis von IGF1 im Medium. Allerdings wurden mit den Tests sehr unterschiedliche Werte gemessen, die nicht mit den hinzugegebenen Konzentrationen von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml IGF1 in den Supplementationsgruppen übereinstimmten. So wurde mit dem ELISA der Firma DRG Instruments GmbH IGF1-Konzentrationen zwischen 0,7 und 25,0 ng/ml vor der Maturation erzielt und ein Anstieg in allen Gruppen auf 54,8 bis 367,4 ng/ml IGF1 nach der Maturation verzeichnet. Die hinzugegebene Konzentration von 100 ng/ml bzw. 1000 ng/ml IGF1 konnte in den jeweiligen Gruppen nicht gemessen werden. Dafür konnte in den Gruppen, denen kein IGF1 hinzugefügt wurde, eine geringe Menge detektiert werden. Dies könnte ein Nachweis des bovinen IGF1 sein, das aufgrund seiner 98-prozentigen Homologie zum human IGF1 ebenfalls vom Test erfasst wurde und durch den Zusatz von BSA ins Maturationsmedium gelangt ist. Mit Hilfe des IRMA (Beckman Coulter) konnte dagegen in den Mediumproben der Kontroll-, DMSO- und Apoptoseinduzierer-Gruppe kein IGF1 nachgewiesen werden. Allerdings zeigten die Medien der IGF1-supplementierten Gruppen ähnlich niedrige Werte. In einer der Supplementationsgruppen konnte ein Anstieg der IGF1Konzentration nach der Maturation verzeichnet werden (IGF1000 + Apoptoseind.), wohingegen die anderen Gruppen einen Abfall aufwiesen. Durch den zweiten ELISA (IBL International) konnte ebenso in den Proben der Kontroll-, der DMSO- und der Apoptoseinduzierer-Gruppe kein IGF1 nachgewiesen werden. In allen anderen Gruppen wurden dafür deutlich erhöhte Werte gemessen, die im Bereich von 837,8 und 1295,2 ng/ml vor Maturationsbeginn lagen und 761,2 bis 1416,0 ng/ml IGF1 nach 24-stündiger Maturation erreichten. 97 Diskussion ___________________________________________________________________ Die sehr breit gestreuten Ergebnisse der einzelnen Kits stellen deren Funktionalität in Frage. Durch den Nachweis der vom jeweiligen Hersteller mitgelieferten Kontrollproben konnte ein Fehler in der Funktionalität jedoch ausgeschlossen werden, da alle Kontrollproben bei der Messung im Rahmen der Nachweisgrenze lagen. Dennoch könnten die Kits nicht spezifisch funktional zum Nachweis des verwendeten human recombinant IGF1 (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) sein. Selbst vor der 24-stündigen Maturation konnte das hinzugegebene IGF1 in einer Konzentration von 100 ng/ml oder 1000 ng/ml nicht mit diesen Tests nachgewiesen werden. Weiterhin könnte die Vorbereitung der IGF1-Lösung und das Ansetzen der unterschiedlichen Konzentrationen in Maturationsmedium einen Einfluss auf die Aktivität des IGF1 ausgeübt haben. Allerdings wurde das verwendete IGF1 nach Herstellerangaben in destilliertem Wasser gelöst, aliquotiert und direkt bei -20°C in sterilen 1,5 ml Eppendorfgefäßen gelagert. Da der Hersteller garantiert, dass durch diese Vorbereitung kein Verlust der Aktivität von IGF1 auftritt, kann ausgeschlossen werden, dass fehlerhaftes Handling zu den Ergebnissen geführt hat. Dennoch bleibt unklar, ob sich die Bearbeitungsschritte negativ auf die Halbwertszeit des IGF1 ausgewirkt haben. Diese beträgt im bovinen Serum nur etwa 2-10 min und verlängert sich nur durch die Bindung an ein IGFBP (ARMSTRONG et al. 2002). Über die Halbwertszeit des rekombinanten IGF1 wurden keine Angaben des Herstellers gemacht und Untersuchungen dazu fanden bisher nicht statt. Andere Arbeitsgruppen, die rekombinantes IGF1 (100 ng/ml) routinemäßig zum Maturationsmedium boviner Oozyten hinzugeben, verwenden ein anderes Produkt (LONG® R3 IGF-I human, I1271, Sigma Aldrich). Dieses führt jedoch hinsichtlich der Maturations-, Teilungs- und Entwicklungsraten zu vergleichbaren Ergebnissen wie in der vorliegenden Arbeit (LAZZARI et al. 2002). Gleichwohl fehlen zu diesem rekombinanten IGF1 Untersuchungen zum Nachweis der tatsächlichen Menge im Medium. Die Problematik im Nachweis von IGF1 im Maturationsmedium könnte daher die kontroversen Ergebnisse bereits veröffentlichter Arbeiten zur Supplementation von IGF1 während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten erklären. So zeigte eine Arbeit eine deutliche Verringerung der Anzahl apoptotischer Zellen in Blastozysten nach der 98 Diskussion ___________________________________________________________________ Hinzugabe von IGF1 zum Maturationsmedium (Wasielak und Bogacki 2007), während in anderen Studien keine signifikanten Unterschiede erzielt wurden (Makarevich und Markkula 2002, Meiyu et al. 2014). Weiterhin lassen sich Untersuchungsparameter die im homogenen Vergleich Ergebnisse der der einzelnen unterschiedlichen Supplementationsgruppen in der vorliegenden Arbeit mit den gemessenen Hormonwerten erklären, denn in den meisten Fällen wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen Embryonen der Gruppen gefunden, was einhergehen würde mit den ähnlichen Werten der IGF1-Konzentration. Allerdings hebt sich eine Gruppe bei fast allen Untersuchungen hervor. Bei Eizellen, die mit Apoptoseinduzierern und einer supraphysiologischen IGF1-Konzentration von 1000 ng/ml maturiert wurden, konnte sowohl bei der Teilungs- und Entwicklungsrate, als auch bei der Maturationsrate, der Gesamtzellzahl, der Lebend-Tot-Zellratio und der Expression des Gens BCL2L1 ein negativer Einfluss der Supplementation gezeigt werden. Dies könnte auf der einen Seite ein Resultat der Apoptoseinduzierer allein sein. Auf der anderen Seite könnte die Kombination von IGF1 mit den Apoptoseinduzierern das Maturationsmedium so verändert haben, dass es einen negativen Einfluss auf die Eizellen ausübt. Damit bleibt unklar, ob die hier erzielten Ergebnisse auf der Wirkung von IGF1 beruhen oder andere Faktoren eine Rolle spielten. Daher sollte in nachfolgenden Studien versucht werden, einen geeigneteren Test zum Nachweis von IGF1 im Maturationsmedium zu finden, um die hinzugegebene Menge IGF1 nachzuweisen und diese im Verlauf der Zeit zu untersuchen. 5.4 Vergleichende Expression des IGF1R in Stadien der frühen Embryonalentwicklung Für den Nachweis von IGF1 während der bovinen Embryonalentwicklung in vitro, wurde die Expression des IGF1R sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene untersucht. Diese eignet sich nachweislich, um eine Aussage über die spezifische Signalweiterleitung von IGF1 zu treffen und als interner Qualitätsmarker in bovinen 99 Diskussion ___________________________________________________________________ und murinen Embryonen (LIU et al. 1997, KOWALIK et al. 1999, LONERGAN et al. 2003). Die Auswertung der mRNA-Expression des IGF1R ergab ein stadienspezifisches Muster. So wurde die größte relative Menge an IGF1R-Transkripten während des 2Zellstadiums detektiert, woraufhin ein signifikanter Abfall der Anzahl an Transkripten zum 8-Zellstadium verzeichnet wurde. Im Anschluss kam es bis zum Stadium der Blastozyste zu einem Anstieg der relativen Transkriptmenge. Dieses Muster entspricht den Vorgängen, die während des maternal-embryonalen Übergangs ablaufen (TELFORD et al. 1990). Zu Beginn der ersten Furchungsteilungen wird das Entwicklungsprogramm des Embryos von maternalen Transkripten und Proteinen bestimmt, die bereits während der Oogenese produziert wurden. Jedoch kommt es schon bald zu einem Abbau und/oder zu einer erhöhten Translation dieser Transkripte (TELFORD et al. 1990). Auch in dieser Arbeit wurde ein Abfall in der Transkriptmenge des IGF1R vom 2- zum 8-Zellstadium beobachtet. Zwischen dem 8- und 16-Zellstadium beginnt die embryospezifische Produktion von Transkripten und Proteinen, sodass es zu einem Anstieg der Transkriptmenge kommt. Dieser Anstieg konnte in der vorliegenden Arbeit zwischen dem 8- und 16-Zellstadium für den IGF1R nachgewiesen werden. Eine weitere Erhöhung der Transkriptmenge wurde zwischen dem Stadium der Morula und der Blastozyste erfasst. Dieser lässt auf eine erhöhte IGF1-Signalweiterleitung des Rezeptors schließen und deutet auf die besondere Funktion von IGF1 während der Kompaktierung und der Bildung der Blastozyste hin. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stimmen mit dem Expressionsmuster aus vorherigen Arbeiten überein und weisen auf eine entwicklungsrelevante Funktion des IGF1-Systems während der frühen Embryonalentwicklung in vitro (YASEEN et al. 2001, LONERGAN et al. 2003). Um diese Resultate mit der Proteinebene zu vergleichen, wurde zunächst nach einem geeigneten Antikörper gesucht, der es ermöglicht, das Protein des Embryos mit der Western blot - Methode zu quantifizieren. In der Literatur wurde diese Methode zwar schon zur Quantifizierung von Proteinen in bovinen Embryonen genutzt, jedoch gibt es bisher noch keine Studien, die sich mit dem Nachweis des Insulin-like growth factor 1 - Rezeptorproteins beschäftigten. Bislang stellte meist die 100 Diskussion ___________________________________________________________________ große Probenmenge, die für einen Western blot benötigt wird, eine enorme Hürde für viele Arbeiten dar, die nicht in Relation mit dem damit verbundenen Arbeitsaufwand steht. Des Weiteren spielte die geringe Verfügbarkeit von kommerziell erhältlichen Antikörpern für die Spezies Rind eine entscheidende Rolle. Dennoch wurden bereits Studien veröffentlicht, in denen eine stadienspezifische Expression entwicklungsrelevanter Proteine in bovinen Embryonen mit einem Western blot erkannt wurde (GALL et al. 2008, VIGNEAULT et al. 2009). In einer vorangegangenen Untersuchung wurde daher die Western blot - Methode zum Nachweis des IGF1R-Proteins etabliert (POPPICHT 2010). In der nun vorliegenden Arbeit konnte an das Ergebnis angeknüpft werden, dass zwar ein geeigneter Antikörper zur Darstellung des IGF1R-Proteins gefunden wurde, dieser sich allerdings nicht zur Quantifizierung des Signals eignete. Aus diesem Grund wurde ein spezifischer Antikörper produziert, dessen größere Spezifität der Quantifizierung des IGF1R-Proteins dienen sollte. Dennoch gelang es auch mit diesem Antikörper nicht, ein aussagekräftiges Signal in bovinen Embryonen zu detektieren. Dies könnte vor allem an der geringen Proteinmenge eines einzelnen Embryos liegen. Dabei handelt es sich lediglich um etwa 0,152 µg Protein pro Embryo (THOMPSON et al. 1998). In den Versuchen wurden daher bis zu 100 Embryonen pro Western blot gepoolt eingesetzt, was dennoch nicht ausreichte, um ein Signal zu detektieren. Aufgrund dessen wurden weitere kommerziell erhältliche Antikörper zum Nachweis des IGF1R getestet. Mit insgesamt drei weiteren Antikörpern gelang es nicht, das Protein des Rezeptors nachzuweisen. Dieses Ergebnis lässt zum einen auf eine zu geringe Spezifität der getesteten Antikörper schließen, die aufgrund kurzer Sequenzlängen auftreten können, denn es besteht nachweislich ein Zusammenhang zwischen der Bindungsstärke und Sequenzlänge. Zum anderen deutet das Ergebnis des zuletzt getesteten Antikörpers (AVIVA systems biotechnology, CA, USA) auf eine generelle fehlerhafte Funktionalität des Antikörpers hin, da es nicht zu einem Nachweis des IGF1R-Proteins in der ausgewählten Positivkontrolle (humane Plazenta) kommt, die nachweislich eine große Menge des Proteins enthält (FORBES u. WESTWOOD 2008). Die Western blot - Versuche mussten daher ohne einen erfolgreichen Abschluss beendet werden. Um dennoch eine Aussage über das IGF1- 101 Diskussion ___________________________________________________________________ Rezeptorprotein treffen zu können, wurde die Methode der Immunfluoreszenz gewählt und mit dem spezifisch produzierten Antikörper anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) durchgeführt. Für die Quantifizierung des Fluoreszenzsignals wurde die mittlere Graustufenintensität eines festgelegten Bereichs ermittelt und mit der Hintergrundfluoreszenz verrechnet (TOLIVIA et al. 2006). Das IGF1-Rezeptorprotein konnte in allen Stadien der frühen Embryonalentwicklung detektiert werden, was zu der Bestätigung einer anderen Studie führt (WANG et al. 2009). Erstmals konnte jedoch eine stadienspezifische Proteinexpression des IGF1R nachgewiesen werden. Die stadienspezifische Expression kennzeichnete sich durch ein Maximum während des 2- bis 4-Zellstadiums, einen signifikanten Abfall der Signalstärke bis zum 16-Zellstadium und einen Anstieg der IGF1R-Proteinmenge bis zum Stadium der Blastozyste. Dieses Ergebnis entspricht dem zuvor ermittelten mRNA- Expressionsmuster, mit einer zeitlichen Verschiebung von einer Furchungsteilung, und damit den Vorgängen die während der MET ablaufen. So wurde nicht nur auf mRNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene eine stadienspezifische Expression des IGF1R aufgezeigt. Schlussfolgernd kann dem IGF1R daher eine entwicklungsrelevante Funktion während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes zugeschrieben werden, da er sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene in einem stadienspezifischen Muster exprimiert wird. 5.5 Schlussfolgerung Die Umgebungsbedingungen der Eizelle im Follikel und daraus schließend die Zusammensetzung des In-vitro-Maturationsmediums haben einen entscheidenden Einfluss auf die Entwicklungskompetenz der Eizelle. So konnte in dieser Arbeit verdeutlicht werden, dass eine Veränderung der Mediumbestandteile während der bovinen Eizellreifung zu einer Verschlechterung der morphologischen, aber auch molekularen Qualität resultierender Embryonen führen kann. Allerdings zeigte der Großteil der untersuchten Transkripte in den resultierenden bovinen Embryonen keine signifikante Veränderung in ihrer Expression. Daher ist es von großem 102 Diskussion ___________________________________________________________________ Interesse, eine Untersuchung der molekularen Qualität der Eizellen durchzuführen, um den direkten Einfluss der Supplementation auf die Eizellqualität nachzuweisen. Des Weiteren konnten vorherige Ergebnisse zur Wirkung von IGF1 während der Maturation boviner Embryonen bestätigt werden. Es zeigte sich, dass eine physiologische Konzentration an IGF1 (100 ng/ml), wie sie im bovinen Follikel während des Östrus gemessen wurde, nicht zu einer Veränderung der Qualität boviner Embryonen führte. Außerdem konnte beobachtet werden, dass der Zusatz einer erhöhten Konzentration IGF1 (1000 ng/ml), die während der negativen Energiebilanz nach der Abkalbung auftreten kann, zwar ebenfalls die Qualität von Embryonen nicht beeinflusst, es aber zu einer signifikanten Reduzierung der Anzahl gereifter Eizellen in vitro kommt. Die In-vitro-Simulation dieses komplexen Vorgangs ergab, dass eine erhöhte Konzentration an IGF1 die Eizellreifung negativ beeinflusst. Damit kann IGF1 als ein Faktor definiert werden, der in einer supraphysiologsichen Konzentration zu einer verschlechterten Eizellqualität führen kann. Die Untersuchung der Funktion von IGF1 in Bezug auf Apoptose während der frühen bovinen Embryonalentwicklung resultierte nicht, wie in vorherigen Studien gezeigt wurde, zu einer Verhinderung des Vorkommens von Apoptose. Die Hinzugabe der Apoptose-induzierenden Faktoren Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin führte zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl TUNEL-positiver Zellen in bovinen Embryonen, der durch die Supplementation zusammen mit IGF1 nicht reduziert wurde. Die Messung der IGF1-Konzentration im Medium, die erstmals in der vorliegenden Arbeit vor Beginn und nach 24-stündiger Maturation durchgeführt wurde, ergab kein eindeutiges Ergebnis. So konnten vier unterschiedliche Tests keine einheitlichen Werte für die IGF1-Konzentration der einzelnen Supplementationsgruppen erzielen. Ferner wurde mit keinem der Tests die Menge IGF1 gemessen, die vermeintlich hinzugegeben wurde. Daher kann nicht eindeutig definiert werden, ob die erzielten Ergebnisse allein auf der Supplementation mit IGF1 basierten. Weiterhin geben diese unterschiedlichen Werte Anlass dazu, auch bereits veröffentlichte Studien kritisch zu beurteilen. 103 Diskussion ___________________________________________________________________ Bei der Untersuchung der mRNA- und Proteinexpression des Insulin-like growth factor 1 - Rezeptors während der frühen Embryonalentwicklung konnte ein stadienspezifisches Muster nachgewiesen werden, das zu den Vorgängen der maternal-embryonic transition passt. Erstmals wurden Ergebnisse der mRNAAnalyse des IGF1R mit denen auf der Proteinebene bestätigt. So zeigte sich indirekt, dass die Proteinbiosynthese des IGF1R zunächst unter maternaler Kontrolle steht, um dann mit voranschreitenden Furchungsteilungen auf eine embryo-spezifische Transkription und Translation umgestellt zu werden. Dabei wurde der Rezeptor durchgängig im Embryo detektiert, wodurch die Rolle von IGF1 während der frühen Embryonalentwicklung als entwicklungsrelevant definiert werden konnte. 104 Zusammenfassung ___________________________________________________________________ 6. Zusammenfassung Friederike Poppicht Bedeutung des Insulin-like growth factor - Systems während der Oozytenreifung und präimplantorischen Embryonalentwicklung des Rindes Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mehr über die Funktion des Insulin-like growth factor 1 und im Speziellen bei der Verhinderung von Apoptose während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes zu erfahren. Dies wurde zum einen durch die Analyse der Expression des Insulin-like growth factor 1 – Rezeptors auf mRNAund Proteinebene in bovinen Embryonen ermittelt. Zum anderen wurde der Einfluss einer IGF1 - Supplementation des Mediums während der In-vitro-Reifung boviner Eizellen auf die morphologische und molekulare Qualität der resultierenden Embryonen untersucht. Dazu konnten in 121 IVP-Durchgängen insgesamt 12.872 Kumulus-Oozyten-Komplexe gewonnen, befruchtet und kultiviert werden. Zur Untersuchung der Expression des IGF1R wurde eine RT-qPCR mit frühen Embryonalstadien vom 2-Zeller bis zur expandierten Blastozyste durchgeführt. Weiterhin fanden ein Western blot und eine Immunfluoreszenzfärbung Anwendung, um das IGF1R-Protein in diesen Stadien zu analysieren. Für die Supplementationsversuche kam eine physiologische (100 ng/ml) oder eine supraphysiologische Konzentration (1000 ng/ml) IGF1 zum Einsatz, die entweder allein oder gemeinsam mit den Apoptoseinduzierern Actinomycin D und S-(+)-Camptothecin dem Maturationsmedium supplementiert wurde. Die Inkubation einer weiteren Gruppe KOK erfolgte in Medium mit Apoptoseinduzierern allein. Als Kontrollgruppe diente sowohl eine Gruppe, dessen Medium den Lösungsvermittler DMSO enthielt, als auch eine Gruppe, die ohne jeglichen Zusatz inkubiert wurde. Auf morphologischer Ebene fand eine Untersuchung der Maturationsrate, der Teilungsund Entwicklungsrate, der Gesamtzellzahl, der Anzahl toter Zellen, der Lebend-TotZellratio und der Anzahl apoptotischer Zellen statt. Des Weiteren wurde auf molekularer Ebene die Expression von sieben ausgewählten Genen in expandierten Blastozysten analysiert (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1, SLC2A1, 105 Zusammenfassung ___________________________________________________________________ SLC2A3). Als Ergebnisse aus den Untersuchungen lassen sich folgende Erkenntnisse festhalten: 1. Die durchschnittliche Kernreifungsrate von Eizellen der Kontrollgruppe (83,5 ± 6,9 %) war signifikant höher als in Eizellen, denen IGF1 (1000 ng/ml) zugesetzt wurde (70,2 ± 6,0 %). Außerdem war in Eizellen, die mit Apoptoseinduzierern allein oder zusammen mit IGF1 kultiviert wurden, die Maturationsrate signifikant reduziert (P ≤ 0,05). 2. Es konnte eine durchschnittliche Teilungsrate von 60,6 ± 8,1 % in Embryonen der Kontrollgruppe und 62,2 ± 8,4 % in denen der DMSO-Gruppe erzielt werden, die signifikant höher lagen als in der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (52,7 ± 6,9 %; P ≤ 0,05). 3. Die Entwicklungsraten an Tag sieben und acht der Kultivierung wiesen ebenfalls statistisch signifikante Unterschiede auf (P ≤ 0,05). So zeigte sich an Tag sieben eine signifikant höhere Entwicklungsrate in Embryonen der Kontrollgruppe (22,1 ± 6,4 %) im Vergleich zu Embryonen der Gruppen IGF 100 mit Apoptoseinduzierern (13,5 ± 7,4 %), IGF 1000 (13,6 ± 6,2 %) und IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (7,9 ± 4,7 %). An Tag acht der Kultivierung konnten bei Embryonen der Kontrollgruppe (24,1 ± 8,5 %) erneut signifikant höhere Entwicklungsraten erzielt werden als bei denen der IGF1-supplementierten Gruppen mit Apoptoseinduzierern (15,4 ± 8,2 % bzw. 10,0 ± 4,8 %). 4. Die Untersuchung der Gesamtzellzahl ergab einen Durchschnitt von 134,9 ± 18,6 Zellen pro Blastozyste in der Kontrollgruppe, die im Vergleich zu Blastozysten der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (110,7 ± 20,3) signifikant höher ausfiel (P ≤ 0,05). Allerdings konnten keine Unterschiede in der Anzahl toter Zellen zwischen Blastozysten der Versuchsgruppen beobachtet werden. Bei der Gegenüberstellung der Lebend-Tot-Zellratio konnte jedoch eine signifikant größere Ratio in Blastozysten der Kontrollgruppe (19,1 ± 6,8) gegenüber denen der Gruppen DMSO (11,2 ± 4,7), Apoptoseinduzierer (11,4 ± 5,6), IGF 100 (10,2 ± 5,1) und IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern (8,8 ± 3,1) erkannt werden. 106 Zusammenfassung ___________________________________________________________________ 5. Bei der Untersuchung von Apoptose in Embryonen wurden in der Kontrollgruppe durchschnittlich 2,1 ± 1,1 % TUNEL-positive Zellen pro Blastozyste detektiert. Die Embryonen, die aus einer Maturation mit Apoptoseinduzierern stammten, wiesen im Vergleich dazu eine signifikant höhere prozentuale Anzahl apoptotischer Zellen auf (3,6 ± 1,9 %; P ≤ 0,05). 6. Die Analyse der relativen Transkriptmenge ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede für die Gene IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, SLC2A1 und SLC2A3. Die Expression von BCL2L1 war in Embryonen der Gruppe IGF 1000 mit Apoptoseinduzierern im Vergleich zu Embryonen der anderen Gruppen signifikant erhöht (P ≤ 0,05). 7. Die Messung der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe verschiedener kommerzieller Kits führte nicht zu einem eindeutigen Ergebnis. In allen Supplementationsgruppen wurden ähnliche Werte gemessen, die nicht der hinzugegebenen Konzentration IGF1 entsprachen. 8. Die Untersuchung der mRNA-Expression des IGF1R in frühen Embryonalstadien zeigte ein stadienspezifisches Muster, welches die Vorgänge der maternal-embryonic transition widerspiegelt. Zu Beginn der ersten Furchungsteilungen konnte die größte, relative Transkriptmenge aufgezeigt werden, woraufhin ein Abfall bis zum 8-Zellstadium verzeichnet wurde. Vom 16Zeller bis zur expandierten Blastozyste konnte ein kontinuierlicher Anstieg der Expression registriert werden. 9. Ein qualitativer Nachweis des IGF1-Rezeptorproteins war mit der Western blot Methode in expandierten Blastozysten möglich. Allerdings wurde aufgrund der geringen Signalstärke keine Quantifizierung des Proteingehaltes durchgeführt. 10. Bei der Analyse des IGF1R mit einer Immunfluoreszenzfärbung in frühen Stadien der Embryonalentwicklung konnte eine stadienspezifische Expression detektiert werden. Dies zeichnete sich durch ein Maximum während des 2- und 4-Zellstadiums aus, woraufhin eine signifikante Abnahme bis zum 16-Zeller folgte. Vom Stadium der Morula bis hin zur expandierten Blastozyste wurde ein erneuter Anstieg der Proteinexpression des IGF1R gezeigt. 107 Zusammenfassung ___________________________________________________________________ 11. Der Vergleich der spezifischen Expression des IGF1R auf mRNA- und Proteinlevel zeigte ein ähnliches Muster, welches mit Vorgängen der maternalembryonic transition einhergeht und die Bedeutung des IGF-Systems während der frühen Embryonalentwicklung des Rindes hervorhebt. Schlussfolgernd kann daher zusammengefasst werden, dass IGF1 während der präimplantatorischen Embryonalentwicklung eine entscheidende Rolle spielt, was durch die stadienspezifische Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene bestätigt wurde. Jedoch konnte eine Verhinderung von Apoptose durch IGF1 im bovinen Embryo nicht beobachtet werden. Weiterhin kam es nicht zu einer Verbesserung der Embryonenqualität durch den Zusatz einer physiologischen Konzentration IGF1 während der Eizellreifung. Abschließend führte eine erhöhte Konzentration IGF1, wie sie während der negativen Energiebilanz bei Milchrindern während der Transitionsphase auftritt, zu einer negativen Beeinflussung der Qualität boviner Embryonen. 108 Summary ___________________________________________________________________ 7. Summary Friederike Poppicht Relevance of the Insulin-like growth factor system during oocyte maturation and preimplantation embryonic development in cattle The aim of the present study was to evaluate the function of the Insulin-like growth factor 1 and specifically on apoptosis inhibition during preimplantation embryonic development in cattle. On the one hand, this was investigated by analyzing the expression of the insulin-like growth factor 1 receptor in bovine embryos at mRNA and protein level. On the other hand, the influence of an IGF1 medium supplementation during in vitro maturation of bovine oocytes was studied regarding the morphological and molecular quality of the resulting embryos. Therefore, in a total of 121 IVP runs 12.872 cumulus oocyte complexes were collected, matured, fertilized and cultured. To analyze the IGF1R expression a RT-qPCR of early embryonic stages from the 2-cell until the expanded blastocyst was performed. Further on, a western blot and an immunofluorescence staining were used to investigate the IGF1R protein. For the supplementation experiments a physiological (100 ng/ml) or a supraphysiological concentration (1000 ng/ml) IGF1 were added either alone or in combination with the apoptosis inducers actinomycin D and S-(+)camptothecin zo the IVM medium. Another group of COC was incubated only with apoptosis inducers. DMSO alone in the maturation medium and medium without any supplements served as controls. At morphological level the maturation rate, the cleavage and developmental rates, the total cell number, the amount of dead cells, the live-dead cell ratio and the number of apoptotic cells were analyzed. Furthermore, at molecular level the expression of seven selected genes was examined in expanded blastocysts (IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, BCL2L1, SLC2A1, SLC2A3). The following results were obtained: 1. The average maturation rate of control group oocytes (83.5 ± 6.9 %) was significantly higher compared to oocytes originating from IGF1 (1000 ng/ml) supplementation (70.2 ± 6.0 %). Moreover oocytes stemming from a culture 109 Summary ___________________________________________________________________ with apoptosis inducers alone or together with IGF1 showed significant lower maturation rates (P ≤ 0.05). 2. An average cleavage rate of 60.6 ± 8.1 % in control group embryos and 62.2 ± 8.4 % in embryos of the DMSO group were achieved, which were significantly higher as in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis inducers (52.7 ± 6.9; P ≤ 0.05). 3. Developmental rates at day seven and eight of culture showed statistical differences as well. At day seven, a significant higher developmental rate was detected in embryos of the control group (22.1 ± 6.4 %) in contrast to embryos of the group IGF 100 with apoptosis inducers (13.5 ± 7.4 %), IGF 1000 (13.6 ± 6.2 %) and IGF 1000 with apoptosis inducers (7.9 ± 4.7 %; P ≤ 0.05). At day eight of culture, a significant higher developmental rate was obtained in control group embryos (24.1 ± 8.5 %) compared to embryos of the IGF1 with apoptosis inducers group (15.4 ± 8.2 % resp. 10.0 ± 4.8 %). 4. On average, 134.9 ± 18.6 cells per blastocyst were counted in embryos of the control group, which was significantly higher compared to blastocysts of the group IGF 1000 with apoptosis inducers (110.7 ± 20.3; P ≤ 0.05). Although there were no differences in the number of dead cells between blastocysts of the different treatments, the comparison of live-dead cell ratio resulted in a significant higher ratio in blastocysts of the control group (19.1 ± 6.8) to blastocysts from DMSO (11.2 ± 4.7), apoptosis inducers (11.4 ± 5.6), IGF 100 (10.2 ± 5.1) and IGF 1000 with apoptosis inducers (8.8 ± 3.1). 5. The analysis of apoptosis in embryos led to an average number of 2.1 ± 1.1 % TUNEL-positive cells per control group blastocyst. In contrast to that, embryos stemming from a maturation with apoptosis inducers showed a significant higher percentage of TUNEL-positive cells (4.5 ± 2.1; P ≤ 0.05). 6. No significant differences in the expression of IGF1R, IGFBP2, IGFBP3, BAX, SLC2A1 and SLC2A3 could be detected in embryos of the different treatments. The relative transcript abundance of the BCL2L1 gene was significantly increased in embryos of the group IGF 1000 with apoptosis inducers in comparison with embryos of all other groups. 110 Summary ___________________________________________________________________ 7. The measurement of the IGF1 concentration in media by different commercial kits did not lead to a distinct result. Medium from all groups of supplementation showed similar IGF1 concentrations, which were not consistent with the supplemented amount of IGF1. 8. The analysis of the IGF1R mRNA expression in early embryonic stages showed a stage-specific pattern, which reflects the process of the maternal-embryonic transition. At the beginning of the first cleavages the highest relative transcript amounts could be detected. Thereupon, an expression decline until the 8-cell stage was measured. From the 16-cell stage to the expanded blastocyst a continuous increase of the relative transcript abundance was observed. 9. A qualitative detection of the IGF1 receptor protein was possible in expanded blastocysts employing a western blot. However, due to the weak signal strength a quantification of the protein amount could not be performed. 10. A stage-specific expression of the IGF1R protein was detected in early stages of embryonic development with immunofluorescence staining. This was characterized by a maximum at the 2- to 4-cell stage, whereupon a significant decrease until the 16-cell stage pursued. From the morula to the expanded blastocyst a rise of the IGF1R protein expression could be observed. 11. The comparison of the specific IGF1R expression at the mRNA and protein level showed similar patterns, which accompany the process of the maternalembryonic transition and emphasize the importance of the IGF system during early embryonic development. In conclusion, IGF1 plays an important role during preimplantation embryonic development, which was confirmed by a stage-specific expression at the mRNA, as well as at the protein level. However, a prevention of apoptosis by IGF1 in bovine embryos could not be observed. Furthermore, no improvement of embryo quality due to a physiological concentration of IGF1 during oocyte maturation could be achieved. Finally, a higher concentration of IGF1 as seen during the negative energy balance in high yielding dairy cows seems to have a negative influence of bovine embryo quality. 111 Anhang ___________________________________________________________________ 8. Anhang 8.1 Medien der IVP Tabelle 17: PBS-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. g/l 9,7 Sigma-Aldrich D 5773 Penicilline IE/ml 50,0 Sigma-Aldrich PENK Streptomycinsulfate µg/ml 50,0 Sigma-Aldrich S 6501 Na-Pyruvate µg/ml 36,0 Sigma-Aldrich P3662 D-Glucose mg/ml 1,0 Riedel-de-haen 16301 CaCl2 x H2O µg/ml 133,0 Sigma-Aldrich D 5773 Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Heparin IE/ml 2,2 Serva 24900 BSA (Fraktion V) mg/ml 1,0 Sigma-Aldrich A 9647 Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfate mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Na-Pyruvate mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 35,0 Riedel-de-haen 31437 ad. X ml H2O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (faf)* mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 Dulbecco’s phosphate buffered saline Tabelle 18: PBS-Complete Tabelle 19: TCMair pH durch Zugabe von 1M NaOH auf 7,2 einstellen * nach Einstellung des pH dazugeben 112 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 20: TCM199-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. TCM199 g/100 ml 1,5 Sigma-Aldrich M 2520 Gentamycinsulfate mg/100 ml 5,0 Sigma-Aldrich G 3632 Na-Pyruvate mg/100 ml 2,2 Sigma-Aldrich P 3662 NaHCO3 mg/100 ml 220,0 Riedel-de-haen 31437 ad. X ml H2O ml 100,0 Fresenius Ampuwa BSA (faf)* mg/100 ml 100,0 Sigma-Aldrich A 7030 Suigonan* - PMSG IE/ml 10,0 Intervet Suigonan IE/ml 5,0 - hCG pH durch Rühren auf 7,4 einstellen * nach Einstellung des pH dazugeben Tabelle 21: Fert-TALP-Stocklösung KonzenSubstrat Einheit Menge tration Produktnr. Hersteller (mM) NaCl mg/100 ml 665,8 114.0 Sigma-Aldrich S 5886 KCl mg/100 ml 23,9 3.2 Sigma-Aldrich P 5405 NaHCO3 mg/100 ml 210,0 25.0 Riedel de Haen P 3662 NaH2PO4 x H2O mg/100 ml 4,1 0.3 Merck S 5761 CaCl2 x 2 H2O mg/100 ml 29,4 2.0 Sigma-Aldrich C 7902 MgCl2 mg/100 ml 4,8 0.5 Sigma-Aldrich M 2643 Phenolred mg/100 ml 1,0 0.01µg/ml Sigma-Aldrich P 5530 Penicillinamine mg/100 ml 0,3 20 Sigma-Aldrich P 4875 Natriumlactate (60%) mg/100 ml 186,0 10 Sigma-Aldrich L 4263 ad. 100ml H2O ml Fresenius Ampuwa 113 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 22: Fert-TALP-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Fert-TALP Stocklösung ml 10,14 Gentamycinsulfate µg 50,0 Sigma-Aldrich G 3632 BSA (Fraktion V) mg 60,0 Sigma-Aldrich A 9647 Na-Pyruvate µg 280,0 Sigma-Aldrich P 36623 Tabelle 23: Epinephrin-Lösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Hypotaurin mg 1,83 Sigma-Aldrich E 4250 Na-Metabisulfit mg 40,00 Fluka 71928 Na-Lactate (60 %) mg 132,00 Sigma-Aldrich L 4263 H2O ml 10,0 Fresenius Ampuwa Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Hypotaurine mg 1,09 Sigma-Aldrich H 1384 H2O ml 10,0 Fresenius Ampuwa Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Heparin mg 2,82 Serva 24900 H2O ml 10,0 Fresenius Ampuwa Tabelle 24: Hypotaurin-Lösung Tabelle 25: Heparin-Lösung 114 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 26: HHE-Stocklösung Substrat Einheit Menge Epinephrin-Lsg. M 4,0 Hypotaurin-Lsg. ml 10,0 H2O ml 26,0 Hersteller Produktnr. Fresenius Ampuwa Tabelle 27: HHE-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge HHE-Stocklsg. µl 80,0 Heparin-Lsg. µl 40,0 Tabelle 28: Fertilisationsmedium Substrat Einheit Menge Fert-TALP-Gebrauchslsg. ml 2,0 HHE-Gebrauchslsg. µl 120,0 Tabelle 29: Spermfilter-Gebrauchslösung Substrat Einheit Menge Hersteller Produktnr. Spermfilter µl 900,0 Gynemed 3SF0010 Fert-TALP-Gebrauchslsg. µl 100,0 115 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 30: SOF-Stocklösung A Substrat Einheit Menge NaCl g/100ml 6,3 KCl g/100ml KH2PO4 Konzentration Hersteller Produktnr. 108 Sigma-Aldrich S 5886 0,5 7,2 Sigma-Aldrich P 5405 g/100ml 0,2 1,2 Sigma-Aldrich P 5655 MgSO4 g/100ml 0,2 1,5 Sigma-Aldrich M 2643 H2O ml 98,4 Sigma-Aldrich W 1503 Na-Laktat* ml 0,6 Sigma-Aldrich L 4263 Hersteller Produktnr. (mM) 4,2 *als letzte Reagenz hinzufügen Tabelle 31: SOF-Stocklösung B Konzentration Substrat Einheit Menge NaHCO3 g/100ml 2,10 25,0 Sigma-Aldrich S 4019 Phenolred g/100ml 0,01 1 mg / 100 ml Sigma-Aldrich P 5530 H2O ml 100,0 Sigma-Aldrich W 1503 Hersteller Produktnr. Sigma-Aldrich P 3662 Sigma-Aldrich W 1503 (mM) Tabelle 32: SOF-Stocklösung C Substrat Einheit Menge Na-Pyruvate mg 80,0 H2O ml 10,0 Konzentration (mM) 0,73 116 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 33: SOF-Stocklösung D Substrat Einheit Menge CaCl2 x 2 H2O mg 262,0 H2O ml 10,0 Konzentration (mM) 1,78 Hersteller Produktnr. Sigma-Aldrich C 7902 Sigma-Aldrich W 1503 Hersteller Produktnr. Tabelle 34: Glutamin-Stocklösung Konzentration Substrat Einheit Menge Glutamine mg 292,0 Sigma-Aldrich G 6392 Glutamin H2O ml 10,0 Sigma-Aldrich W 1503 H2O Hersteller Produktnr. (mM) Tabelle 35: SOFaa-Kultivierungsmedium Konzentration Substrat Einheit Menge Myo-Inositole mg 50,0 2.77 Sigma-Aldrich I 7508 Tri-Na-Citrate mg 10,0 0.34 Sigma-Aldrich S 4641 Gentamycine mg 5,0 50µg/ml Sigma-Aldrich G 3632 H2O ml 78,0 Sigma-Aldrich W 1503 µl 100,0 0.2 Sigma-Aldrich G 6392 Stocklsg. A ml 10,0 4.2 Stocklsg. B ml 10,0 Stocklsg. C ml 1,0 Stocklsg. D ml 1,0 BME 50x ml 3,0 30µl/ ml Sigma-Aldrich B 6766 MME 100x ml 1,0 10µl / ml Sigma-Aldrich M 7145 GlutamineStocklsg. (mM) 117 Anhang ___________________________________________________________________ 8.1 Medien für Proteinbestimmungen Tabelle 36: Polyacrylamid-Gel Substrat Hersteller Produktnr. Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8) Applichem A 0843 Tris Sigma-Aldrich 93362 SDS Applichem A 3950 APS Merck 101200 TEMED Serva 35930.02 Bromphenolblue Serva 15375.02 BSA (Fraktion V) Sigma-Aldrich A 9647 SeeBlue®Plus2 Marker (SDS-PAGE) Invitrogen LC 5925 Detektionssubstrat Pierce 34075 SuperSignal West Dura Tabelle 37: Boehringer Lysepuffer Substrat Konzentration (mM) Hersteller Produktnr. Tris * 50 Sigma-Aldrich 93362 NaCl 150 Sigma-Aldrich S 3014 NaF 40 Sigma-Aldrich S 7920 EDTA 3 Merck 324506 EGTA 2 Sigma-Aldrich E 3889 Nonidet P40 1% Sigma-Aldrich 21-3277 Na-desoxycholat 0,1% Applichem A 1531 SDS 0,1% Sigma-Aldrich A 3950 Sigma-Aldrich P 8340 Protease Inhibitoren *pH auf 7,4 mit HCl einstellen 118 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 38: SDS-Probenpuffer (5x) Substrat Menge Tris * 250 µl Bromphenolblue Konzentration Hersteller Produktnr. Sigma-Aldrich 93362 1 µg Applichem A 2331 Glycerine 750 µl Merck 356352 SDS 1 ml 0,1% Applichem A 3950 β-Mercaptoethanol** 20 µl 2% Applichem A 4338 Hersteller Produktnr. (mM) 1000 *pH auf 6,8 mit HCl einstellen **erst vor Benutzung hinzugeben Tabelle 39: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) Konzentration Substrat Menge Tris 30,3 g 25 Sigma-Aldrich 93362 Glycine 144 g 192 Roth HN07.3 ad. H2O 1000 ml Hersteller Produktnr. (mM) Tabelle 40: 10x-TBS Konzentration Substrat Menge Tris* 60,55 g 25 Sigma-Aldrich 93362 NaCl 90 g 150 Sigma-Aldrich S 3014 ad. H2O 1000 ml (mM) *pH auf 7,4 mit HCl einstellen 119 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 41: TBS-T Substrat Menge Tris* 60,55 g NaCl Konzentration Hersteller Produktnr. 25 Sigma-Aldrich 93362 90 g 150 Sigma-Aldrich S 3014 Tween20 1 ml 0,1% Merck 655205 ad. H2O 1000 ml Hersteller Produktnr. Applichem A 3950 Hersteller Produktnr. Roth CP43.4 Hersteller Produktnr. Roth CP43.4 (mM) *pH auf 7,4 mit HCl einstellen Tabelle 42: SDS-Laufpuffer Konzentration Substrat Menge 10x TG-Puffer 100 ml 1x SDS 10 ml 0,1% ad. H2O 1000 ml (mM) Tabelle 43: Blottingpuffer Konzentration Substrat Menge 10x TG-Puffer 100 ml 1x Methanol 200 ml 20% ad. H2O 1000 ml (mM) Tabelle 44: Blockierungslösung Substrat Menge TBS-T 40 ml Magermilchpulver 2g Konzentration (mM) 5% 120 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 45: Stripping-Puffer Substrat Menge Glycine 15 g SDS Konzentration Hersteller Produktnr. 200 Roth HN07.3 10 ml 1% Applichem A 3950 Tween20 100 µl 0,05% Merck 655205 ad. H2O* 100 ml (mM) *pH auf 2,2 mit HCl einstellen Tabelle 46: Paraformaldehyd-Lösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Paraformaldehyde 400 mg 4% Sigma-Aldrich 158127 100 ml Invitrogen 14190-136 Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Triton X 100 1 mg 0,1 % Sigma-Aldrich 93443 Invitrogen 14190-136 Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline Tabelle 47: Triton-X100-Lösung Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline 10 ml Tabelle 48: Polyvinylpyrrolidon-Lösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Polyvinylpyrrolidon 10 mg 1 mg/ml Sigma-Aldrich PVP10 Invitrogen 14190-136 Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline 10 ml 121 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 49: BSA-Lösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. BSA (faf) 30 mg 3% Sigma-Aldrich A 7030 Invitrogen 14190-136 Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline 10 ml 8.3 Medien für die Färbungen Tabelle 50: PVA/PBS-Lösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Polyvinylalkohol 10 mg 0,1 % Sigma-Aldrich P8136 Invitrogen 14190-136 Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline 100 ml Tabelle 51: Hoechst 33342-Stocklösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Hoechst 33342 2 mg 2 mg/ml 14533 ad. H2O* 1 ml Sigma-Aldrich Tabelle 52: Ethidium homodimer-Stocklösung Substrat Menge Konzentration Hersteller Produktnr. Ethidium homodimer 1 mg 1 mg/ml E1169 ad. H2O* 1 ml 122 Invitrogen Anhang ___________________________________________________________________ 8.4 Labormaterial und Geräte Tabelle 53: Aufführung aller verwendeten Geräte Geräte Firma Sitz Bestellnummer Blau-Filter für Olympus Hamburg U-FBWA Vilber Lourmat Eberhardzell Dynex MRXe Photometer Magellan Biosciences USA 99000210 Fluoreszenzmikroskop Olympus Hamburg IX73 Gammacounter Perkin Elmer USA 2470-0150 Gammacounter Berthold Technologies Gütersloh LB200 Grün-Filter für Ethidium und PI Olympus Hamburg U-FGW Heracell 150i CO2 Inkubator Thermo Fisher Braunschweig 51026281 Mini-Protean Tetra Cell Biorad München 165-8025FC Mini-spin Plus Zentrifuge Eppendorf Hamburg 5453000011 Monochrome CCD-Kamera Olympus Hamburg DP73 Real-Time PCR Detection Biorad München 184-5096 Tecan Group Männedorf Immunfluoreszenz Chemilumineszenz Imagingsystem System Spectra II Photometer Schweiz Stereomikroskop Olympus Hamburg SZX7 Thermocycler C1000 Biorad München 185-2197 Thermocycler T1 Biometra Göttingen 050-90 Thermoschüttler Peqlab Erlangen 90-TS-100 UV-Filter für Hoechst 33342 Olympus Hamburg U-FUW Vakuumpumpe KNF Laboport Freiburg Z288284 123 Anhang ___________________________________________________________________ Geräte Firma Sitz Bestellnummer Vortexer Peqlab Erlangen 90-V-1 Wärmeplatte minitüb Tiefenbach HT200 W Wasserbad Memmert Schwabach ONE 10 Tabelle 54: Aufführung aller verwendeten Labormaterialien Labormaterial Firma Sitz Bestellnummer Actinomycin D Enzo Life Science Lörrach Deckgläschen Carl Roth Karlsruhe NK75.1 Life technologies Darmstadt 61021 Eppendorfgefäße (1,5 ml) Eppendorf Hamburg 30120086 IGF1 Sigma Aldrich Steinheim I3769 Kanüle G 20 B. Braun Melsungen 4657500 Life technologies Darmstadt Dynal MPC®-S micro-classic Pipettierhelfer Brand Wertheim 25900 Mikropipette The Stripper Gynemed GmbH Lensahn MXL3-STR Mikrotiterplatte Greiner Bio one Nitrocellulosemembran Sigma Aldrich Steinheim GE10600016 Objektträger Carl Roth Karlsruhe NK72.1 Pasteurpipette (Glas) Carl Roth Karlsruhe 4522.1 BML-GR3000005 Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Purification Kit Magnetic Particle Concentrator 124 Kremsmünster Österreich 655801 Anhang ___________________________________________________________________ Labormaterial Firma Sitz Petrischale groß (60 mm) Greiner Bio one Petrischale klein (35 mm) Greiner Bio one S-(+)-Camptothecin Enzo Life Science single stripes Biozym Thermobehälter Duwer KGW Isotherm Karlsruhe Thoma-Kammer Carl Roth Karlsruhe T732.1 Whatman Papier Sigma Aldrich Steinheim Z763187 Zentrifugenröhrchen (15 ml) Greiner Bio one Kremsmünster Österreich Kremsmünster Österreich Lörrach Bestellnummer 628160 627160 ALX-350-015M050 Hessisch Oldendorf 125 Kremsmünster Österreich 188161 Anhang ___________________________________________________________________ 8.5 Einzeldaten der durchgeführten Untersuchungen Tabelle 55: Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium homodimer Laufende Kontrolle DMSO Apop. I100 I+A100 I1000 I+A1000 GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ GZZ TZ 1 113 4 104 3 118 14 96 8 115 9 101 8 122 3 2 170 8 131 19 134 11 89 10 110 11 120 2 108 9 3 126 11 92 11 153 13 108 5 117 10 156 25 88 8 4 160 8 154 7 149 18 108 12 114 9 96 7 120 17 5 124 5 109 7 133 11 146 22 94 4 132 5 122 11 6 148 12 136 12 147 18 107 8 112 8 172 6 120 11 7 112 8 101 11 91 15 92 18 127 5 151 18 83 13 8 147 8 120 14 120 8 143 11 107 9 147 6 103 3 9 139 8 103 8 170 4 114 8 10 134 9 118 8 120 7 86 19 11 130 8 126 5 152 14 12 127 8 13 156 8 14 149 4 15 110 5 16 114 4 Nr. GZZ= Gesamtzellzahl; TZ= Anzahl toter Zellen 126 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 56: Einzeldaten der TUNEL-Analyse Laufende Kontrolle DMSO Apop. I100 I+A100 I1000 I+A1000 GZZ T+ GZZ T+ GZZ T+ GZZ T+ GZZ T+ GZZ T+ GZZ T+ 1 111 3 183 5 152 5 151 5 140 4 212 6 179 2 2 179 5 156 5 154 3 122 9 126 10 100 6 156 2 3 121 4 121 6 146 7 118 4 120 4 152 8 103 4 4 131 3 154 3 147 4 169 3 127 3 152 6 116 3 5 131 2 98 3 93 7 107 4 137 8 141 3 124 6 6 108 2 138 4 146 3 103 5 112 4 132 9 144 8 7 132 1 153 4 114 8 152 3 105 3 158 9 8 114 1 119 5 103 6 125 2 153 6 9 188 9 122 6 130 5 10 157 2 97 5 11 144 4 12 151 3 13 161 2 14 168 3 Nr. GZZ= Gesamtzellzahl; T+= TUNEL-positive Zellen Tabelle 57: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R, IGFBP2 und IGFBP4 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen IGF1R IGFBP2 IGFBP4 n MW SEM n MW SEM n MW SEM Kontrolle 5 5,5 3,0 4 51,0 28,1 4 4,7 3,0 DMSO 3 2,2 2,5 3 22,9 16,6 3 2,7 2,7 Apop. 4 8,1 3,1 4 52,1 18,4 3 4,0 1,8 I100 3 1,8 1,6 3 32,6 18,6 3 2,1 1,1 I+A100 5 6,3 3,3 4 98,5 52,3 4 3,5 1,9 I1000 3 3,6 1,0 3 38,0 16,0 3 3,9 2,2 I+A1000 2 9,9 1,6 2 63,9 52,9 3 8,2 6,4 127 Anhang ___________________________________________________________________ Tabelle 58: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX, BCL2L1, SLC2A1 und SLC2A3 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen BAX BCL2L1 SLC2A1 SLC2A3 n MW SEM n MW SEM n MW SEM n MW SEM Kontrolle 3 14,1 5,8 4 14,6 6,5 4 48,4 11,2 5 57,3 23,0 DMSO 3 20,9 15,0 3 9,8 8,1 2 23,0 21,0 2 20,9 16,4 Apop. 4 17,3 3,3 4 8,7 4,4 3 47,0 36,9 4 51,3 34,4 I100 3 11,4 5,2 3 7,3 1,0 2 20,2 14,2 3 32,8 31,2 I+A100 4 21,8 13,7 5 8,9 2,4 3 46,4 19,8 5 51,9 22,0 I1000 3 14,6 2,9 3 5,0 0,6 2 22,6 9,8 3 47,4 42,2 I+A1000 3 29,2 10,9 2 68,2 48,7 3 18,2 16,2 3 74,7 50,2 Tabelle 59: Einzeldaten der mRNA- und Proteinanalyse unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung IGF1R mRNA IGF1R Protein n MW SEM n MW SEM 2-Zeller 4 62,8 24,3 8 1007,8 123,8 4-Zeller 3 47,4 18,1 9 934,1 165,0 8-Zeller 5 4,1 2,1 8 717,9 58,8 16-Zeller 4 6,2 1,7 8 417,6 54,3 Morula 6 15,9 4,8 9 577,7 35,0 Blastozyste 5 31,2 6,2 9 1319,6 116,3 Exp. Blastozyste 5 40,2 10,1 10 1215,3 110,5 128 von IGF1R in Verzeichnisse ___________________________________________________________________ 9. Verzeichnisse 9.1 Abkürzungsverzeichnis ∆ct Delta treshold cycle °C Grad Celcius µl Mikroliter µm Mikrometer 125I Isotop Iod 125 Apop. Apoptoseinduzierer A Adenin aa Aminosäurezusatz (amino acids) Abb. Abbildung Add Latein: zu AEBSF 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid ANOVA Varianzanalyse BAX Bcl2-assoziiertes X Protein BCA bicinchoninic acid Bcl2 B-cell lymphoma 2 BCL2L1 B-cell CLL/lymphoma 2 like 1 bp Basenpaare BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise CA Californien ca. circa CCD charge-coupled device cDNA complementary DNA CO2 Kohlenstoffdioxid ct Treshold Cycle C-Terminus Carboxy-Terminus D DMSO DMSO Dimethylsulfoxide 129 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate dUTP deoxyuridin E Tageseffizienz E₂ Östradiol-17β EA Embryonenäquivalent ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay et al. et alii (und andere) faf fatty acid free (fettsäurefrei) FCS fetales Kälberserum (fetal calf serum) FD Fold difference Fert-TALP Fertilisierungsmedium mit Tyrodes Albumin Laktat Pyruvat FSH Follikelstimulierendes Hormon g Erdschwerebeschleunigung g Gramm GH Growth hormone GLUT Glukosetransporter (ehemalige Bezeichnung) GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung GnRH Gonadotropin Releasing-Hormon GOI Gene of Interest GRFi Growth Hormone Releasing Factor h Stunde (hora) H2O Wasser hCG humanes Choriongonadotropin HHE Heparin-Hypotaurin-Epinephrin HRP Horseradish peroxidase I 100 IGF1 in 100 ng/ml I 1000 IGF1 in 1000 ng/ml IE Internationale Einheiten IETS International Embryo Transfer Society IGF1 Insulin-like growth factor 1 130 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ IGF1R Insulin-like growth factor 1 receptor IGF2 Insulin-like growth factor 2 IGF2R Insulin-like growth factor 2 receptor IGFBP Insulin-like growth factor binding protein IRMA Immunradiometrische Assay IVC In-vitro-Kultivierung (in vitro culture) IVF In-vitro-Fertilisierung IVM In-vitro-Maturation IVP In-vitro-Produktion K Kontrolle Kcal Kilokalorien (kilo calory) kDa kilo Dalton KOK Kumulus-Oozyten-Komplex L-Domäne Linker-Domäne LH Luteinisierendes Hormon M Molar MA Massachusetts MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MET maternal-embryonic transition mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid min Minuten ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar mod. modifiziert MPC Magnetic Particle Concentrator mRNA messenger ribonucleic acid MW Mittelwert n Anzahl N2 Stickstoff 131 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ NCCD Nomenclature Committee on Cell Death Neg. Negativ ng Nanogramm nM Nanomolar ns nicht signifikant N-Terminus Amino-Terminus O2 Sauerstoff OH Hydroxygruppe OPU Ovum Pick-Up P Signifikanzwert PBS Phosphate buffered Saline PCOS Polyzystisches Ovarsyndrom pg Pikogramm PI3K Phosphoinositid-3-Kinase PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotropin PVA Polyvinylalkohol PVP Polyvinylpyrrolidon qPCR quantitative Polymerase-Kettenreaktion RI Rnase Inhibitor RNA ribonucleic acid rpm rounds per minute RT Reverse Transkriptase s Sekunden SD Standardabweichung SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate - Polyacrylamidgelelektrophorese SEM Standardfehler des Mittelwertes SLC solute carrier SLC2A1 solute carrier family 2 member 1 SLC2A3 solute carrier family 2 member 3 SNEB severe (ausgeprägte) negative Energiebilanz SOF synthetic oviduct fluid 132 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ T Tag Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBS Tris-buffered Saline TBS-T Tris-buffered Saline + Tween TCM199 Tissue Culture Medium 199 TdT deoxynucleotidyl transferase TMB 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling U Units USA United States of America UV Ultraviolett V Volt z. B. zum Beispiel α alpha β beta 133 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ 9.2 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Proteinstruktur des IGF1 (A; SATO et al. 1993) und IGF2 (B; TORRES et al. 1995). Proteinketten sind vom N- (Rot) zum CTerminus (Blau) unter Verwendung eines RegenbogenfarbenSpektrums coloriert dargestellt.............................................................5 Abbildung 2: Insulin-like growth factor System mit Darstellung der spezifischen Signalübertragung (mod. nach HWA et al. 1999).................................7 Abbildung 3: Darstellung des Energiehaushaltes während der Laktationsphase des Rindes (mod. nach EMMICK et al. 2000) ................................... 10 Abbildung. 4: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion boviner Embryonen (mod. nach LONERGAN 2007) ..................................... 12 Abbildung 6: Schematische Darstellung des programmierten Zelltods (mod. nach WEEDON et al. 1979) .............................................................. 21 Abbildung 5: Schematische Darstellung der maternal-embryonic transition während der präimplantatorischen Entwicklung boviner Embryonen (mod. nach GRAF et al. 2014) Abbildung 7: 24 Kumulus-Oozyten-Komplexe der Qualitätskategorie 1 (A) bis 5 (E) .................................................................................................. 35 Abbildung 8: Petrischale mit Einzelwells für die ölfreie Maturation boviner Oozyten ............................................................................................ 36 Abbildung 9: Repräsentative Darstellung einer Oozyte im Metaphase-II Stadium angefärbt mit Hoechst 33342; ............................................. 40 Abbildung 10: Repräsentative Darstellung der Lebend-Tot-Färbung einer expandierten Blastozyste; Blau: Lebende Zellen (Hoechst 33342); Rot: Tote Zellen (Ethidium homodimer und Hoechst 33342) ............ 47 Abbildung 11: Repräsentative Darstellung der TUNEL-Färbung einer expandierten Blastozyste; Blau: TUNEL-negative Zellen (Hoechst 33342); Grün: TUNEL-positive Zellen (TUNEL-Reaktionslösung) ........................... 49 Abbildung 12: Darstellung des Magnetic Particel Concentrators mit DynabeadLösung (Pfeil) .................................................................................... 51 134 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ Abbildung 13: Peptidsequenz des IGF1R mit gekennzeichneten Positionen der getesteten Antikörper; hellgrau: α-Untereinheit (Aminosäure 1-710), weiß: β-Untereinheit (Aminosäure 711-1367), dunkelgrau: Transmembrandomäne (Aminosäure 906-929) ................................ 61 Abbildung 15: Darstellung der prozentualen Entwicklungsraten der einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung an Tag sieben und Tag acht (MW + SD); a:b P ≤ 0,05 ................................. 70 Abbildung 16: Repräsentative Illustration der Kumuluszellexpansion in den unterschiedlichen Versuchsgruppen nach 24-stündiger Maturation; A: Kontrolle, B: DMSO; C: Apoptoseinduzierer; D: IGF 100, E: I+A 100, F: IGF 1000, G: I+A 1000.......................................................... 71 Abbildung 17: Repräsentative Darstellung der nukleären Stadien boviner Oozyten während der Reifung mit Hilfe einer Hoechst 33342-Färbung; A: Prophase I, B: Telophase I, C: Metaphase II ................................... 72 Abbildung 18: Repräsentative Abbildung der Lebend-Tot-Färbung mit Höchst 33342 und Ethidium homodimer; Blau: Lebende Zellen; Rot: Tote Zellen ................................................................................................ 76 Abbildung 19: Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen (MW + SD); a:b P ≤ 0,05....................................................................................... 78 Abbildung 20: Repräsentative Darstellung expandierter Blastozysten nach TUNEL- und Zellkernfärbung ............................................................ 79 Abbildung 21: Darstellung des prozentualen Anteils TUNEL-positiver und -negativer Zellen in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Supplementationsgruppen ................................... 80 Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von BCL2L1 in expandierten Blastozysten der verschiedenen Supplementationsgruppen an Tag sieben (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 ............................................. 81 Abbildung 23: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGF1R, IGFBP3 und BAX in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben ...................................................... 82 135 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ Abbildung 24: Darstellung der relativen Transkriptmenge von IGFBP2, SLC2A1 und SLC2A3 in expandierten Blastozysten der unterschiedlichen Versuchsgruppen an Tag sieben ...................................................... 82 Abbildung 25: Darstellung der relativen Transkriptmenge des IGF1R im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b P ≤ 0,05 .......... 83 Abbildung 26: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des Peptidantikörpers anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin, 1: 50 Embryonen, 2-4: Positivkontrollen (bovine Leber, Karunkel, Kotyledone)....................................................................... 84 Abbildung 27: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rα (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 85 Abbildung 28: Oben: Repräsentativer Western blot mit unterschiedlichen Proteinextrakten unter Verwendung des IGF-1Rβ (santa cruz biotechnology, CA, USA); Unten: Ladungskontrolle mit β-Aktin; 1: bovine Leber, 2: Karunkel, 3: Kotyledone, 4: humane Plazenta .. 86 Abbildung 29: Repräsentative Darstellung der Proteinexpression des IGF1R im 2- (A), 4- (B), 8- (C), 16-Zellstadium (D), Stadium der Morula (E), der Blastozyste (F) und der expandierten Blastozyste (G); Rot: Zellkernfärbung mit Propidiumiodid, Grün: spezifische Antikörperfärbung mit Hilfe des anti-popp IGF1R (Seqlab, Göttingen) ........................................................................... 87 Abbildung 30: Darstellung der mittleren Graustufenintensitäten im Verlauf der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM); a:b:c P ≤ 0,05 ............. 88 Abbildung 31: Vergleich der relativen mRNA- und Proteinexpression des IGF1R während der frühen Embryonalentwicklung (MW ± SEM), die Proteinexpression wurde für Darstellungszwecke um ein Zehnfaches verringert ....................................................................... 89 136 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ 9.3 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Maturationsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung .......................................... 17 Tabelle 2: Untersuchungen des Zusatzes von IGF1 zum Kultivierungsmedium und dessen Einfluss auf unterschiedliche Parameter der Embryonalentwicklung .......................................... 19 Tabelle 3: Qualitätskategorien der Kumulus-Oozyten-Komplexe .................. 34 Tabelle 4: Übersicht der Versuchsgruppen und ihrer jeweiligen Mediumszusätze während der Maturation boviner Oozyten ......... 37 Tabelle 5: Auflistung der verwendeten Testkits zum Nachweis von IGF1 ..... 41 Tabelle 6: Mastermixe für die Reverse Transkription .................................... 52 Tabelle 7: Pipettierschema der Reversen Transkription mit einem Volumen von 20 µl ........................................................................ 53 Tabelle 8: Übersicht der verwendeten Primer für die RT-qPCR von Embryonen der unterschiedlichen Versuchsgruppen.................... 54 Tabelle 9: Ansätze für die qPCR ................................................................... 55 Tabelle 10: Eingesetzte Embryonenäquivalente der zu untersuchenden Gentranskripte .............................................................................. 55 Tabelle 11: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Versuche zur Gewinnung expandierter Blastozysten für die Western blot - Versuche .......... 68 Tabelle 12: Anzahl eingesetzter Kumulus-Oozyten-Komplexe, sowie Teilungs- und Entwicklungsraten der Embryonen in den einzelnen Supplementationsgruppen während der Oozytenreifung .............. 69 Tabelle 13: Anzahl eingesetzter KOK, sowie Maturationsraten von Oozyten der unterschiedlichen Versuchsgruppen ....................................... 73 Tabelle 14: Vergleich der Messergebisse der IGF1-Konzentration im Medium mit Hilfe unterschiedlicher Methoden vor und nach 24stündiger Oozytenmaturation ........................................................ 75 137 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ Tabelle 15: Gesamtzellzahlen, Anzahl toter Zellen und Lebend-Tot-Zellratio expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben .................................................................................... 77 Tabelle 16: Prozentuale Verteilung TUNEL-negativer und -positiver Zellen expandierter Blastozysten der einzelnen Versuchsgruppen an Tag sieben .................................................................................... 80 Tabelle 17: PBS-Gebrauchslösung ................................................................. 112 Tabelle 18: PBS-Complete .............................................................................. 112 Tabelle 19: TCMair .......................................................................................... 112 Tabelle 20: TCM199-Gebrauchslösung ........................................................... 113 Tabelle 21: Fert-TALP-Stocklösung ................................................................. 113 Tabelle 22: Fert-TALP-Gebrauchslösung ........................................................ 114 Tabelle 23: Epinephrin-Lösung ........................................................................ 114 Tabelle 24: Hypotaurin-Lösung........................................................................ 114 Tabelle 25: Heparin-Lösung ............................................................................ 114 Tabelle 26: HHE-Stocklösung.......................................................................... 115 Tabelle 27: HHE-Gebrauchslösung ................................................................. 115 Tabelle 28: Fertilisationsmedium ..................................................................... 115 Tabelle 29: Spermfilter-Gebrauchslösung ....................................................... 115 Tabelle 30: SOF-Stocklösung A ...................................................................... 116 Tabelle 31: SOF-Stocklösung B ...................................................................... 116 Tabelle 32: SOF-Stocklösung C ...................................................................... 116 Tabelle 33: SOF-Stocklösung D ...................................................................... 117 Tabelle 34: Glutamin-Stocklösung ................................................................... 117 Tabelle 35: SOFaa-Kultivierungsmedium ........................................................ 117 Tabelle 36: Polyacrylamid-Gel ......................................................................... 118 Tabelle 37: Boehringer Lysepuffer................................................................... 118 Tabelle 39: 10x-Tris-Glycin-Puffer (TG) ........................................................... 119 Tabelle 40: 10x-TBS ........................................................................................ 119 Tabelle 41: TBS-T ........................................................................................... 120 Tabelle 42: SDS-Laufpuffer ............................................................................. 120 138 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ Tabelle 43: Blottingpuffer ................................................................................. 120 Tabelle 44: Blockierungslösung ....................................................................... 120 Tabelle 45: Stripping-Puffer ............................................................................. 121 Tabelle 46: Paraformaldehyd-Lösung .............................................................. 121 Tabelle 47: Triton-X100-Lösung ...................................................................... 121 Tabelle 48: Polyvinylpyrrolidon-Lösung ........................................................... 121 Tabelle 49: BSA-Lösung .................................................................................. 122 Tabelle 50: PVA/PBS-Lösung.......................................................................... 122 Tabelle 51: Hoechst 33342-Stocklösung ......................................................... 122 Tabelle 52: Ethidium homodimer-Stocklösung ................................................ 122 Tabelle 53: Aufführung aller verwendeten Geräte ........................................... 123 Tabelle 54: Aufführung aller verwendeten Labormaterialien ........................... 124 Tabelle 55: Einzeldaten der Zellzahlfärbung mit Hoechst 33342 und Ethidium homodimer .................................................................................... 126 Tabelle 56: Einzeldaten der TUNEL-Analyse .................................................. 127 Tabelle 57: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte IGF1R, IGFBP2 und IGFBP4 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen ............................................................ 127 Tabelle 58: Einzeldaten der mRNA-Analyse der Gentranskripte BAX, BCL2L1, SLC2A1 und SLC2A3 in den unterschiedlichen Supplementationsgruppen ............................................................ 128 Tabelle 59: Einzeldaten der mRNA- und Proteinanalyse von IGF1R in unterschiedlichen Stadien der Embryonalentwicklung .................. 128 139 Verzeichnisse ___________________________________________________________________ 9.4 Literaturverzeichnis ABELE, E., H. 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Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Anatomie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz, Justus-Liebig-Universität Gießen Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. ……………………………………………………………………………… Datum, Unterschrift 169 Danksagung ___________________________________________________________________ Danksagung • Mein erster Dank geht an Prof. Dr. Christine Wrenzycki für die Bereitstellung des Themas, die immerwährende große Hilfsbereitschaft während der Versuchszeit und die zahlreichen Korrekturen bei der Anfertigung der Arbeit. • Ein herzliches Dankeschön geht an die H. Wilhelm Schaumann Stiftung für die finanzielle Unterstützung meiner Doktorarbeit. • Danke an die Mitarbeiter der Firma VION GmbH in Bad Bramstedt und des Fleischmarkts Olpe für ihre Geduld und Hilfe beim Sammeln der Ovarien. • Ich danke außerdem Doris Müller für die Unterstützung im IVP-Labor und Sandra Wilkening für die nette Einarbeitung und fortwährende Hilfe rund um das Thema RT-qPCR, die netten Pausen und zahlreichen Bestellungen. • Danke an Prof. Dr. Christiane Pfarrer und Dr. Nina Hambruch für die Unterstützung bei den Western blot - Versuchen. • Vielen Dank an Juniorprof. Dr. Marion Piechotta und Martina Baumgarten für die Durchführung und Hilfe mit den Hormonanalysen in Hannover. • Ferner danke ich meinen Mitstreitern in Hannover Nina, Nicole, Katharina, Johanna, Katha und Basti für die vielen Fahrten zum Schlachthof und die netten Stunden zusammen im Labor. • Danke auch an Dr. Ana Kassens, die mir in Hannover immer eine große Hilfe war und noch in Gießen Beistand per mail und Telefon geleistet hat. • Nicht zu vergessen ist der Dank an meine Mitstreiter in Gießen Jule, Carina, Judith und Nadja. Danke, dass ihr so viele Eizellen meiner Arbeit geopfert habt und stets umsichtig mit meinen Launen umgegangen seid. • Ein Dankeschön geht auch an die Kollegen in Gießen Sabine, Carmen, Bettina und Gerhard, die stets meine zahlreichen Fragen beantwortet haben und mir immer gern geholfen haben. • Ein Riesen-Dankeschön geht an Franzi, unser fleißiges Bienchen im IVPLabor in Gießen. Ohne dich hätte ich die ganzen Versuche nie zu Ende gebracht. Vielen lieben Dank für all die langen Abende und Samstage im 170 Danksagung ___________________________________________________________________ Labor und die ganze Hilfe. Halt den Laden weiterhin zusammen und lass dich von den besser wissenden Doktoranden nie unter kriegen. • Weiterhin danke ich Dr. Hanna Grothmann (für mich immer noch Stinshoff) für die zahlreiche Hilfe in allen Lebenslagen, die Motivation, wenn es manchmal gar nicht weiter ging und die Zeit in Gießen, die wir uns gegenseitig schöner gemacht haben. • Ich möchte zudem Danke sagen an alle meine neuen Kollegen am CeRA in Münster. Danke Verena, dass du mich für diesen tollen Job ausgewählt hast und mich jederzeit unterstützt. Und Danke an Prof. Stefan Schlatt und Prof. Sabine Kliesch, die mich eingestellt haben und mir mit viel Verständnis und Zeit für die Doktorarbeit sehr entgegen gekommen sind. • Ich danke außerdem meinen Mädels in Hannover Bine, Sandra und Elly, die mir die Zeit mit vielen Mädelsabenden versüßt, sich alles angehört und mich stets aufgemuntert haben. • Meinen Mädels aus der WG in Gießen, Sinah und Yasi, möchte ich Danken für die gemeinsame Zeit. Ohne euch hätte ich es nicht so lange in Gießen ausgehalten. Danke für die Motivation und die netten Stunden zusammen. • Danke an alle aus meiner Clique, die in den letzten Jahren so viel Geduld mit mir hatten und mir so viele abwechslungsreiche Wochenenden bereitet haben. Ich habe so ein Glück mit euch allen. Ein besonderer Dank geht an Bibi für die super schnelle Rechtschreibkorrektur! • Ich danke zudem Annegret und Alfons, die stets Geduld mit mir hatten. • Ein riesengroßer Dank geht an meine Familie. Meinem Schwesterherz Kati möchte ich für die zahlreichen Telefonate und Aufmunterungen danken. Mama und Papa, ihr habt mir immer beigestanden, in allen Lebenslagen und Teilen meines Studiums. Danke für den Rückhalt und den Glauben an mich. • Mein letzter und allergrößter Dank geht an Thomas. Ich möchte Dir unendlich Danken für dein großes Verständnis und dein Vertrauen und dass du nie aufgehört hast, mich zu unterstützen. In allen Höhen und Tiefen hast du bis zum Schluss daran geglaubt, dass ich diese Arbeit fertigstelle und mir dabei so viel Kraft gegeben. Danke, dass du immer für mich da warst. Ich liebe Dich. 171