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DISS. ETH No. 23852
ENGINEERING INORGANIC NANOMATERIALS FOR THE CAPTURING, STORAGE AND RELEASE OF BIOMOLECULES
A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich)
presented by VLADIMIR ZLATESKI
MSc Molecular Life Sciences, Jacobs University
born on 12.05.1987 citizen of Macedonia
accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wendelin J. Stark, examiner Prof. Dr. Javier Pérez-Ramírez, co-examiner Dr. Robert N. Grass, co-examiner
2016
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Zusammenfassung Partikel-Hybridsysteme aus Biomolekülen und anorganischen Materialien sind aufgrund ihrer Anwesenheit in der Natur gut bekannt. Sie werden von optimierten biologischen Prozessen, die sich auf der Nanoskala befinden, geregelt. Die Nanotechnologie als wissenschaftliche Disziplin hat viel vom erweiterten Verständnis der schwachen chemischen Wechselwirkungen und der kombinierten Eigenschaften der biomolekularen/anorganischen Hybridmaterialien profitiert. Dies hat während der letzten Jahrzehnte zur Entwicklung von neuartigen, einzigartigen und intelligenten Hybridmaterialien geführt. Diese Materialien sind für biologische und auch für nichtbiologische Anwendungen vielversprechend. Die vorliegende Doktorarbeit setzt sich mit den Fortschritten in der Entwicklung und Anwendung von biomolekularen/anorganischen Partikel-Hybridsysteme (vor allem Proteine und Nukleinsären in Kombination mit anorganischen Materialien) in verschiedenen Disziplinen auseinander. Kapitel 1 fasst die Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und anorganischen Partikeln zusammen, mit dem Fokus auf Nanomaterialien. Dieses Kapital gibt einen Überblick über die Nanotechnologie und über das neue Feld der Nanobiotechnologie. Hier sehen wir auf welche Art und Weise die Biomoleküle und die anorganischen Materialien zusammenwirken können und wie daraus einen Vorteil erzielt werden kann. Es wird aufgezeigt, wie das Verständnis dieser Wechselwirkungen von Forschern angewendet wurde, um eine Vielfalt von Hybridmaterialien zu erschaffen, welche für biologische und nichtbiologische Anwendungen nützlich
sind.
Zum
Schluss
wird
ausführlich
über
die
Anwendungen
dieser
biomolekularen/anorganischen Partikel-Hybridsysteme in den Bereichen Biokatalyse und DNA-Anreicherung gesprochen. Kapitel 2 konzentriert sich auf die Anwendung von Hybridmaterialien bestehend aus einer Kombination von Enzymen und magnetischen Nanopartikeln in der Biokatalyse. Im Streben nach robusten und wiederbenutztbaren Biokatalysatoren für die industrielle synthetische Chemie, nimmt die Bedeutung von Nanotechnologie stetig zu. In letzter Zeit wurden vermehrt Biomoleküle, insbesondere Enzyme, auf verschiedene Nanomaterialien immobilisiert. Kohlenstoff-beschichtete magnetische Nanopartikel haben sich aufgrund ihrer grossen Oberfläche, der hohen magnetische Sättigung und der bekannten Chemie als ein vielversprechender Enzymträger erwiesen. Hier wird gezeigt, wie kohlenstoffbeschichtete Kobaltnanopartikel chemisch funktionalisiert werden können um Enzyme auf die Oberfläche zu immobilisieren. Die Enzym/Kobaltpartikel Konjugate konnten sowohl im Kleinansatz (Milliliter) als auch in grösseren Pilotreaktionen (mehrere Liter) rezykliert werden.
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In Kapitel 3 wird ein neuartiges Vorgehen gezeigt, mit dem Enzyme auf mesoporöse Silikate immobilisiert, eingeschlossen, inaktiviert und danach beliebig wieder in aktivem Zustand freigesetzt werden können. Beta-Glukosidase wurde als Modellenzym auf mesozellulären Silika-Schaumstoff immobilisiert. Zusätzlich wurde das Enzym durch das Ausfällen von Silika in den Kanälen des Materials eingeschlossen. Das Enzym war im eingeschlossenen Zustand nicht reaktiv und zeigte eine grosse Thermostabilität. Nach einem milden SilikaAuflösungsschritt durch die Verwendung eines fluoridhaltigen Puffers wies das Enzym wieder den grössten Teil der ursprünglichen Aktivität auf. Dieses Prinzip zur Enzymlagerung in Silika kann neben Beta-Glukosidase auch auf weitere Enzyme angewendet werden. Kapitel 4 beschreibt die Verwendung von neuartigem Silikat-beschichteten Eisen-Kohlenstoff Verbundwerkstoff für die Anreicherung von spezifischen DNA Sequenzen. Dank des magnetischen Kernes können die Partikel sehr schnell abgetrennt werden und die intrinsisch nicht-DNA
bindende
Silikatoberfläche
ermöglicht
eine
einfache
chemische
Funktionalisierungen mit Hilfe von Silanchemie. Das im Labor hergestellte Material wurde chemisch funktionalisiert um einzelsträngige DNA-Moleküle auf die Silikaoberfläche kovalent binden zu können. Das mit einzelsträngiger DNA geladene Material wurde dafür verwendet um auf selektive Art und Weise die komplementäre Sequenz aus einer Mischung von verschiedenen DNA-Sequenzen aufzukonzentrieren. Hier wird somit eine einfache, schnelle
und
zuverlässige
Methode
erarbeitet,
welche
die
selektive
Bindung,
Aufkonzentration, Aufreinigung und zum Schluss das Detektion der zu analysierenden DNASequenz ermöglicht.
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Summary Biomolecule/inorganic particle hybrid systems are well known for their existence in living organisms. They are governed by nanoscale bioprocesses that have been optimized for years. Nanotechnology is the field that largely profited from the understanding of those weak interactions and from combining the chemical and physical properties of both entities into a single unit. Throughout the last decades this has led to the development of novel, unique and smart hybrid materials which hold a great promise for both biological and non-biological applications.
In the present thesis recent advances in the design and application of
biomolecule/inorganic particle hybrids (mainly proteins and nucleic acids as biomolecules) in different disciplines are reported. Chapter 1 gives an overview of the interactions between biomolecules and inorganic materials with a focus on nanomaterials. It gives a brief introduction about the field of nanotechnology and the emerging field of bionanotechnology. In this chapter we see how biomolecules and inorganic materials interact in nature to their mutual benefit. We see how scientists exploited the understanding of these interactions for the purpose of creating a variety of hybrid materials and use them in many biological and non-biological applications. Lastly, we talk more in detail about the applications of such biomolecule-inorganic material hybrids in biocatalysis and DNA enrichment. Chapter 2 focuses on the use of enzyme/magnetic nanoparticle hybrids in biocatalysis. In the pursuit
of
robust
and
reusable
biocatalysts
for
industrial
synthetic
chemistry,
nanobiotechnology is currently taking a significant part. Recently, enzymes have been immobilized on different nanoscaffold supports. Carbon-coated metallic nanoparticles were found to be a practically useful support for enzyme immobilization due to their large surface area, high magnetic saturation, and familiar surface chemistry. Carbon-coated cobalt nanoparticles were chemically functionalized, activated for bioconjugation and subsequently used in enzyme immobilization. The enzyme-support conjugates could be recycled on a millilitre to litre scale. In Chapter 3, we talk about a novel approach to immobilize and then release enzymes from mesoporous silicates. Beta glucosidase was immobilised as a model enzyme within mesocellular foam (MCF) at a high loading. The enzyme was further entrapped within the material by precipitating additional silica within the channels. Although unreactive while entrapped, in this state the enzyme was highly stable towards heat treatments. Upon release from the matrix by a mild silica dissolution step involving a fluoride comprising buffer, the
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enzyme regained most of its original activity. The principle can be adapted to many previously developed mesoporous silica/enzyme biocomposites. Chapter 4 describes the use of novel silica-coated iron-carbon composites in DNA enrichment. The magnetic iron core allows a fast separation whereas the silica surface has an anti-fouling character and could be easily functionalized simply by silane chemistry. The inhouse produced material was further functionalized for DNA binding and single-stranded DNA sequences were covalently bound to the silica surface. The ssDNA-loaded material was used to selectively fish out the complementary oligonucleotide from a DNA mixture, from different volumes and at different concentrations. An easy, fast and reliable procedure to bind and release a target ssDNA and subsequently detect and quantify it with standard in-house equipment was shown.
