Dissertation Anna Graser

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Die Rolle des Interleukins 17A im allergischen Asthma Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat vorgelegt von Anna Graser aus Neumarkt i.d.Opf. Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2015 Vorsitzender des Promotionsorgans : Prof. Dr. Jörn Wilms Gutachter : Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Prof. Dr. Martin Herrmann Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung .................................................................................................. 10 2 Summary ................................................................................................................. 14 3 Einleitung ................................................................................................................ 17 3.1 Asthma bronchiale.................................................................................................... 17 3.1.1 Epidemiologie ...................................................................................................... 18 3.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie ........................................................................... 18 3.1.2.1 Exogen-allergisches Asthma ........................................................................ 19 3.1.2.2 Endogenes Asthma ....................................................................................... 20 3.1.2.3 Die Rolle von Rhinoviren bei Asthma bronchiale ....................................... 20 3.1.3 Asthma bronchiale bei Kindern............................................................................ 21 3.1.4 Einteilung des Asthma bronchiale nach Schweregraden ..................................... 22 3.1.5 Therapie des Asthma bronchiale .......................................................................... 23 3.2 Immunpathogenese des Asthma bronchiale ............................................................. 26 3.2.1 Polymorphkernige Granulozyten ......................................................................... 27 3.2.2 Dendritische Zellen .............................................................................................. 28 3.2.3 B-Lymphozyten .................................................................................................... 29 3.2.4 Mastzellen ............................................................................................................ 30 3.2.5 CD4+ T-Lymphozyten .......................................................................................... 31 3.2.5.1 Th1-Zellen ..................................................................................................... 33 3.2.5.2 Th2-Zellen ..................................................................................................... 34 3.2.5.3 Th9-Zellen ..................................................................................................... 36 3.2.5.4 Th17-Zellen ................................................................................................... 37 3.2.5.5 Regulatorische T-Lymphozyten ................................................................... 39 3 Inhaltsverzeichnis 3.2.5.6 Tfh-Zellen ...................................................................................................... 41 3.2.6 CD8+ T-Lymphozyten .......................................................................................... 42 3.2.7 Natürliche Killer Zellen und Natürliche Killer T-Zellen ..................................... 44 3.3 Das Zytokin IL-17A ................................................................................................. 45 3.3.1 IL-17 Rezeptoren und Signaltransduktion ........................................................... 47 3.3.2 IL-17A und Asthma bonchiale ............................................................................. 48 3.3.3 IL-17A und die virale Immunantwort .................................................................. 50 3.4 Der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg ................................................................ 51 4 Zielsetzung .............................................................................................................. 54 5 Material und Methoden ......................................................................................... 56 5.1 Material .................................................................................................................... 56 5.1.1 Laborgeräte ........................................................................................................... 56 5.1.2 Verbrauchsmaterial .............................................................................................. 57 5.1.3 Chemikalien und Reagenzien ............................................................................... 58 5.1.4 ELISA-Kits........................................................................................................... 60 5.1.5 Antikörper und Zytokine ...................................................................................... 61 5.1.6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen .............................................. 61 5.1.7 Beads zur magnetischen Zellseparation ............................................................... 61 5.1.8 Oligonukleotide .................................................................................................... 62 5.1.9 Humanes Probenmaterial (PreDicta-Studie) ........................................................ 63 5.1.10 Rhinovirus 1b (RV1b) .......................................................................................... 66 5.1.11 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 67 5.1.11.1 Zellkulturmedium für humane PBMCs .................................................... 67 5.1.11.2 Zellkulturmedium für humane A549 Zellen ............................................ 67 5.1.11.3 Puffer für die Genotypisierung von Mäusen ............................................ 67 4 Inhaltsverzeichnis 5.1.11.4 Puffer und Lösungen für die Zellisolation und Zellkultur ....................... 68 5.1.11.5 Puffer und Lösungen für ELISA .............................................................. 69 5.1.11.6 Kulturmedium für die Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark ........................................................................................... 70 5.2 5.1.11.7 Tyrod´s Puffer für Histamin-Release aus Mastzellen (pH 7,4) ................ 70 5.1.11.8 Sontige Puffer und Lösungen ................................................................... 71 Methoden .................................................................................................................. 72 5.2.1 PreDicta-Studie .................................................................................................... 72 5.2.1.1 RNA Isolation aus dem Vollblut .................................................................. 74 5.2.1.2 Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus dem Vollblut ..................... 75 5.2.1.3 Zellkultur der PBMCs .................................................................................. 76 5.2.1.4 Entnahme des Nasenabstrichs und Rhinovirusdetektion ............................. 76 5.2.2 Zellkultur mit der humanen Epithelzelllinie A549 .............................................. 77 5.2.3 Murine Studien ..................................................................................................... 77 5.2.3.1 Versuchstiere und Genotypisierung ............................................................. 77 5.2.3.2 Induktion des allergischen Asthma bronchiale ............................................ 78 5.2.3.3 Induktion der Atemwegstoleranz ................................................................. 79 5.2.3.4 Messung des Atemwegswiderstandes .......................................................... 79 5.2.3.5 Gewinnung und Analyse der Bronchoalveolären Lavage (BAL) ................ 81 5.2.3.6 Organpräperation .......................................................................................... 82 5.2.3.7 Gesamtzellisolation aus Lunge, Milz und Lymphknoten............................. 83 5.2.3.8 Isolation der CD4+ T-Zellen und CD11c+ T-Zellen ..................................... 83 5.2.3.9 Zellkultur der isolierten CD4+ und CD11c+ Lungenzellen .......................... 85 5.2.3.10 Transfektion der CD4+ T-Zellen der Milz mit Il-17a siRNA .................. 85 5.2.3.11 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark............................... 87 5 Inhaltsverzeichnis 5.2.3.12 Histamin-Release ..................................................................................... 88 5.2.4 Infektion von Zellen mit dem Rhinovirus 1b ....................................................... 88 5.2.5 Rhinovirus PCR.................................................................................................... 88 5.2.6 RNA-Extraktion ................................................................................................... 89 5.2.7 Microarray ............................................................................................................ 90 5.2.8 cDNA-Synthese .................................................................................................... 91 5.2.9 Quantitative real-time PCR (qPCR) ..................................................................... 92 5.2.10 Durchflusszytometrie ........................................................................................... 93 5.2.10.1 Oberflächenfärbung .................................................................................. 95 5.2.10.2 Intrazelluläre Färbung .............................................................................. 95 5.2.11 Enzyme linked Immunosorbent Assay ................................................................. 96 5.2.12 Histologie ............................................................................................................. 98 5.2.13 Statistik ................................................................................................................. 99 6 Ergebnisse ............................................................................................................. 100 6.1 Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse in einem Modell allergischen Asthmas .................................................................................................................. 100 6.1.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation ......... 101 6.1.2 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage ................................................................................. 102 6.1.3 Analyse der Mastzellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen .............. 103 6.1.4 Ermittlung des Entzündungsgrades und Mukusproduktion in der Lunge .......... 108 6.1.5 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum .................................................. 110 6.1.6 Analyse der Th2- und Th1-Zytokine in der Lunge .............................................. 111 6.1.7 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen .............. 115 6.2 Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse im Atemwegstoleranzmodell . 117 6 Inhaltsverzeichnis 6.2.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation im Toleranzmodell................................................................................................... 118 6.2.2 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum .................................................. 119 6.2.3 Analyse der Th2-Zellen nach Induktion der Atemwegstoleranz ........................ 120 6.2.4 Analyse der Treg-Zellen im Toleranzmodell ....................................................... 121 6.2.5 Analyse der Tfh-Zellen im Atemwegstoleranzmodell ........................................ 124 6.3 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A in einem murinen Modell allergischen Asthmas ................................................................................. 127 6.3.1 Analyse der Genexpression in CD4+ T-Zellen der Lunge mittels Microarray... 128 6.3.2 Analyse der Oas1g mRNA Expression mittels qPCR ....................................... 130 6.3.3 Analyse der Ifn mRNA Expression in unterschiedlichen Zelltypen ................ 133 6.3.4 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ........ 134 6.3.5 Unterdrückung der Il-17a Genexpression mittels siRNA .................................. 135 6.3.6 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A nach Infektion verschiedener Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b ............................................... 139 6.3.6.1 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von Mastzellen mit dem Rhinovirus 1b.................................................................................................. 140 6.3.6.2 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von CD4+ T-Zellen der Lunge mit dem Rhinovirus 1b ........................................................................ 142 6.4 Die Rolle des Interleukins 17A im Krankheitsbild Asthma bronchiale bei Vorschulkindern ..................................................................................................... 146 6.4.1 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 Genexpression in PBMCs ............................................................................................................................ 147 6.4.2 Analyse der IFN und TYK2 Genexpression in PBMCs ................................... 148 6.4.3 Analyse von IL-17A-inhibierenden Faktoren .................................................... 149 7 Inhaltsverzeichnis 6.4.4 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A in der humanen Epithelzellline A549 ........................................................................................... 151 6.4.5 Analyse der Einflussnahme von Arzneimitteln auf die antivirale Immunantwort ............................................................................................................................ 153 7 Diskussion ............................................................................................................. 155 7.1 IL-17A beeinflusst den Phänotyp bei allergischem Asthma bronchiale ................ 159 7.1.1 IL-17A beeinflusst die Entstehung der AHR ..................................................... 159 7.1.2 IL-17A fördert neutrophile Granulozyten .......................................................... 161 7.1.3 IL-17A ist ein wichtiger Faktor für die Differenzierung und das Überleben von Mastzellen aus dem Knochenmark..................................................................... 162 7.1.4 IL-17A hat keinen Einfluss auf die bronchiale Entzündung, aber auf die bronchiale Mukusproduktion ............................................................................. 163 7.1.5 IL-17A ist nicht direkt am Immunglobulin-Klassenwechsel beteiligt ............... 164 7.1.6 IL-17A beeinflusst Th1- und Th2-Zytokine ........................................................ 165 7.1.7 IL-17A nimmt keinen Einfluss auf Treg-Zellen im murinen Asthmamodell ...... 166 7.2 IL-17A ist an der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt .............................. 167 7.2.1 Die Atemwegstoleranz beeinflusst die Entstehung der AHR und die IgE-Spiegel negativ ................................................................................................................ 167 7.2.2 IL-17A inhibiert IL-10 und TGF- im Toleranzmodell ..................................... 169 7.2.3 IL-17A inhibiert follikuläre T-Helferzellen im Toleranzmodell ........................ 170 7.3 IL-17A ist an der antiviralen Immunantwort nach Infektionen mit Rhinoviren beteiligt ................................................................................................................... 172 7.3.1 Beeinträchtigung antiviraler Gene in IL-17A defizienten Zellen im murinen Modell allergischen Asthmas ............................................................................. 172 7.3.2 Rhinoviren inhibieren IL-17A in den PBMCs von Kindern mit Asthma .......... 177 8 Inhaltsverzeichnis 7.3.3 IL-17A induziert die antivirale Immunantwort in Epithelzellen ........................ 179 7.3.4 Arzneimittel beeinflussen die antivirale Immunantwort .................................... 180 8 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 182 9 Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 198 10 Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 201 11 Formelverzeichnis ................................................................................................ 202 12 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 203 13 Publikationen ........................................................................................................ 209 14 Danksagung........................................................................................................... 212 9 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Die chronisch entzündliche Erkrankung Asthma bronchiale ist charakterisiert durch eine Hyperreaktivität und reversible Obstruktion der Atemwege, Mukushypersekretion, irreversible bronchiale Umbauprozesse und damit einhergehend wiederholt auftretende Symptome akuter Atemnot, begleitet von Husten und pfeifenden Atemgeräuschen. Das allergische Asthma bronchiale beruht auf einer Überempfindlichkeitsreaktion gegenüber eigentlich harmlosen Antigenen. Dies ist die Folge einer unzureichenden immunologischen Toleranz. Bei Asthmatikern ist v. a. das Gleichgewicht zwischen regulatorischen T-Zellen, Th1- und Th2-Zellen zugunsten einer Th2-Immunantwort verschoben. Es hat sich aber vor Kurzem auch gezeigt, dass Th17-Zellen und das von ihnen produzierte „Interleukin“ IL-17A mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Daher sollte der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Analyse der Rolle des Zytokins IL-17A im allergischen Asthma bronchiale liegen. Für die Untersuchungen in einem murinen Modell allergischen Asthmas wurden Wildtyp- und IL-17A defiziente Mäuse verwendet. Es konnte beobachtet werden, dass IL-17A defiziente Mäuse eine verstärkte Atemwegshyperreaktivität (AHR) aufwiesen, was mit einer vermehrten Produktion des Zytokins IL-13 einherging. Der Anteil der neutrophilen Granulozyten sowie die Anzahl an mukusproduzierenden Zellen war im Vergleich zu asthmatischen Wildtyp-Mäusen verringert. Weiterhin fiel auf, dass in Abwesenheit von IL-17A die Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark und deren Fähigkeit Histamin zu produzieren und zu speichern stark eingeschränkt war. In asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen wurde besonders das für Th2-Zellen typische Zytokin IL-4 vermehrt gebildet, wohingegen der für Th1-Zellen typische Botenstoff IFN- nur vermindert freigesetzt wurde. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte untersucht werden, ob IL-17A an der Vermittlung der Immuntoleranz beteiligt ist. Für diese Untersuchungen wurde in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen eine Atemwegstoleranz induziert. Es konnte beobachtet werden, dass 10 Zusammenfassung IL-17A defiziente Mäuse im Toleranzmodell eine deutlich geringere AHR aufwiesen, als asthmatische IL-17A defiziente Mäuse. Sie reagierten jedoch immer noch stärker als tolerogene Wildtyp-Mäuse. Im Toleranzmodell konnte bei IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verringerte Differenzierung von regulatorischen CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen beobachtet werden, wohingegen Il-10 und Tgf vermehrt exprimiert wurden. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass bei tolerogenen IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu tolerogenen Wildtyp- Mäusen die Genexpression von Il-21, Il-21r, Il-6, Il-6r und Cxcr5 anstieg, was für eine vermehrte Differenzierung von follikulären T-Helferzellen spricht. Diese Zellen tragen zur B-Zell-vermittelten Toleranz bei. Weiterhin ist bereits bekannt, dass die IL-6/IL-6R-Achse regulatorische T-Zellen inhibiert, welche eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung der immunologischen Toleranz einnehmen. Daher bedarf es in diesem Modell noch weiterer Untersuchungen, um herauszufinden, ob die suppressiven Eigenschaften der regulatorischen T-Zellen in Abwesenheit von IL-17A unterdrückt werden. Es ist bereits bekannt, dass Rhinoviren in Hinblick auf Aeroallergene die Induktion der Atemwegstoleranz negativ beeinflussen. Außerdem spielen Rhinoviren bei der Pathogenese des Asthma bronchiale eine wichtige Rolle, da sie als Auslöser der Erkältungskrankheit häufig für Verschlimmerungen der Asthmasymptomatik verantwortlich sind. In einem weiteren Abschnitt dieser Arbeit sollte untersucht werden, wie sich virale Infektionen auf den Verlauf des Asthmas auswirken und welche Rolle IL-17A in diesem Zusammenhang spielt. Mit Hilfe humaner PBMCs von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern konnte gezeigt werden, dass eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen zu einer verminderten Freisetzung und Genexpression von IL-17A und der antiviralen 2´-5´Oligoadenylatsynthetase 1 (OAS1) innerhalb der Asthmagruppe führte. Dies ging einher mit einer vermehrten Genexpression des Th1-typischen Transkriptionsfaktors T-BET, welcher in der Lage ist, die 11 Zusammenfassung IL-17A Produktion zu inhibieren. Weiterhin konnte bei diesen Kindern beobachtet werden, dass sich die Einnahme von Steroiden bei Kindern mit Asthma negativ auf die OAS1 und IL-17A Genexpression auswirkte. Weitere Untersuchungen im murinen Modell konnten zeigen, dass sowohl in naiven als auch asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen Oas1g, ein Mitglied der antiviralen OAS1-Familie, im Lungengewebe, in den Lymphknoten, in CD4+ und CD11c+ Lungenzellen sowie in Mastzellen aus dem Knochenmark stark vermindert exprimiert wurde. In den CD4+ und CD11c+ Lungenzellen war gleichzeitig auch die Ifn Genexpression beeinträchtigt. Der direkte Einfluss von IL-17A auf die Genexpression von Oas1g konnte durch den Einsatz einer Il-17a siRNA bestätigt werden. Auch CD8+ T-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Viren. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an CD8+ T-Zellen in naiven IL-17A defizienten Mäusen vermindert war und somit Auswirkungen auf die virale Clearance haben könnte. Für weitere Untersuchungen wurden verschiedene Zelltypen in vitro mit dem Rhinovirus 1b infiziert. Es konnte beobachtet werden, dass sowohl IL-17A defiziente Mastzellen aus dem Knochenmark als auch naive CD4+ Lungenzellen nicht in der Lage waren, die Virusreplikation zu unterdrücken, was mit einer stark reduzierten Oas1g mRNA Expression einherging, während die Ifn Genexpression nicht beeinträchtigt war. Dies weist daraufhin, dass IL-17A Oas1g in diesen Zellen induziert und dadurch die Virusreplikation unterdrückt, während es keinen Einfluss auf Ifn hat. Bei CD4+ T-Zellen aus der Lunge von asthmatischen Wildtyp-Mäusen nahm nach der Infektion die IL-17A Produktion ab, wodurch sich der Rhinovirus ähnlich stark replizieren konnte wie in IL-17A defizienten Zellen astmatischer Mäuse. Vor dem Hintergrund einer 12 Zusammenfassung Asthmaerkrankung weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der Rhinovirus IL-17A inhibiert, um so die antivirale Immunantwort des Wirts abzuschwächen. Zusammenfassend zeigen die durchgeführten Untersuchungen, dass das Zytokin IL-17A sowohl beim Verlauf des allergischen Asthma bronchiale als auch bei der antiviralen Immunantwort eine wichtige Rolle spielt. Weiterhin scheint dieses Zytokin auch bei der Vermittlung der immunologischen Toleranz beteiligt zu sein. 13 Summary 2 Summary Asthma bronchiale, a chronic inflammatory disease of the airways is characterized by airway hyperresponsiveness (AHR), reversible airway obstruction and increased mucus production associated with repeated episodes of acute shortness of breath, coughing and wheezing. Allergic asthma is caused by a hypersensitivity reaction in response to an innocuous antigen. This is the result of an insufficient immunological tolerance. In asthmatic patients there is an imbalance among regulatory T cells, Th1- and Th2 cells towards a Th2 mediated immune response. Recently, it has been shown that Th17 cells and their key cytokine “interleukin” IL-17A positively correlates with the severity of the disease. The principal aim of this study was to investigate the role of IL-17A in allergic asthma. For this purpose a murine model of allergic asthma in wild-type and IL-17A deficient mice was analyzed. In these experiments, asthmatic IL-17A deficient mice showed higher AHR than wild-type mice which goes along with an increased production of IL-13 in these mice. Compared to asthmatic wild-type mice, asthmatic IL-17A deficient mice had reduced amounts of neutrophils and mucus producing cells in their airways. Furthermore, we noticed that the differentiation of mast cells from the bone marrow and their ability to produce and store histamine was reduced in the absence of IL-17A. In asthmatic IL-17A deficient mice the Th2 cytokine IL-4 was induced, whereas the levels of IFN-, the key mediator of Th1 cells, were reduced. Furthermore, we investigated the role of IL-17A on immunological airway tolerance. To this aim we induced airway tolerance in wild-type and IL-17A deficient mice. Here, IL-17A deficient mice showed decreased AHR compared to their asthmatic littermates. However, the AHR was still increased compared to asthmatic wild-type mice. In tolerogenic IL-17A deficient mice the number of CD4+CD25+Foxp3+ T regulatory cells was significantly decreased compared to tolerogenic wildtype-mice, although the Il-10 and Tgf mRNA expression was up-regulated. In addition, it could be observed that the gene expression of 14 Summary Il-21, Il-21r, Il-6, Il-6r and Cxcr5 was induced in IL-17A deficient mice compared to wild-type mice in the airway tolerance model. This indicates increased differentiation of follicular T helper cells which contribute to the B cell mediated immunological tolerance. Furthermore, the IL-6/IL-6R axis has been demonstrated to inhibit T regulatory cells which are key players in tolerance. Further experiments are needed to prove whether the suppressive function of the T regulatory cells in this model is inhibited in the absence of IL-17A. It is already known that infections with Rhinovirus interfere with the induction of tolerance to aeroallergens. The Rhinovirus plays an important role in the pathogenesis of asthma, because it is the primary cause of common colds and could cause an exacerbation of the disease. Therefore, one part of this thesis comprises the analysis of the impact of infections with Rhinovirus on the pathogenesis of asthma and the role of IL-17A in this context. By the use of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of healthy and asthmatic children, it could be observed that infections of the upper airways with Rhinoviruses leads in asthmatic children to a decreased secretion and gene expression of IL-17A and the anti-viral 2´-5´oligoadenylate synthetase 1 (OAS1). This observation goes along with an up-regulated T-BET mRNA expression. This key Th1 transcription factor is known to inhibit IL-17A production. In addition, by further analyzing the PBMCs of asthmatic children it could be shown that the treatment with steroids negatively regulates the OAS1 and IL-17A gene expression in these children. Furthermore, murine studies showed a decreased gene expression of Oas1g, a member of the antiviral OAS1 family, in lung tissue, lymph nodes, CD4+ and CD11c+ lung cells of naïve and asthmatic IL-17A deficient mice as well as in mast cells generated from the bone marrow of IL-17A deficient mice. In addition, in CD4+ as well as in CD11c+ lung cells the Ifn mRNA expression was down-regulated. By using Il-17a siRNA, it could be confirmed that IL-17A directly affects the expression of Oas1g. CD8+ T cells play an important role on the anti-viral immune response. Here, the number of 15 Summary CD8+ T cells was decreased in naïve IL-17A deficient mice. This could contribute to the reduced viral clearance observed in the absence of IL-17A. In further experiments different cell types were infected with Rhinovirus 1b in vitro. It could be observed that IL-17A deficient mast cells from the bone marrow as well as lung CD4+ T cells of naïve IL-17A deficient mice were not able to clear the Rhinovirus infection. Tallying with this, Oas1g gene expression could hardly be detected although Ifn mRNA expression was not affected in infected cells. This indicates that IL-17A induces Oas1g in these cells, but has no impact on Ifn. The production of IL-17A by lung CD4+ T cells of wild-type mice was decreased after infection with Rhinovirus 1b and thus resulted in a similar viral replication compared to cells from asthmatic IL-17A deficient mice. This indicates that the Rhinovirus inhibits IL-17A in the context of bronchial asthma to damp the anti-viral immune response of the host. In summary, the results show that IL-17A plays an important role in the pathogenesis of bronchial asthma as well as in the anti-viral immune response. Furthermore, it seems that IL-17A is also involved in the induction of airway tolerance. 16 Einleitung 3 Einleitung 3.1 Asthma bronchiale Der Begriff „Asthma“, vom griechischen „άσυμα“, bedeutet Atemnot und wurde erstmals von Homer in der „Ilias“ (8. Jahrhundert v. Chr.) verwendet, wobei dieser Asthma als ein normales Keuchen und Schnaufen der Helden im Kampf um Troja darstellte. Bis weit ins 20. Jahrhundert ging man davon aus, dass Asthma bronchiale eine Erkrankung der Bronchialmuskulatur ist und durch neurogene Einflüsse auf die Muskulatur der Atemwege entsteht. Die Erkenntnis, dass Asthma bronchiale auf eine anhaltende Entzündung der Atemwege zurückzuführen ist, setzte sich erst vor etwa 20 Jahren durch (Reuter, 2004; Mutschler et al., 2008). Nach dem aktuellen Stand der Wissenschaft definiert man Asthma bronchiale als eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege die mit einer Überempfindlichkeit (Hyperreaktivität) der Atemwege gegenüber unterschiedlichsten Faktoren einhergeht (Reuter, 2004). Das Kardinalssymptom dieser Erkrankung sind wiederholt auftretende Episoden akuter Atemnot, die v. a. nachts und in den frühen Morgenstunden auftreten, wenn die Plasmaspiegel verschiedener Nebennierenrindenhormone (z. B. Cortisol), deren Freisetzung einem zirkadianen Rhythmus unterliegen, am geringsten sind (Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008; Kim et al., 2010b). Zu den weiteren Symptomen gehören einerseits Husten, pfeifende oder brummende Atemgeräusche, ein Engegefühl im Burstkorb und Kurzatmigkeit sowie eine reversible Obstruktion der Atemwege, eine bronchiale Hyperreaktivität und eine Entzündung der Atemwege. Die Atemwegsobstruktion wird im Wesentlichen durch die Kontraktion der glatten Muskulatur der Bronchien, Ödeme der Atemwegswände, übermäßige Schleimproduktion und irreversible Umbauvorgänge verursacht (s. Abb. 3-1) (Finotto and Glimcher, 2004; Reuter, 2004; Ukena et al., 2008). 17 Einleitung Abb. 3-1 Querschnitt durch einen gesunden (linke Abbildung) und einen asthmatischen (rechte Abbildung) Bronchus. Im Gegensatz zu einem gesunden Bronchus ist bei einem erkrankten Bronchus die Schleimhaut stark angeschwollen und das Bronchialgewebe entzündet. Zusätzlich wird vermehrt Schleim produziert. (verändert nach (Freund et al., 2008)) 3.1.1 Epidemiologie Mit weltweit mehr als 300 Millionen Betroffenen und steigender Prävalenz v. a. in den Industrienationen gehört Asthma bronchiale zu den großen Volkskrankheiten, wobei Menschen jeder Altersstufe betroffen sein können (Reuter, 2004; Barnes, 2010). In Deutschland sind etwa 5 % der erwachsenen und 10 % der kindlichen Bevölkerung betroffen. Pro Jahr sterben in Deutschland mehr als 2000 Menschen an den Folgen der Erkrankung. Neben den gesundheitlichen Einschränkungen verursacht Asthma bronchiale auch erhebliche ökonomische Aufwendungen (Reuter, 2004; Ukena et al., 2008). 3.1.2 Ätiologie und Pathophysiologie Nach den auslösenden Ursachen, den sogenannten Triggern, unterscheidet man das exogen-allergische (extrinsische) Asthma vom nicht-allergischen (intrinsischen) Asthma. Im Kindesalter ist Asthma bronchiale hauptsächlich allergisch bedingt, wohingegen bei 30 - 50 % der erwachsenen Betroffenen keine Allergie nachweisbar ist. Die beiden Formen, allergisches und nicht-allergisches Asthma, sind selten in reiner Form ausgeprägt. In 70 - 80 % der Fälle treten sie als Mischform auf (Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008). 18 Einleitung 3.1.2.1 Exogen-allergisches Asthma Das häufigere vorkommende exogen-allergische Asthma tritt bei genetisch prädisponierten Personen, den sogenannten (Immunglobulin E)-vermittelten Atopikern auf. Es beruht Überempfindlichkeitsreaktion auf gegenüber einer IgE eigentlich harmlosen Allergenen. Diese Allergene können von unterschiedlichster chemischer Struktur (z. B. Eiweiße, niedermolekulare Stoffe, Kohlenhydrate) und Herkunft (z. B. Tiere, Hausstaub, Pflanzen, Schimmelpilze) sein. In der sogenannten Sensibilisierungsphase kommt der Organismus zum ersten Mal mit dem Allergen in Kontakt und bildet daraufhin spezifische IgE-Antikörper, welche sich auf der Oberfläche von Mastzellen, sowie eosinophilen und basophilen Granulozyten festsetzen. Nach erneutem Allergenkontakt und Kreutzvernetzung (cross-linking) benachbarter IgE-Antikörper kommt es zur Degranulation dieser Zellen und somit zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren wie Histamin, Serotonin und Proteasen. Anfangs sind an dieser Reaktion Mastzellen beteiligt, die sich an der Oberfläche der Bronchialschleimhaut befinden. Da die freigesetzten Entzündungsmediatoren jedoch das Bronchialepithel schädigen, werden auch Mastzellen und Entzündungszellen in tieferen Gewebeschichten zur Degranulation und Freisetzung von Mediatoren veranlasst. Durch das geschädigte Epithel können nun Allergene in den subepithelialen Raum gelangen, wo sie von Makrophagen internalisiert und an spezifische T-Zellrezeptoren von CD4+ T-Lymphozyten präsentiert werden. Auf diesem Weg differenzieren die T-Lymphozyten v. a. zu T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2-Zellen), welche wiederum die IgE-Produktion steigern und eosinophile und basophile Granulozyten rekrutieren und aktivieren. Dies führt dann zur weiteren Freisetzung und Neusynthese von Mediatoren und Botenstoffen, welche die für den Asthmaanfall typischen Symptome wie z. B. Bronchokonstriktion, Hyperkrinie und Mukosaödeme hervorrufen. Im Laufe der Zeit und mit zunehmender Schwere der Krankheit können neben den eigentlichen Allergenen auch unspezifische Reize die Asthmasymptome hervorrufen (Mutschler et al., 2008; Galli and Tsai, 2012). 19 Einleitung 3.1.2.2 Endogenes Asthma Das nicht-allergische endogene Asthma wird nicht durch spezifische Allergene sondern durch andere Reize verursacht. Zu diesen Reizen gehören u. a. Infektionen der Atemwege, Tabakrauch, Kaltluft, körperliche Anstrengung und Arzneimittel (z. B. Analgetikaasthma). Man geht davon aus, dass diese nicht-allergenen Auslöser jedoch nicht ursächlich für die Erkrankung sind. Vielmehr nimmt man an, dass eine Hyperreagibilität des Bronchialsystems Voraussetzung für die Entwicklung des endogenen Asthmas ist (Reuter, 2004; Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008). 3.1.2.3 Die Rolle von Rhinoviren bei Asthma bronchiale Virale Infektionen, insbesondere Rhinoviren, spielen bei Asthma-Anfällen eine wichtige Rolle. Der weltweit vorkommende Rhinovirus ist der Auslöser von Erkältungskrankheiten. Beim Rhinovirus handelt es sich um einen unbehüllten, relativ kleinen (Durchmesser 24 - 30 nm), lytischen RNA (Ribonukleinsäure, engl. Ribonucleic acid) Virus innerhalb der Picornaviridae Familie. Es gibt mehr als 100 verschiedene Serotypen, die man danach unterteilt, an welchen zellulären Rezeptor sie binden. Die rund 90 % Serotypen der Hauptgruppe binden an das Protein ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), welches sich z. B. auf der Oberfläche von Epithelzellen befindet. Zu dieser Gruppe gehören beispielsweise der Rhinovirus 14 und 16. Die Rhinoviren der kleineren Gruppe von ca. 10 % binden dagegen an Proteine der LDL (low density lipoprotein) Rezeptorengruppe. Zu diesen Serotypen zählt u. a. der Rhinovirus 1b (Hadfield et al., 1997; Deszcz et al., 2005; Kapikian et al., 1972; Newcomb et al., 2008). Das durch Viren verursachte Giemen (Keuchen) ist mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit an Asthma zu erkranken assoziiert (Le Souëf, 2009). Ob jedoch ein kausaler Zusammenhang besteht, ist noch nicht eindeutig geklärt und wird kontrovers diskutiert (Schmidt, 2011). 20 Einleitung Prinzipiell können Viren bei bestehendem Asthma bronchiale eine Exazerbation auslösen und stellen die häufigste Ursache für eine Verschlimmerung der Symptome dar. So geht man davon aus, dass bei Kindern in 80 – 85 %, bei Erwachsenen in 44 % der Fälle eine virale Infektion eine Krankheitsverschlimmerung auslöst (Duff et al., 1993; Sterk, 1993; Tan, 2005; Jackson, 2010; Schmidt, 2011; Newcomb et al., 2013). Ob Viren, insbesondere Rhinoviren, die Ursache für eine Asthmaerkrankung darstellen, konnte noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Gehäufte virale Infektionen der oberen Atemwege im Kindesalter scheinen mit einer niedrigen Prävalenz von späteren Asthma bronchiale assoziiert zu sein (Illi et al., 2001). Besonders bei Rhinovirus-bedingten Infektionen gilt jedoch, dass das gleichzeitige Auftreten von Symptomen der unteren Atemwege (Giemen) zu einer erhöhten Wahrscheinlichkeit führt, später an Asthma bronchiale zu erkranken. Bis jetzt konnte auch noch nicht eindeutig geklärt werden, ob Viren zu einer Asthma-Prolongation beitragen (Tan et al., 2003; Jackson et al., 2008; Gern, 2009; Kuehni et al., 2009; Thomsen et al., 2009; Schmidt, 2011). 3.1.3 Asthma bronchiale bei Kindern Bei Kindern ist Asthma bronchiale die häufigste chronische Erkrankung überhaupt. Deutschlandweit ist etwa jedes zehnte Kind unter 15 Jahren betroffen, wobei in 70 % der Fälle die Krankheit vor dem 5. Lebensjahr ausbricht. Leider wird diese Erkrankung bei Kindern oft übersehen oder erst zu spät behandelt (Kabesch, 2007; Freund et al., 2008; Berdel, 2010; Bundesärztekammer et al., 2013). Bei etwa der Hälfte aller betroffenen Kleinkinder verschwindet das Asthma bis zum 7. Lebensjahr oder spätestens im Laufe der Pubertät. Bei der anderen Hälfte kommt es zur Chronifizierung mit anhaltenden Beschwerden auch im erwachsenen Alter. Man geht davon aus, dass bei Kindern zwei Hauptfaktoren für die Entstehung der Erkrankung verantwortlich sind, nämlich eine genetische Prädisposition sowie das Auftreten bestimmter Umweltfaktoren. Bei Kindern und Jugendlichen stellen Allergien 21 Einleitung den stärksten Risikofaktor dar. Kinder von Allergikern neigen besonders dazu, selbst eine Allergie zu entwickeln. Ebenfalls in diesem Zusammenhang ist die sogenannte „Hygiene-Hypothese“ zu erwähnen. Dieser Hypothese liegt die Beobachtung zugrunde, dass es in den zivilisierten Ländern zu einer Art Sterilisierung der Lebensräume kommt. Dies führt dazu, dass das Immunsystem während der Kindheit immer seltener mit bakteriellen, parasitären und viralen Erregern in Kontakt tritt. Gemäß der Hygiene-Hypothese wirkt sich dieser Zustand negativ auf die Entwicklung des Immunsystems aus, so dass es sich beispielsweise gegen eigentlich harmlose Stoffe (z. B. Pollen) richtet. Die Hypothese wird u. a. durch Beobachtungen gestützt, dass Kinder, die in einem „dreckigen“ Umfeld aufwachsen, seltener Allergien entwickeln (Strachan, 1989; Kabesch and Lauener, 2004; Schaub et al., 2006; Okada et al., 2010). Bei Kindern kann häufig ein sogenannter Etagenwechsel beobachtet werden. Dies bedeutet, dass zunächst z. B. eine Neurodermitis vorliegt, welche sich zwar im Laufe der Zeit bessert, stattdessen aber allergische Reaktionen in den Atemwegen auftreten (Kabesch, 2007; Freund et al., 2008). Wie in Kapitel 3.1.2.3 bereits beschrieben, scheinen auch virale Infekte zur Pathogenese des Asthma bronchiale beizutragen. Man geht davon aus, dass gehäufte virale Infekte in frühen Lebensjahren gesunde Kinder vor Asthma schützen, wohingegen sie sich bei bereits erkrankten Kindern eher negativ auswirken (Illi et al., 2001; Freund et al., 2008; Schmidt, 2011). 3.1.4 Einteilung des Asthma bronchiale nach Schweregraden Zur Therapieüberwachung und Selbstkontrolle wird die maximale Atemstromstärke (peak expiratory flow, PEF) mithilfe des sogenannten „Peak-Flow-Meters“ bestimmt. Eine Verengung des Querschnitts der Atemwege bewirkt eine verminderte Luftströmung, die mittels des Peak-Flow-Meters erfasst werden kann. Sinkende PEF-Werte können z. B. auf 22 Einleitung einen Asthmaanfall hindeuten. Je nach Schwere der Symptome des Asthma bronchiale können vier Stufen unterschieden werden (Tabelle 3-1). Die Einteilung nach Schweregrad ist v. a. bei der Erstbeurteilung eines Patienten sinnvoll. Während der Therapie ist jedoch das Ansprechen auf die Maßnahmen von größerer Bedeutung (Reuter, 2004; Mutschler et al., 2008). Tabelle 3-1 Schweregrad – Einteilung des stabilen Asthma bronchiale bei Erwachsenen (nach (Mutschler et al., 2008)) 3.1.5 Therapie des Asthma bronchiale Die Therapie des Asthma bronchiale richtet sich nach dem Schweregrad der Erkrankung. Das oberste Ziel der Therapie ist in allen Fällen die Verbesserung der Lebensqualität und Prognose durch Kontrolle der Asthmasymptome und Vermeidung akuter Exazerbationen. Außerdem wird danach gestrebt, eine möglichst normale Lungenfunktion zu erreichen, um so – unter Vermeidung von unerwünschten Nebenwirkungen - normale körperliche Aktivitäten aufrechtzuerhalten. Ziel der Pharmakotherapie ist es, die asthmatische Entzündung zu unterdrücken sowie die bronchiale Hyperreaktivität und Atemwegsobstruktion zu vermindern. Grundsätzlich kann man die zu Therapiezwecken verwendeten Medikamente in zwei Gruppen einteilen: Bedarfsmedikamente (sogenannte Reliever) und Dauermedikamente (sogenannte Controller). Die Reliever dienen der raschen Bronchospasmolyse und werden bei akutem Bedarf angewandt. Zu dieser Medikamentengruppe zählen hauptsächlich inhalative, rasch 23 Einleitung wirksame β2-Sympathomimetika, wie z. B. Salbutamol, Fenoterol oder Terbutalin. Die für die Langzeittherapie verwendeten Controller sollen die zugrunde liegende Entzündung unterdrücken und so die Häufigkeit der Asthmaanfälle vermindern. Zu dieser Medikamentengruppe gehören inhalative Corticosteroide (ICS) wie Budesonid und Beclometason, langwirksame β2-Sympathomimetika wie Formoterol und Salmeterol sowie Leukotrienantagonisten (LTRA) wie z. B. Montelukast. Die Therapie folgt einem dem Schweregrad entsprechenden Stufenplan (Abb. 3-2), wobei in jeder Behandlungsstufe ein Reliever zur raschen Symptomverbesserung beinhaltet ist. Abb. 3-2 Stufentherapie für die Langzeittherapie des Asthma bronchiale bei Erwachsenen: ICS: inhalative Corticosteroide; LABA: langwirksame β2-Agonisten, LTRA: Leukotrienantagonisten; RABA: kurzwirksame β2-Agonisten (nach den Empfehlungen der deutschen Atemwegsliga und der deutschen Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin e. V.) Eine kontinuierliche Beurteilung der Asthmakontrolle (s. Tabelle 3-2) ist von essentieller Bedeutung, um während der Therapie das Ansprechen auf die vorgenommenen Maßnahmen beurteilen zu können. Demzufolge richtet sich der Einsatz der Medikamente stark nach der Kontrolle des Asthmas und führt nach deren Überprüfung entweder zu einer 24 Einleitung Therapieintensivierung oder zu einer schrittweisen Reduktion der Dosis der Dauermedikamente (s. Tabelle 3-2). Tabelle 3-2 Grad der Asthmakontrolle bei Erwachsenen: # ein bis zwei Kriterien innerhalb einer Woche erfüllt, FEV1 = Einsekundenkapazität (nach (Silverman, 2007; Zhao et al., 2012; Bundesärztekammer et al., 2013)) Beim rein allergischen Asthma bronchiale greift man noch auf zusätzliche Therapiemaßnahmen zurück. Zum einen sollte der auslösende Stoff gemieden werden (Allergenkarenz), zum anderen besteht die Möglichkeit der De- bzw. Hyposensibilisierung, (spezifische Immuntherapie, SIT), wobei der Patient mittels spezieller Impfstoffe gegen das Allergen „unempfindlich“ gemacht wird. Diese Therapieform eignet sich z. B. bei einer Pollen- oder Hausstaubmilbenallergie, wenn Karenzmaßnahmen und die medikamentöse Therapie zu unzureichenden Ergebnissen führen. Wie vorher bereits erwähnt spielt IgE bei der allergischen Reaktion eine wichtige Rolle. Somit bieten sich monoklonale anti-IgE-Antikörper wie z. B. Omalizumab als Therapeutikum an. Dieser anti-IgE-Antikörper richtet sich spezifisch gegen ein Epitop im konstanten Teil (Fc-Teil) des IgE Antikörpers. Frei zirkulierende IgE-Moleküle können damit komplexiert und so deren Bindung an den IgE-Rezeptor auf den Mastzellen verhindert werden (Holgate and Polosa, 2008; Mutschler et al., 2008; Ukena et al., 2008; Piening et al., 2009; Andreev et al., 2012). 25 Einleitung 3.2 Immunpathogenese des Asthma bronchiale Die Immunpathogenese des Asthma bronchiale ist sehr komplex und vielschichtig. Immunologische Faktoren spielen hierbei eine zentrale Rolle. Ursprünglich ging man davon aus, dass im Wesentlichen Mastzellen an der Immunpathogenese der Erkrankung beteiligt sind. Mittlerweile ist allerdings bekannt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, wie z. B. Dendritische Zellen, Lymphozyten, Makrophagen oder Granulozyten an der asthmatischen Reaktion beteiligt sind, welche wiederum Mediatorsubstanzen freisetzen und somit direkte Effekte auf lokale Zellen wie Muskelzellen und die Kapillarpermeabilität haben. Entsprechend ihrer im Vordergrund stehenden Funktion während der Entzündungsreaktion kann man die beteiligten Zelltypen grob in vier Gruppen unterteilen:  Initiierende und amplifizierende Zellen: Antigenpräsentierte Zellen (= APCs, z. B. Makrophagen und Dendritische Zellen), T-Lymphozyten  Modulierende Zellen: B-Lymphozyten, γδ-T-Lymphozyten  Effektorzellen: Mastzellen, Granulozyten, Thrombozyten, Makrophagen  Effektorzielzellen oder Strukturzellen: Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Myofibroblasten Die Interaktion zwischen APCs und einem allergenspezifischen T-Zellklon gilt als Auslöser für die Immunreaktion. Die Ausbreitung auf andere Zellen erfolgt daraufhin über Amplifikationsmechanismen. In der Frühphase des allergischen Asthmas steht v. a. die Kreuzvernetzung zwischen Antigenen mit spezifischen IgE-Antikörpern im Vordergrund. Im weiteren Verlauf und der Manifestierung der Erkrankung dominieren dagegen neutrophile und eosinophile Granulozyten, T-Lymphozyten, Makrophagen und Antikörper-produzierende B-Lymphozyten (Finotto et al., 2000; Kroegel, 2002; Lloyd and Hessel, 2010). 26 Einleitung 3.2.1 Polymorphkernige Granulozyten Polymorphkernige Granulozyten, kurz Granulozyten, besitzen einen gelappten Kern und viele zytoplasmatische Granula. Sie werden aus Stammzellen im Knochenmark gebildet. Ihre durchschnittliche Lebensdauer beträgt 8 - 14 Tage. Man unterscheidet neutrophile, basophile und eosinophile Granulozyten. Sie kommen gehäuft an Entzündungsherden vor, allerdings kaum im gesunden Gewebe. Nach Aufnahme in intrazelluläre Vesikel töten neutrophile Granulozyten Infektionserreger mittels Sauerstoffradikalen und anderen toxischen Substanzen ab. Besonders zu Beginn einer Entzündung nimmt ihre Zahl rasch zu. Eosinophile Granulozyten sind ebenfalls zur Phagozytose befähigt. Ihre Anzahl im Blut unterliegt einem deutlichen Tagesrhythmus, welcher der Steroid-Freisetzung genau entgegengesetzt ist. Sie liegen besonders bei Asthma bronchiale in gehäufter Anzahl vor. Basophile Granulozyten, auch Blutmastzellen genannt, enthalten Histamin, Serotonin und Heparin, sowie proteolytische Enzyme. Sie treten v. a. bei Überempfindlichkeitsreaktionen und Hyperlipoproteinämien auf (Mutschler et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Bei Asthma bronchiale sind hauptsächlich die eosinophilen und neutrophilen Granulozyten von Bedeutung. Die Eosinophilie stellt ein Hauptcharakteristikum bei allergischem Asthma bronchiale dar. Th2-Zytokine, z. B. Interleukin 4 (IL-4) und IL-5, welche bei diesem Krankheitsbild vermehrt vorliegen, sind maßgeblich für die erhöhte Anzahl an Eosinophilen im Blut und im Gewebe verantwortlich. IL-5 gilt als spezifischer Wachstumsfaktor für eosinophile Granulozyten und IL-4 sorgt dafür, dass sich die Zellen besser an das Endothel anheften können. Außerdem verlängert IL-5 während einer Entzündungsreaktion ihr Überleben (Sanderson, 1992; Wardlaw, 1999; Wardlaw et al., 2000). Eosinophile Granulozyten spielen besonders in der Spätphase der asthmatischen Reaktion eine entscheidende Rolle. Nach Eindringen in das entzündete Gewebe heften sie sich am bronchialen Epithel fest und setzen u. a. zytotoxische Proteine, Zytokine (z. B. IL-1, IL-5, IL-6, TNF-α) und Lipidmediatoren (z. B. LTC4) frei. Dies hat zur Folge, dass Epithelzellen zu 27 Einleitung Grunde gehen und der Entzündungsprozess verstärkt wird. Außerdem kommt es zum Anstieg der Schleimproduktion und der Gefäßdurchlässigkeit sowie zur Bronchokonstriktion (Filipovic and Cekic, 2001). Neutrophile Granulozyten gehören mit zu den ersten inflammatorischen Zellen, die nach Allergenexposition bzw. Verletzungen des Gewebes, v. a. aktiviert durch IL-8, IL-1β, TNF-α und Leukotrien B4, in die Lunge einwandern (Gernez et al., 2010). Neutrophile Granulozyten können vermehrt nach einem akuten Asthmaanfall bzw. im persistierenden Stadium nachgewiesen werden. Dies gilt besonders für Patienten, bei denen nur eine geringe Anzahl an eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden kann bzw. wenn eine Steroidresistenz vorliegt. Man geht davon aus, dass die Anzahl der Neutrophilen ein Marker für die Schwere der Erkrankung ist (Jatakanon et al., 1999; Green et al., 2002; Loukides et al., 2002; Monteseirín, 2009). Neutrophile Granulozyten produzieren u. a. das Zytokin IL-9, welches die Mukusproduktion und das Überleben von eosinophilen Granulozyten positiv beeinflusst. Außerdem sind sie eine wichtige Quelle von TGF-β und somit wohl auch an den Umbauprozessen des Lungengewebes während der Erkrankung beteiligt (Foley and Hamid, 2007). 3.2.2 Dendritische Zellen DCs (Dendritische Zellen) sind die effizientesten antigenpräsentierenden Zellen, die eine antigenspezifische, T-Zell-vermittelte adaptive Immunantwort hervorrufen können. Sie entstehen im Knochenmark aus hämatopoetischen oder myeloiden Vorläuferzellen und sind sowohl in Oberflächengeweben des Körpers (z. B. Haut, Pharynx, Vagina, Anus) als auch in großer Zahl in den inneren Schleimhäuten des respiratorischen und gastrointestinalen Systems zu finden (Niess et al., 2005; Randolph et al., 2005; Schütt and Bröker, 2009). Unterhalb der Epithelzellenschicht der Atemwege sind zahlreiche unreife DCs angesiedelt und bilden dort ein dichtes Netzwerk. Diese DCs sind durch Cytoplasma-Fortsätze gekennzeichnet, welche 28 Einleitung die über die Atemluft eindringenden Antigene mittels Mikropinozytose aufnehmen können. Daraufhin wird das Antigen durch die DCs zu Peptiden prozessiert. Es folgt die Reifung und Migration der DCs in die lokalen Lymphknoten. Daraufhin werden die phagozytierten Antigene in Form von MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) Klasse II/PeptidKomplexen in sehr hoher Dichte auf ihrer Zellmembran präsentiert. So kann das Antigen von entsprechenden T-Lymphozyten mittels TCRs (T cell receptors) erkannt und gebunden werden. Zusätzlich für die Erkennung und Aktivierung von T-Zellen werden costimulatorische Moleküle wie CD80 (B7.1) oder CD86 (B7.2) benötigt. Diese interagieren mit CD28, welches auf der Oberfläche von T-Lymphozyten konstitutiv exprimiert wird. Bei den geschilderten Abläufen handelt es sich um eine sogenannte Sensibilisierungsreaktion. Diese ist Voraussetzung für das Auftreten einer allergischen Reaktion bei erneutem Allergenkontakt (Guermonprez et al., 2002; Medoff et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009; Kim et al., 2010b; Andreev et al., 2012). 3.2.3 B-Lymphozyten B-Zellen reifen beim Menschen im Knochenmark heran. Über das Blut gelangen sie u. a. in die Milz und die Lymphknoten und siedeln sich dort bevorzugt in sogenannten Keimzentren der Lymphfollikel an. Als immunologisch kompetente Zellen weisen sie auf ihrer Oberfläche sogenannte BCRs (B cell receptors) auf. Dabei handelt es sich genau betrachtet um Immunglobuline, welche über ihren Fc-Teil (c = constant) in der Membran verankert sind und deren Antigen-bindende (Fab) -Fragmente in den Extrazellularraum weisen. Nach Aktivierung können sie sich in Plasmazellen differenzieren, welche große Mengen von Immunglobulinen synthetisieren und in löslicher Form sezernieren können. Zusätzlich kommt es auch zur Ausbildung von Gedächtniszellen, welche ebenfalls im Blut zirkulieren. Sie können bei erneuter Exposition ein Antigen noch Jahre später wiedererkennen (Mutschler et 29 Einleitung al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Antikörper, kollektiv als Immunglobuline bezeichnet, können ausschließlich von B-Lymphozyten gebildet werden und unterscheiden sich in ihren antigenspezifischen Bindestellen. Jede B-Zelle produziert nach Aktivierung durch ein Antigen eine einzige Antikörper-Spezies, welche eine einzigarte antigenspezifische Bindungsstelle aufweist. Die typische Y-förmige Struktur ergibt sich aus zwei identischen schweren Ketten (heavy chains) und zwei identischen leichten Ketten (light chains), welche über kovalente Disulfidbrücken verbunden sind. Je nach Art der schweren Kette unterscheidet man die Antikörper IgG, IgA, IgM, IgD und IgE. Während der frühen Entwicklungsphase bilden B-Zellen zuerst IgM. Nach Verlassen des Knochenmarks produzieren sie zusätzlich IgD, welches neben IgM auf der Zelloberfläche membranständig co-exprimiert wird (Alberts et al., 2002; Mutschler et al., 2008). IgE repräsentiert in Bezug auf allergische Reaktionen den wichtigsten Antikörper. So kommt es bei der Immunabwehr im allergischen Asthma durch spezifische Signale (z. B. IL-4) zum Klassenwechsel hin zu IgE. 3.2.4 Mastzellen Mastzellen, auch Mastozyten genannt, gehören zu den Leukozyten und wurden von Paul Ehrlich entdeckt (Ehrlich, 1878). Dabei handelt es sich um große Zellen der körpereigenen Abwehr, welche mit elektronendichten Granula gefüllt sind. Diese Granula enthalten z. B. Histamin, Bradykinin, Serotonin und Heparin. Sie entstehen aus hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, wandern jedoch noch als unreife Zellen ins Gewebe (v. a. Haut und Schleimhäute) ein und reifen dort aus. Neben IL-3 und SCF (stem cell factor) gehören IL-4 und IL-9 zu den Faktoren, die das Wachstum und die Entwicklung der Mastzellen regulieren (Arinobu et al., 2009). Der hochaffine Rezeptor für IgE, FcεRI, wird dauerhaft auf ihrer Oberfläche exprimiert. Die Aktivierung der sensibilisierten Mastzellen erfolgt, wie vorher bereits beschrieben, über die durch ein Antigen ausgelöste 30 Einleitung Kreuzvernetzung benachbarter FcεRI/IgE-Komplexe. Nach Aktivierung durch Allergene oder andere Infektionserreger können sie innerhalb kürzester Zeit die gespeicherten Inhaltsstoffe aus den Granula freisetzen. Sie gehören somit zu den Effektorzellen der allergischen Typ I Sofortreaktion. Außerdem können sie über die Freisetzung neugebildeter Zytokine und Chemokine, wie z. B. IL-3, IL-4, IL-5 und TNF-, weitere Zellen anlocken und so eine Entzündung auslösen. Das bedeutet, dass Mastzellen nicht nur an der akuten Reaktion sondern auch an der chronischen Entzündung beteiligt sein können (Brandenburg et al., 2000; Busse and Lemanske, 2001; Mutschler et al., 2008; Schütt and Bröker, 2009). Die Ausschüttung der jeweiligen Botenstoffe bewirkt eine Bronchokonstriktion, Vasodilatation, erhöhte Gefäßdurchlässigkeit und vermehrte Schleimproduktion (Galli and Tsai, 2012). Somit sind Mastzellen an der Entstehung von Allergien und Asthma bronchiale beteiligt. Zudem scheinen Mastzellen auch bei der antiviralen Immunantwort eine Rolle zu spielen. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die Aktvierung von Mastzellen durch synthetische virale dsRNA (doppelstränige RNA) zur Rekrutierung von CD8+ T-Zellen zum Ort der Entzündung führt (Orinska et al., 2005). Außerdem ergaben Untersuchungen, dass Mastzelldefiziente Mäuse, welche mit dem Dengue-Fieber infiziert wurden, aufgrund von fehlenden NK (Natürlichen Killer)- und NKT (Natürlichen Killer T) -Zellen eine erhöhte Viruslast aufwiesen (St John et al., 2011). Dem entgegen steht, dass Mastzellen während einer latenten HIV (Humanes Immundefizienz Virus) Infektion möglicherweise als Reservoir für den Virus dienen können (Sundstrom et al., 2007). 3.2.5 CD4+ T-Lymphozyten T-Lymphozyten, auch T-Zellen genannt, bilden eine Untergruppe der Leukozyten. Zusammen mit den B-Zellen (s. 3.2.3) stellen sie einen wichtigen Bestandteil der adaptiven Immunantwort dar. Die Vorläuferzellen entstammen dem Knochenmark, wandern jedoch im 31 Einleitung frühen Vorläuferstadium in den Thymus ein um dort auszureifen. Die T-Zellen lassen sich in zwei Hauptpopulationen unterteilen: T-Helferzellen (Th) und zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T lymphocytes, CTL). T-Helferzellen tragen zur Optimierung der Immunantwort bei, indem sie z. B. einerseits präsentierte Antigene erkennen und entscheiden, ob eine Immunantwort notwendig ist, aber auch indem sie B-Zellen zur Antikörperproduktion aktivieren oder Makrophagen unterstützen, aufgenommene Mikroorganismen abzutöten. Die zytotoxischen T-Zellen dagegen sind darauf spezialisiert, infizierte Zellen abzutöten. Nötig für die Erkennung von Antigenen ist ein membrangebundener T-Zell-Rezeptor. Dieser Rezeptor ist bei jedem T-Lymphozyten-Klon für ein anderes Antigen spezifisch. Der T-ZellRezeptor besteht bei den meisten T-Zellen im Blut aus einer - und einer -Kette. Bei den restlichen Zellen wird er aus einer - und einer -Kette gebildet. Die beiden T-ZellPopulationen lassen sich mit Hilfe von charakteristischen Differenzierungsmarker unterscheiden. So exprimieren T-Helferzellen CD4 (cluster of differentiation 4), wohingegen CTLs CD8 positiv sind. Die CD4+-Zellen können je nach Zytokinmillieu, Intensität der TCR/Antigen-Bindung und Beschaffenheit und Konzentration des Antigens zu unterschiedlichen Subtypen von Effektorzellen differenzieren, deren Bedeutung bei Asthma bronchiale im Folgenden beschrieben ist. Zu diesen Effektorzellen zählen Th1-, Th2-, Th17und Th9- Lymphozyten sowie Treg-Zellen (regulatorische T-Zellen) (s.Abb. 3-3) (Hansen, 2001; Murphy et al., 2007; Schütt and Bröker, 2009). 32 Einleitung Abb. 3-3 Überblick über die für die Entstehung und den Verlauf des allergischen Asthmas beteiligten T-ZellPopulationen sowie der für die Differenzierung wichtigen Zytokine und Transkriptionsfaktoren. (verändert nach (Silverman, 2007; Barnes, 2008)) 3.2.5.1 Th1-Zellen Th1-Zellen werden v. a. mit der zellvermittelten Immunantwort assoziiert. Bei der Abwehr von intrazellulären Mikroorganismen spielen sie eine wichtige Rolle. Der stärkste Induktor für die Differenzierung von Th1-Zellen ist IL-12. Dies wird von antigenpräsentierenden Zellen (Makrophagen, DCs) bevorzugt nach Kontakt mit Viren und intrazellulären Bakterien sezerniert. Funktionelle IL-12 Rezeptoren werden nur auf frisch aktivierten, jedoch noch nicht differenzierten CD4+ T-Zellen und auf Th1-Zellen exprimiert. Das Binden von IL-12 an seinen Rezeptor führt zur Phosphorylierung von STAT-4 (signal transducer and activator of transcription 4). Daraufhin kommt es zur Produktion von IFN- (Interferon gamma)Dieses Zytokin fördert ebenfalls die Entstehung von Th1-Zellen indem es zum einen die IL-12 33 Einleitung Produktion von Makrophagen steigert und zum anderem, indem es die Expression des IL-12 Rezeptors auf CD4+-Zellen verlängert, was zum Erhalt der Sensibilität der Zellen gegenüber IL-12 führt. Außerdem induziert IFN- die Phosphorylierung von STAT-1, was die Transkription von T-bet (T-box expressed in T cells) einleitet. Hierbei handelt es sich um den Haupttranskriptionsfaktor der Th1-Zellen, der wiederum die endogene Produktion von IFN- induzieren kann. Des Weiteren ist IL-18 an der Differenzierung dieses Zelltyps beteiligt, da es mit IL-12 kooperiert und so die IFN- Produktion durch T-, B- und NK-Zellen induziert (Okamura et al., 1998; Dinarello, 1999; Hansen, 2001; Afkarian et al., 2002; Robinson and Lloyd, 2002). Th1-Zytokine sind in der Lage, sowohl die Produktion von Th2- als auch Th17-Zytokinen zu hemmen. Somit gelten Th1-Zellen als wichtige Gegenspieler zu Th2-Zellen, welche bei Asthma bronchiale vermehrt vorliegen (s. 3.2.5.2). Studien konnten zeigen, dass in den Atemwegen von Asthmatikern die Expression von T-bet reduziert ist. Man schloss daraus, dass der Verlust dieses Faktors mit der Entstehung von Asthma bronchiale einhergeht. Im Mausmodell wurde dann deutlich, dass eine T-bet Defizienz zu spontanen Asthmasymptomen führt. Somit wird Th1-Zellen bei Asthma bronchiale ein protektiver Effekt zugeschrieben (Hansen, 2001; Finotto et al., 2002). 3.2.5.2 Th2-Zellen Th2-Lymphozyten sind Teil der humoralen Immunantwort und spielen v. a. bei der Abwehr extrazellulärer Pathogene eine wichtige Rolle. Bei der Differenzierung von Th2-Zellen nimmt IL-4 die wichtigste Rolle ein. Sobald eine gewisse Schwellenkonzentration an IL-4 erreicht ist, wird die Differenzierung zu Th2-Zellen eingeleitet. Neben IL-4 können auch die Zytokine IL-33 und IL-7 bzw. TSLP (thymic stromal lymphopoietin) an der Differenzierung beteiligt sein. Charakteristisch für diesen Zelltyp ist die Sezernierung der Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13. Außerdem produzieren Th2-Zellen auch noch IL-9, IL-10, IL-21 und IL-25. Der 34 Einleitung bedeutendste Transkriptionsfaktor dieser CD4+ T-Lymphozyten Subpopulation ist GATA-3 (GATA-binding protein 3). Dessen Aktivierung verläuft über den IL-4/STAT-6 Signalweg. So wurde bereits beobachtet, dass die Expression von GATA-3 während der Th2-Zell-Differenzierung erhöht ist. Außerdem konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass die Suppression von GATA-3, z. B. durch antisense DNA (deoxyribonucleic acid), die Produktion von Th2-Zytokinen unterdrückt. Neben STAT-6 und GATA-3 ist auch die Aktivierung von STAT-5 durch IL-2 entscheidend für die Entstehung von Th2-Lymphozyten. Charakterisiert wird dieser Zelltyp zusätzlich noch durch die Chemokinrezeptoren CCR4 und CCR8 (Finotto et al., 2001; Hansen, 2001; Finotto and Glimcher, 2004; Schütt and Bröker, 2009; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010). Es ist unumstritten, dass Th2-Zellen bei der Entstehung und dem Verlauf des allergischen Asthmas eine zentrale Rolle spielen. Aus Studien ging hervor, dass die Anzahl an Th2-Lymphozyten in der BAL (bronchoalveolären Lavage) sowie in Lungenbiopsien von Asthmapatienten erhöht ist. Zusätzlich korreliert die Anzahl an Th2-Zellen positiv mit dem Schweregrad der Erkrankung. Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass Th2-Zellen für typische Asthmasymptome wie z. B. bronchiale Hyperreagibilität, eosinophile Entzündungsprozesse, Umbauprozesse der Atemwege oder vermehrte Mukusproduktion verantwortlich sind. Diese Symptome werden durch die charakteristischen Th2-Zytokine vermittelt. So sind IL-4 und IL-13 an der Aktivierung von B-Zellen beteiligt und spielen eine wichtige Rolle beim Immunglobulin Klassenwechsel von IgE und IgG4. Zusammen mit IL-9 fördert IL-4 das Wachstum von Mastzellen und indirekt ist IL-4 auch an der Migration von eosinophilen Granulozyten in das Gewebe beteiligt. Außerdem ist IL-4 imstande, die Entstehung von Th1-Zellen zu unterdrücken. IL-13 ist verantwortlich für die Entstehung der bronchialen Hyperreagiblität, vermehrte Mukusproduktion und für die Umbauprozesse in den Atemwegen, somit also für die Schlüsselsymptome der allergischen Reaktion. Für die Eosinophilie ist IL-5 mit verantwortlich, da es die Produktion, Reifung und Aktivierung von eosinophilen 35 Einleitung Granulozyten fördert und außerdem deren Überlebenszeit verlängert. Im Mausmodell konnte bereits gezeigt werden, dass die Hemmung der Th2-Zellen und deren charakteristischen Zytokine die Symptome des Asthma bronchiale unterdrücken können. Erste klinische Studien zeigten allerdings, dass IL-5 spezifische Antikörpern (Mepolizumab, Reslizumab) nur in der Lage sind, die Anzahl an eosinophilen Granulozyten im Blut und im Sputum zu senken, jedoch die Lungenfunktion nicht verbessern. Lebrikizumab, ein IL-13 spezifischer Antikörper, konnte nachweislich eine Verbesserung der Lungenfunktion bewirken. Allerdings wurde in Studien auch gezeigt, dass dies hauptsächlich für eine Untergruppe von Patienten gilt, welche hohe Konzentrationen des Proteins Periostin aufweisen (Corren et al., 2011). Daraus lässt sich schließen, dass Th2-Lymphozyten zwar eine wichtige Rolle beim Krankheitsbild Asthma bronchiale spielen, dass aber auch andere Zelltypen wie z. B. Th1-, Th17- und Treg Zellen von Bedeutung sind und es sich somit um ein komplexes Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen handelt. Diese Annahme wird auch dadurch bestätigt, dass nicht alle Asthmatiker einen Th2-Zell-spezifischen Phänotyp aufweisen (Hansen, 2001; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010; Lloyd and Saglani, 2013). 3.2.5.3 Th9-Zellen Eine erst vor Kurzem beschriebene Untergruppe der T-Helferzellen sind die Th9-Zellen. Namensgebend für diesen Zelltyp ist die vorwiegende Produktion von IL-9. Es ist bereits bekannt, dass Th9-Zellen durch IL-9 vermittelte Effekte an der Proliferation von Mastzellen und Becherzellen sowie an der vermehrten Mukusproduktion in den Atemwegen beteiligt sind. 2008 konnte gezeigt werden, dass IL-4 und TGF- (Transforming growth factor beta)für die Differenzierung von Th9-Zellen nötig sind. Hierbei ist TGF-v. a. für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors PU.1 und die Hemmung von T-bet und GATA-3 verantwortlich. IL-4 induziert die Transkriptionsfaktoren STAT-6 und IRF4 (interferon 36 Einleitung regulatory factor 4). Begünstigt wird die Entstehung von Th9-Lymphozyten durch IL-1, IL-25 und IL-33, wohingegen IFN-, IL-23, IL-12 und IL-18 die Differenzierung hemmen. Außerdem wurde vor kurzem beschrieben, dass das kostimulatorische Molekül OX40 (CD134) – ein Mitglied der TNFR (tumor necrosis factor receptor) Superfamilie – ebenfalls die Differenzierung des Zelltyps begünstigt. Man geht davon aus, dass mehrere zentrale Transkriptionsfaktoren die Entstehung von Th9-Zellen regulieren, da sowohl die Defizienz von PU.1, IRF-4 und STAT-6 die Entstehung von Th9-Zellen unterbindet (Ma et al., 2010; Zhao et al., 2013). Außerdem scheint auch der Transkriptionsfaktor BATF (basic leucine zipper transcription factor, ATF like) bei diesem Zelltyp eine wichtige Rolle zu spielen (Jabeen et al., 2013). Obwohl Th9-Zellen auch unter optimalen Polarisierungskonditionen nur in geringer Anzahl entstehen und dieser Zelltyp eng mit Th2 T-Lymphozyten verbunden ist, kann man aufgrund der unterschiedlichen transkriptionellen Regulierung davon ausgehen, dass Th9 T-Lymphozyten als eigenständige Untergruppe anzusehen sind (Zhao et al., 2013). 3.2.5.4 Th17-Zellen Die Entdeckung der Th17-Zellen füllte einige Lücken im allgemeinen Verständnis, wie Entzündungsprozesse ablaufen. Erst 2005 wurden sie als eigenständiger Subtyp innerhalb der CD4+ T-Lymphozyten erkannt und wurden nach dem Zytokin IL-17A benannt, welches sie bevorzugt produzieren (Langrish et al., 2005; Aujla and Alcorn, 2011). Die Hauptaufgabe dieser Zellen ist die Abwehr bestimmter Pathogene, bei denen es einer massiven Entzündungsreaktion bedarf und bei denen eine Th1- bzw. Th2-Zell-vermittelte Immunantwort nicht ausreicht. Außerdem fand man heraus, dass Th17-Lymphozyten eine wichtige Rolle bei der Autoimmunität spielen (Korn et al., 2009; Aujla and Alcorn, 2011). Th17-Zellen wirken bevorzugt auf Zellen außerhalb des Immunsystems ein und fördern Entzündungsprozesse im Gewebe, indem sie Fibroblasten, Endothelzellen oder 37 Einleitung Epithelzellen zur Synthese proinflammatorischer Zytokine und Chemokine anregen. Außerdem unterstützen sie die Rekrutierung und Aktivierung von Neutrophilen. Ihre wichtigste Funktion ist allerdings, wie vorher bereits erwähnt, die Abwehr von extrazellulären Pathogenen. Dies zeigt sich z. B. in Patienten, bei denen Defekte im Th17-Signalweg nachgewiesen werden konnten. Diese Patientengruppe ist anfälliger für Infektionen durch Pilze und extrazelluläre Bakterien (Puel et al., 2011). An der Differenzierung dieser T-Lymphozyten sind TGF-, IL-6, IL-21, IL-1 und IL-23 beteiligt. Zuerst beschrieben wurden die Effekte von TGF- und IL-6. Obwohl diese beiden Zytokine gegenteilige Effekte bewirken, sind sie für die Entstehung von Th17-Zellen verantwortlich. Hierbei hemmt IL-6 die Expression des Transkriptionsfaktors Foxp3 (Forkhead-Box-Protein P3) und somit die Generierung regulatorischer T-Zellen. Außerdem aktiviert IL-6 STAT-3, was zur Expression des Transkriptionsfaktors RORt (Retinoic acid-related orphan recptor gamma t) führt. TGF- ist normalerweise für die Differenzierung von Treg-Zellen verantwortlich. In Kombination mit IL-6 bewirkt es jedoch die Entstehung der Th17-Lymphozyten. Es wird vermutet, dass geringe Konzentrationen von TGF-β die Differenzierung von Th17-Zellen begünstigt, wobei hohe Konzentrationen des Zytokins eher für die Entstehung regulatorischer T-Lymphozyten verantwortlich sind (Bettelli et al., 2006; Aujla and Alcorn, 2011). Neben TGF-und IL-6 ist auch die Kombination aus TGF- und IL-21 als Induktor für die Th17-Differenzierung beschrieben. IL-23 ist erst in der späteren Phase der Differenzierung wichtig, da naive Zellen den IL-23 Rezeptor noch nicht exprimieren. IL-23 hält die Differenzierung aufrecht und verlängert die IL-17 Produktion (Korn et al., 2009; Aujla and Alcorn, 2011). Der wichtigste Transkriptionsfaktor dieses Zelltyps ist RORt, welcher durch STAT-3 in Abhängigkeit von IL-6, IL-21 oder IL-23 aktiviert wird und direkt an den IL-17 Genpromoter bindet. ROR scheint ebenfalls an der Differenzierung beteiligt zu sein, jedoch im geringeren 38 Einleitung Maße als RORt (Yang et al., 2008b; Aujla and Alcorn, 2011). Neben RORt sind auch BATF und IRF4 entscheidend für die Entstehung dieses Zelltyps. BATF und RORt induzieren beide die Expression von IL-17A. IRF4, aktiviert durch IL-1, ist an der Aktivierung von RORt beteiligt (Chung et al., 2009; Schraml et al., 2009). Die Differenzierung kann durch Foxp3, T-bet und ETS1 (v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1) unterdrückt werden (Fujiwara et al., 2007; Moisan et al., 2007; Zhou et al., 2008). Auch Zytokine wie IL-4, IFN- oder IL-2, die von Th1-, Th2- oder Treg-Zellen freigesetzt werden, können die Entstehung von Th17-Zellen unterdrücken (Aujla and Alcorn, 2011). Neben IL-17A produzieren Th17-Zellen auch IL-6, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), TNF (tumor necrosis factor alpha) und CCL20 (Harrington et al., 2005; Dong, 2008; Korn et al., 2009). Die Th17-Zytokine kooperieren häufig miteinander, um eine Entzündung im Gewebe hervorzurufen. Die genaue Rolle der Th17-Zellen im allergischen Asthma ist noch nicht vollständig geklärt. Sowohl im murinen Asthmamodell als auch im Plasma von Asthmapatienten konnten vermehrt Th17-Zytokine nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass IL-17A und IL-17F eine Steroidresistenz vermitteln, indem sie den Glukokortikoidrezeptor- aktivieren, welcher die Effekte von Glukokortikoiden mindert (Aujla and Alcorn, 2011; Vazquez-Tello et al., 2013). . 3.2.5.5 Regulatorische T-Lymphozyten Die Hauptaufgabe unseres Immunsystems ist es, uns vor Pathogenen und Mikroorganismen zu schützen, indem infizierte Zellen beseitigt werden und gleichzeitig die Beschädigung des Gewebes auf ein Minimum reduziert wird. In diesem Zusammenhang spielen regulatorische T-Lymphozyten, kurz Treg-Zellen, eine entscheidende Rolle. Zu ihren Funktionen gehören 39 Einleitung u. a. die Prävention von Autoimmunerkrankungen aber auch die Suppression von Allergien und Asthma. Am entscheidendsten ist jedoch ihre Fähigkeit, Toleranz zu induzieren (Gershon and Kondo, 1971; Gershon et al., 1972; Corthay, 2009; Andreev et al., 2012). Sakaguchi et al. fanden heraus, dass die  Kette des IL-2 Rezeptors (CD25) ein Marker für Treg-Zellen ist (Sakaguchi et al., 1995). Bis heute sind allerdings immer noch keine Moleküle bekannt, welche ausschließlich auf der Oberfläche von regulatorischen T-Zellen exprimiert werden. Zu den typischen Markern von Treg-Zellen, die allerdings auch bei anderen aktivierten T-Zellen oder APCs vorzufinden sind, zählen CD4, CTLA-4 (CD 152, cytotocix T lymphocyteassociated antigen 4), GITR (glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor receptor-related protein), OX40 (CD134), L-Selektin (CD62 Ligand, CD62L), CD127, Helios und LAG3 (lymphocyte activation gene 3). Als relativ exklusiver intrazellulärer Marker gilt der Transkriptionsfaktor Foxp3 (Cools et al., 2007; Corthay, 2009) . Dieser Transkriptionsfaktor ist wichtig für die Entstehung und Funktionalität der CD4+CD25+ Treg-Zellen. So konnte nachgewiesen werden, dass eine Foxp3 Defizienz sowohl im Menschen als auch in der Maus zum Verlust von Treg-Zellen führt, was die Entstehung von Autoimmunerkrankungen fördert (Wildin et al., 2002; Wildin and Freitas, 2005). Je nach Oberflächenmarker und produzierten Mediatoren können zwei Treg-Populationen unterschieden werden. Zum einen findet man CD4+CD25+Foxp3+ Zellen, welche auch als nTreg (natürliche Treg) bezeichnet werden. Diese entstehen im Thymus und machen 5 - 10 % aller peripheren CD4+ T-Zellen aus. Die zweite Population wird als iTreg (induzierbare Treg) bezeichnet. Zu dieser Gruppe gehören die Foxp3+ iTreg (CD4+CD25hiFoxp3+), die IL-10-produzierenden Tr1-Zellen (regulatorische T-Zellen vom Typ 1, CD4+CD25hiFoxp3-IL-10+) und die TGF- produzierenden Th3-Zellen (CD4+Foxp3-TGF+) (Weiner, 2001; Roncarolo et al., 2006; Cools et al., 2007). nTreg und iTreg benötigen eine TCR Stimulation, um ihre suppressorische Eigenschaften entfalten zu können. 40 Einleitung Wie genau die Treg-Zellen auf andere Zellen einwirken ist noch nicht vollständig geklärt. Man geht davon aus, dass ein direkter Zell-Zell Kontakt über GITR und CTLA-4 (Oberfläche Treg-Zellen) und CD80/CD86 (Oberfläche Effektor T-Zellen) benötigt wird. Außerdem können regulatorische T-Zellen andere Zelltypen durch die Freisetzung immunsuppressorischer Zytokine wie z. B. IL-10 und TGF- hemmen (Cools et al., 2007). Im Bezug auf Asthma bronchiale konnte gezeigt werden, dass der Transfer von antigenspezifischen Treg-Zellen in mit Allergen sensibilisierten Mäusen zu einer Hemmung der Th2-Zytokinproduktion und zur Unterdrückung der AHR führt. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass sich in der Lunge von asthmatischen Kindern weniger Treg-Zellen befinden als in der von Kontrollkindern (Medoff et al., 2008). Da die Balance zwischen Tregund T-Effektorzellen für den Ausgang der Immunreaktion wichtig ist, zielen verschiedene Therapieansätze auf die Erhöhung von Treg-Zellen und die Wiederherstellung ihrer Funktion ab (Ryanna et al., 2009). 3.2.5.6 Tfh-Zellen Für das Zustandekommen einer T-Zell-abhängigen Immunantwort sind Tfh-Zellen (follikuläre T-Helferzellen) essentiell. Dabei handelt es sich um eine neu beschriebene Unterart der CD4+ T-Zellen. Sie sind besonders durch die Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 (CXCMotiv-Chemokinrezeptor 5) gekennzeichnet. Zu den weiteren Oberflächenmarkern follikulärer T-Helferzellen gehören u. a. IL-21R, IL-6R, ICOS (inducible T cell co-stimulator) und OX40 (CD134) (Vinuesa et al., 2005; Nurieva et al., 2008; Kim et al., 2010a). Tfh-Zellen tragen zur Affinitätsreifung in B-Zellen bei, unterstützen den Immunglobulin-Klassenwechsel und sind bei der Entstehung von Plasma- und B-Gedächtniszellen in den Keimzentren beteiligt. So tragen sich auch zur Entstehung und Regulation der B-Zell vermittelten Toleranz bei. Dies bedeutet, dass B-Zellen auf ein bestimmtes Antigen (z. B. Autoantigene) keine 41 Einleitung Immunantwort auslösen. Der Verlust von Tfh-Zellen führt zu einer stark beeinträchtigten humoralen Immunantwort, welche durch eine verminderte Keimzentrumsbildung und damit einer verringerten Anzahl an Plasmazellen und B-Gedächtniszellen gekennzeichnet ist (Breitfeld et al., 2000; Schaerli et al., 2000; Crotty, 2011; Liu et al., 2013). Bcl6 (B cell lymphoma 6) gilt als Haupttranskriptionsfaktor der Tfh-Zellen. Mäuse, welche diesen Transkriptionsfaktor nicht exprimieren, können keine Tfh-Zellen bilden, wohingegen die Differenzierung anderer T-Helferzellen unbeeinträchtigt bleibt (Yu et al., 2009). Bcl6 gilt als transkriptionelles Repressorprotein und inhibiert so die Differenzierung in andere T-Helferzellgruppen (Nurieva et al., 2009; Crotty, 2011). Vergleichbar zu anderen CD4+ T-Zell Subtypen sind auch bei Tfh-Zellen mehrere Transkriptionsfaktoren an der Kontrolle der verschiedenen Funktionen von beteiligt. So spielen neben Bcl6 auch c-maf, STAT3, IRF4 und BATF eine wichtige Rolle (Crotty, 2011). Es hat sich auch gezeigt, dass IL-21 in großen Mengen von Tfh-Zellen produziert wird und nach bisherigem Kenntnisstand am effektivsten die Differenzierung von Plasmazellen fördert (Nurieva et al., 2008; Suto et al., 2008; Crotty, 2011). Außerdem sezernieren sie IL-10 und IL-6, wobei IL-6 auch für ihre Differenzierung benötigt wird (Liu et al., 2013). Tfh-Zellen scheinen auch bei Asthma bronchiale eine wichtige Rolle zu spielen. Untersuchungen ergaben, dass die Anzahl an zirkulierenden Tfh-Zellen bei Patienten mit schwerem Asthma im Vergleich zu Kontrollpatienten erhöht war. Außerdem konnte in diesen Patienten auch eine gesteigerte Bcl6 mRNA Expression und IL-21 Plasmakonzentration nachgewiesen werden (Gong et al., 2014). 3.2.6 CD8+ T-Lymphozyten CD8+ T-Lymphozyten werden durch die Interaktion zwischen dem antigenpräsentierenden MHC-I Molekül und dem TCR aktiviert und werden in Anwesenheit von IL-2 zu CTLs 42 Einleitung (cytotoxic T lymphocyte, Tc, zytotoxische T-Lymphozyten). Auf MHC-I Molekülen werden hauptsächlich Peptid-Epitope von Proteinen präsentiert, welche im Zytoplasma der APCs synthetisiert werden. Dabei handelt es sich meist um virale oder zelleigene Proteine. Somit sind CD8+ T-Lymphozyten besonders dazu befähigt, virusinfizierte aber auch tumorale Zellen zu erkennen und zu bekämpfen. Zu Beginn einer Infektion können CTLs ihre Anzahl schnell expandieren, da zum einen die Aktivierung über das MHC-I Molekül relativ schnell von statten geht und zum anderen, da sie relativ lange im Kreislauf überleben. In ihrer Funktion sind CTLs sehr effektiv, da sie – unter Berücksichtigung harmloser, nicht infizierter Zellen mehr als eine Zielzelle zerstören können. Ihre Zytotoxizität wird entweder über die membranständigen Moleküle Fas-Ligand (CD95-L)/Fas-Rezeptor (CD95R) oder über Perforin/Granzym vermittelt (Schütt and Bröker, 2009; Broere et al., 2011). Die CD8+ T-Lymphozyten lassen sich, ähnlich wie die CD4+ T-Zellen, in verschieden Subtypen unterteilen. So findet man Tc1, Tc2, Tc17 und Foxp3 exprimierende CD8+ T-regulatorische Zellen (Croft et al., 1994; Sad et al., 1995; Carter and Murphy, 1999; Sullivan et al., 2003; Meloni et al., 2006; Hamada et al., 2009; Yen et al., 2009). Die Rolle von CD8+ Zellen bei Asthma bronchiale ist noch nicht vollständig geklärt. So konnten in Lungenbiopsien von Patienten mit allergischem Asthma kleine Populationen CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden, die IL-4 und IL-5 produzieren. Zusätzlich fand man heraus, dass CD8+ T-Lymphozyten aus dem Sputum von Asthmapatienten mehr IL-4, IL-5 und IFN-produzieren als dies bei gesunden Menschen der Fall ist (Ying et al., 1997; Cho et al., 2005). Man geht davon aus, dass CD8+ T-Lymphozyten die Asthmasymptome verschlimmern, indem sie die Effekte der CD4+ T-Zellen verstärken (Miyahara et al., 2004) Andererseits konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass die unspezifische Aktivierung von CD8+ Gedächtniszellen die allergische Sensibilisierung hemmt, was mit einer reduzierten AHR und Th2-vermittelten Entzündung einhergeht (Leggat et al., 2008). Wie zu Beginn bereits erwähnt, sind CD8+ T-Zellen bei der Abwehr virusinfizierter Zellen besonders 43 Einleitung effektiv. Dies lässt sich v. a. auf die Sekretion von IFN- zurückführen. Befindet sich jedoch eine große Anzahl an Th2 T-Lymphozyten in der Lunge, so wird die IFN- Produktion der CD8+ T-Zellen zugunsten der IL-5 Produktion reduziert. Dies hat zur Folge, dass vermehrt eosinophile Granulozyten die Lunge infiltrieren. Dies könnte eine mögliche Erklärung sein, warum Virusinfektionen zu einer Verschlimmerung der Asthmasymptome führen. Zusätzlich bewirkt eine verminderte Freisetzung von IFN- eine verlängerte Dauer der Virusinfektion (Coyle et al., 1995; Corne et al., 2002). 3.2.7 Natürliche Killer Zellen und Natürliche Killer T-Zellen NK (Natürliche Killer) -Zellen gehören zu den Lymphozyten und entstehen im Knochenmark aus hämatopoietischen Stammzellen und sind etwas größer als B- und T-Lymphozyten. Sie erkennen und lysieren virusinfizierte Zellen und Tumorzellen sowie Zellen, welche durch IgG markiert wurden. Im Gegensatz zu T- und B-Zellen können sie gestresste Zellen auch ohne das Vorhandensein von Antikörpern und MCH-Molekülen erkennen, was eine sehr rasche Immunreaktion zur Folge hat (Schütt and Bröker, 2009; Vivier et al., 2011). In Bezug auf allergisches Asthma bronchiale konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen bei der Entstehung der T-Zell vermittelten allergischen Entzündung der Atemwege beteiligt sind. So können NK-Zellen beispielsweise durch IgE über den FcγRIII aktiviert werden, was die Produktion von Zytokinen und Chemokinen zur Folge hat. Dies lässt darauf schließen, dass NK-Zellen an der IgE vermittelten allergischen Immunreaktion beteiligt sind (Arase et al., 2003). Außerdem konnte gezeigt werden, dass während einer akuten Exazerbation des Asthmas bei Kindern eine erhöhte Anzahl an NK-Zellen im peripheren Blut vorliegt (Lin et al., 2003). Im Gegensatz dazu ergaben andere Untersuchungen, dass NK-Zellen an der Bekämpfung der allergischen Entzündung beteiligt sind. So steigt beispielsweise die Anzahl an aktivierten NK-Zellen in der Lunge an, während eosinophile Granulozyten und T-Zellen nach einer 44 Einleitung Entzündungsreaktion entfernt werden. Somit kommt es in Abwesenheit von NK-Zellen zu einer verzögerten Beseitigung von Eosinophilen und CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe (Haworth et al., 2011). NKT (Natürliche Killer T) -Zellen weisen sowohl Eigenschaften von NK-Zellen als auch von T-Zellen auf. (Bendelac et al., 2007; Umetsu and Dekruyff, 2010). Nach ihrer Aktivierung können NKT-Zellen u. a. IFN-γ und IL-4 produzieren und freisetzen, was eine Induktion von B- und T-Zellen sowie von DCs, NK-Zellen und Makrophagen zur Folge hat und somit die adaptive Immunantwort fördert (Umetsu and Dekruyff, 2010). Bezüglich Asthma bronchiale konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass in Abwesenheit von NKT-Zellen eine allergiebedingte AHR ausbleibt (Akbari et al., 2003). Dies galt auch für viral-bedingtes Asthma (Kim et al., 2008). Humane Studien zeigten, dass eine erhöhte Anzahl an NKT-Zellen in den Lungen von Asthmatikern vorliegt. Dies scheint allerdings abhängig von der Schwere und dem Kontrollstatus der Erkrankung zu sein. So wiesen v. a. Patienten mit schwerem Asthma, deren Gesundheitszustand nur mäßig überwacht wurde, vermehrt pulmonale NKT-Zellen auf (Matangkasombut et al., 2009; Umetsu and Dekruyff, 2010). Diese Studien weisen auf eine essentielle Rolle der NKT-Zellen im Krankheitsbild des Asthma bronchiale hin, die jedoch noch weiterer Untersuchungen bedarf. 3.3 Das Zytokin IL-17A IL-17A, häufig nur IL-17 genannt, ist ein aus 155 Aminosäuren bestehendes, 35 kd (Kilodalton) schweres Polypeptid, welches als erstes Mitglied der IL-17 Familie gilt (Yao et al., 1995a; Strzępa and Szczepanik, 2011). 1993 wurde dieses Zytokin zum ersten Mal geklont und als CTLA8 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 8) identifiziert (Rouvier et al., 1993). Außerdem wurde nachgewiesen, dass IL-17A eine 58 % Sequenzhomolgie mit 45 Einleitung dem offenen Leseraster des Herpesvirus Saimiri aufweist (Yao et al., 1995a). Im menschlichen Genom befindet sich das Gen für IL-17A auf dem Chromosom 6p12 (Alcorn et al., 2010). Die Aminosäuresequenzen des menschlichen und des murinen IL-17A stimmen zu 63 % überein (Alcorn et al., 2010). Die IL-17-Familie umfasst noch fünf weitere Mitglieder: IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (= IL-25) und IL-17F (Aggarwal and Gurney, 2002; Kawaguchi et al., 2004). IL-17E wird allerdings nicht von Th17-Zellen gebildet, sondern gehört zu den Th2-Zytokinen (Fort et al., 2001). CD4+ T-Gedächtniszellen wurden zuerst als IL-17A Produzenten beschrieben. Seit dieser Entdeckung hat man festgelegt, dass CD4+ T-Zellen, welche IL-17A bilden, als Th17-Zellen bezeichnet werden und einen eigenständigen Zelltyp darstellen (Yao et al., 1995b; Harrington et al., 2005; Park et al., 2005). Die Th17-Zell-bedingte IL-17A Produktion wird durch verschiedenste Zytokine und Transkriptionsfaktoren induziert (s. 3.2.5.4). Dem entgegen stehen Zytokine wie IL-2, IL-27, IFN-γ oder IL-4, welche Th17-Zellen und somit auch die Expression ihrer Zytokinen unterdrücken. Auch Foxp3 bzw. STAT-5 wirken sich negativ auf die Produktion von IL-17A aus. Dieses Interleukin ist allerdings nicht nur das namensgebende Zytokin der Th17-Zellen, sondern wird auch von einer Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. γδ-T-Zellen, Tc17 Zellen, NK-Zellen, NKT-Zellen, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten und Mastzellen gebildet (Molet et al., 2001; Korn et al., 2009; Alcorn et al., 2010; Suurmond et al., 2011; Zhu and Qian, 2012). IL-17A besitzt u. a. entzündungsfördernde Eigenschaften (Kolls and Lindén, 2004) und bewirkt bei einer Vielzahl unterschiedlichster Zelltypen die Expression von Zytokinen (z. B. TNF, IL-1β, IL-6, GM-CSF, G-CSF), Chemokinen (z. B. CXCL1, CXCL8, CXCL10) und Metalloproteinasen (Jovanovic et al., 1998; Laan et al., 1999; Park et al., 2005; Korn et al., 2009). Außerdem gehört IL-17A zu den Schlüssel-Enzymen bei der Rekrutierung, Aktivierung und Migration von neutrophilen Granulozyten (Aggarwal and Gurney, 2002; Moseley et al., 2003). Dies bedeutet, dass IL-17A an der Wirtsabwehr (host defence) beteiligt 46 Einleitung ist, da neutrophile Granulozyten gegen Pilze und einige Bakterien vorgehen (Strzępa and Szczepanik, 2011). 3.3.1 IL-17 Rezeptoren und Signaltransduktion Die IL-17 Rezeptoren IL-17RA – IL-17RE stellen eine eigenständige Familie dar. Dabei binden IL-17A und IL-17F, welche sich sehr ähnlich sind, an die Rezeptoren IL-17RA und IL-17RC (Yao et al., 1995a; Toy et al., 2006; Kuestner et al., 2007). IL-17B und mit geringerer Affinität IL-17E leiten ihr Signal über IL-17RB weiter (Korn et al., 2009). Die Liganden für die beiden verbleibenden Rezeptoren, IL-17RD und IL-17RE, sind derzeit noch nicht bekannt (Korn et al., 2009). Die Mitglieder der IL-17R Familie gehören zu den Typ I Transmembranproteinen. Sie besitzen einen konservierten strukturellen Aufbau, welcher eine extrazelluläre Fibronektin-III ähnliche und eine zytoplasmatische SEFIR (SEF/IL-17R) Domäne umfasst. IL-17A bindet mit hoher Affinität an den IL-17RA (Moseley et al., 2003). Dieser Rezeptor ist in großer Zahl auf hematopoetischen Zellen und in geringerer Anzahl auf Osteoblasten, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen zu finden. Im Menschen können IL-17RA und IL-17RC ein Heterodimer bilden, an welches sowohl IL-17A und IL-17F binden können (Toy et al., 2006), wobei IL-17A mit höherer Affinität an den IL-17RA bindet als IL-17F. IL-17RC weist im Menschen für beide Zytokine eine vergleichbare Affinität auf. In der Maus dagegen scheint der IL-17RC bevorzugt Bindungen mit IL-17F einzugehen (Zhu and Qian, 2012). Anders als die übrigen IL-17 Rezeptoren besitzt der IL-17RA noch zwei zusätzliche Domänen: eine TILL (TIR/Toll/IL-1R) Domäne, welche direkt an die SEFIR Domäne anschließt und eine distale Domäne im C-Terminus (CBAD = C/EPF activation domain). Durch IL-17A initiiert, bilden IL-17RA und IL-17RC einen heterodimeren Komplex, um so über Interaktionen mit der SEFIR Domäne Act1 (actin related gene 1) zu rekrutieren. Daraufhin kommt es zur Verknüpfung von Act1 und TRAF6 (TNFR-associated 47 Einleitung factor 6), um so TRAF6 dem IL-17 Rezeptorkomplex zuzuführen. Über den Act1-TRAF6Komplex werden sowohl der NF-κB (nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells), als auch MAPK-AP1 und der C/EP1 (CCAAT/enhancer binding protein ) Signalwege initiiert und aktiviert. Diese Signalkaskade kann durch TRAF3 inhibiert werden (Gaffen, 2009; Zhu and Qian, 2012) (s. Abb. 3-4). Abb. 3-4 IL-17 Rezeptorsignalweg: CBAD = C/EBP activation domain, FN = Fibronektin Typ III ähnliche Domäne, SEFIR = SEF/IL-17R, TILL = TIR-like loop (verändert nach (Gaffen, 2009; Zhu and Qian, 2012)) 3.3.2 IL-17A und Asthma bonchiale In Asthmapatienten konnte vermehrt IL-17A u. a. im Sputum, in der BAL oder in PBMCs nachgewiesen werden (Bullens et al., 2006; Alcorn et al., 2010). Außerdem konnte zum einen gezeigt werden, dass erhöhte Mengen an IL-17A positiv mit der Schwere der Erkrankung korrelieren und zum anderen mit einer verstärkten Neutrophil-vermittelten Entzündungsreaktion und steroidresistentem Asthma einhergehen (Chakir et al., 2003; 48 Einleitung Bullens et al., 2006; Al-Ramli et al., 2009). Zudem stellte man eine Verbindung zwischen IL-17A und einer erhöhten AHR nach Methacholinprovokation her (Barczyk et al., 2003). Man weiß noch nicht sicher, welche Zellen beim Asthma bronchiale für die Produktion von IL-17A verantwortlich sind, aber man konnte im Lungengewebe von Asthmatikern eine erhebliche Anzahl an IL-17 produzierenden CD4+ T-Zellen, möglicherweise Th17 T-Zellen, nachweisen. Allerdings scheint dies auf Allergen-induziertes Asthma beschränkt zu sein (Alcorn et al., 2010). Somit geht man davon aus, dass IL-17A in der Pathogenese des Asthma bronchiale, insbesondere bei schwerem, neutrophilen Asthma, eine wichtige Rolle spielt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass IL-17A auch bei der Expression der Muzin-Gene MUC5AC und MUC5B eine Rolle spielt, was für eine Beteiligung an der Mukushypersekretion spricht. Es ist ebenfalls möglich, dass dieses Interleukin bei den Umbauprozessen der Lunge involviert ist, da es die profibrotischen Moleküle IL-6 und IL-11 induziert. Darauf deutet auch die Aktivierung der MMP-9 (Metalloproteinase 9) hin, welche in der Lage ist, Bestandteile der extrazellulären Matrix abzubauen (Molet et al., 2001; Chen et al., 2003; Alcorn et al., 2010; Tan and Rosenthal, 2013). Studien ergaben, dass die Neutralisation des Zytokins IL-17A mittels monoklonarer Antikörper eine reduzierte Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der BALF zu Folge hat (Strzępa and Szczepanik, 2011). Die Ergebnisse, die murine Asthmamodelle lieferten, sind zum Teil sehr widersprüchlich. Dies scheint sowohl auf die verwendeten Mausstämme, als auch auf die zu Grunde liegenden Sensibilisierungsprotokolle zurückzuführen zu sein. Es ergab sich, dass IL-17A sowohl die Kontraktion und Proliferation der glatten Muskulatur der Atemwege, als auch die Permeabilität der Epithelzellen für Allergene verstärkt. Außerdem sind Mäuse in Abwesenheit von Th17-Zellen vor AHR und Umbauprozessen geschützt (Tan and Rosenthal, 2013). IL-17A wird aber nicht nur von Th17-Zellen, sonder u. a. auch von γδ-T-Zellen gebildet. Untersuchungen am murinen Modell ergaben, dass IL-17A produzierende γδ-T-Zellen gegen 49 Einleitung die allergenbedingte Entzündungsreaktion und AHR vorgehen. Weitere Experimente zeigten aber auch, dass IL-17A, welches von γδ-T-Zellen freigesetzt wurde, antigenpräsentierende Zellen zur Produktion von IL-23, IL-1β, IL-6 und TGF-β anregt, welche dann wiederum die Differenzierung von pathogenen Th17-Zellen fördern (Sutton et al., 2009; Murdoch and Lloyd, 2010). Daraus lässt sich schließen, dass die jeweilige Rolle von IL-17A – pro- bzw. anti-inflammatorisch – möglicherweise vom jeweiligen produzierenden Zelltyp abhängig ist. 3.3.3 IL-17A und die virale Immunantwort Es ist bereits bekannt, dass IL-17A bei der Abwehr extrazellulärer Pathogene, besonders bei Bakterien und Pilzen, eine entscheidende Rolle spielt. Aber auch bei der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort scheinen Th17-Zellen und IL-17A beteiligt zu sein, wobei ihre genaue Rolle noch nicht geklärt ist (Gaffen, 2011; Martinez et al., 2012). Allgemein geht man davon aus, dass IL-17A während einer viralen Infektion die inflammatorische Immunantwort steigert. Dies zeigt sich z. B. darin, dass IL-17RA defiziente Mäuse nach einer Infektion mit dem Influenza-Virus weniger pro-inflammatorische Zyokine bilden. Dies hat möglicherweise zur Folge, dass sich Pathogene aufgrund einer ineffizienten Entzündungsreaktion ungehindert ausbreiten können. Man geht auch davon aus, dass die jeweilige Rolle dieses Zytokins vom immunologischen Hintergrund des Wirts und vom jeweiligen Virus abhängt. (Gaffen, 2011; Ryzhakov et al., 2011) Bei einer primären Infektion mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus (RSV) kommt es sowohl im Menschen als auch in der Maus zu einem Anstieg des IL-17A Proteins. Murine Studien einer primären RSV Infektion zeigten auch, dass es zu einer durch IL-17A induzierten Mukushypersekretion sowie zu einer negativen Beeinflussung zytotoxischer CD8+ Zellen und einer verminderten viralen Clearence kommt (Mukherjee et al., 2011; Martinez et al., 2012). Andererseits konnte im murinen Asthmamodell gezeigt werden, dass IL-17A die durch den Respiratorischen Synzytial-Virus 50 Einleitung verursachte AHR und Entzündungsreaktion in asthmatischen Mäusen unterdrückt. Diese Demonstration erfolgte in IL-17A defizienten Mäusen, welche zunächst mit OVA und anschließend mit RSV behandelt wurden. In diesem Modell wurden eine erhöhte AHR, sowie eine gesteigerte Konzentrationen an IL-13 und eosinophilen Granulozyten nachgewiesen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine RSV Infektion während einer bereits bestehenden allergischen Entzündungsreaktion der Atemwege zu erhöhten IL-17A Konzentrationen, aber zur Reduktion von antiviralen Typ I Interferonen und IFN-führte (Newcomb et al., 2013). Insgesamt gesehen bedarf es aber noch eingehender Untersuchungen, um die Rolle des Interleukins 17A bei der (anti-) viralen Immunantwort besser zu verstehen. 3.4 Der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg Die Interferone wurden vor mehr 50 Jahren im Zusammenhang mit der Abwehr von Influenzaviren entdeckt (Isaacs and Lindemann, 1957) Mittlerweile sind die Zytokine der IFN Familie als wichtige Bestandteile der antiviralen Immunantwort anerkannt. So werden sie z. B. in der Therapie bei Infektionen mit dem Hepatitis C Virus eingesetzt (Borden et al., 2007; Sadler and Williams, 2008). Je nach ihrem spezifischen Rezeptor unterscheidet man Typ I - III Interferone. Zu den Typ I IFN zählen IFN, IFN, IFNκ, IFNε, IFNο, IFNτ und IFNδ. Sie binden an den IFNAR (IFN alpha Rezeptor), ein Heterodimer aus IFNAR1 und IFNAR2. Typ I Interferone sind für ihre essentielle Rolle bei der Abwehr viraler Erreger bekannt. Zu den Typ II Interferonen zählt IFN-welches an den IFN- Rezeptorkomplex (IFNGR), bestehend aus IFNGR1 und IFNGR2, bindet. Dieses Zytokin bekämpft vor allem nicht-virale Erreger. IFNλ zählt zu der dritten Gruppe. Diese Gruppe interagiert mit einem Rezeptorkomplex, bestehend aus IL-10R2 und IFNLR1 (IFN lambda Rezeptor 1). Auch bei diesen Zytokinen geht man von antiviralen Eigenschaften aus (Borden et al., 2007; Sadler and Williams, 2008). 51 Einleitung Für die Aktivierung des antiviralen OAS1-RNaseL Signalweges sind die Zytokine der Typ I und Typ III Gruppe von Bedeutung. Nachdem die Typ I bzw. Typ III Interferone an ihren jeweiligen Rezeptor gebunden haben, wird die weitere Signaltransduktion über die JAK1 (Januskinase 1) und TYK2 (Tyrosinkinase 2) eingeleitet, was zur Phosphorylierung des IFNAR1 und anschließend zur Rekrutierung und Phosphorylierung von STAT1 und STAT2 führt. Die phosphorylierten STAT Heterodimere gehen mit IRF9 eine Bindung ein und bilden so ISGF3 (IFN-stimulated gene factor 3). Dieser Komplex transloziert in den Zellkern, um dort ISREs (IFN-stimulated response elements) zu induzieren. Daraufhin kommt es zur Transkription der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase OAS1 (s. Abb. 3-6). Im Zellzytoplasma akkumuliert OAS1 als inaktives Monomer. Nach Binden viraler dsRNA kommt es zur Oligomerisierung des Enzyms und somit zur Bildung eines katalytisch-aktiven Tetramers. Dieses wiederum erzeugt aus ATP (Adenosin-Triphosphat) Molekülen ein 2´-5´-Polyadenylat (2-5 A). Dieses Polyadenylat bindet an die inaktive RNaseL (latente Ribonuclease), welche als Monomer vorliegt und löst somit eine Dimerisierung aus. Die aktivierte RNaseL ist nun in der Lage, virale RNA zu degradieren. Sie unterscheidet jedoch nicht zwischen viraler und zellulärer RNA, wodurch auch zelluläre Prozesse zum Erliegen kommen. Die Aktivität dieses Enzyms ist daher durch eine geringe Halbwertszeit reguliert (s. Abb. 3-5) (Hovanessian et al., 1988; Silverman, 2007; Sadler and Williams, 2008; Zhao et al., 2012; Hornung et al., 2014). 52 Einleitung Abb. 3-6 Interferon-Rezeptor Signalweg (verändert nach (Sadler and Williams, 2008; Hornung et al., 2014) Abb. 3-5 OAS1-RNaseL Signalweg (verändert nach (Sadler and Williams, 2008; Hornung et al., 2014) 53 Zielsetzung 4 Zielsetzung In bisherigen Studien konnte nachgewiesen werden, dass das Interleukin 17A (IL-17A) bei Asthmapatienten vermehrt gebildet wird und positiv mit der Schwere der Erkrankung korreliert. So bringt man dieses Zytokin mit schwerem neutrophilen und steroid resistentem Asthma in Verbindung. Weiterhin geht man davon aus, dass IL-17A an der für Asthma bronchiale typischen Mukushypersekretion und Atemwegshyperreaktivität beteiligt ist. Ein Ziel dieser Arbeit war es daher, die Rolle des Interleukins 17A in einem murinen Modell des allergischen Asthmas eingehender zu untersuchen. Zu diesem Zweck sollten IL-17A defiziente Mäuse im Asthmamodell untersucht werden, um einerseits die Effekte von IL-17A auf typische Asthmasymptome wie AHR, bronchiale Entzündungsreaktionen und Mukushypersekretion näher zu analysieren und andererseits den Einfluss von IL-17A auf Mastzellen, Th1-, Th2- und Treg-Zellen, welche an der Immunreaktion im allergischen Asthma beteiligt sind, zu untersuchen. Auslöser des allergischen Asthma bronchiale ist eine überschießende Immunreaktion auf eigentlich harmlose Antigene. Die Atemwegstoleranz stellt eine spezielle Form der körpereignen Immunantwort dar, welche durch eine ausbleibende bzw. stark reduzierte Immunantwort nach Kontakt mit speziellen, harmlosen Antigenen gekennzeichnet ist. Somit könnte die gezielte Induktion der Atemwegstoleranz eine effektive Therapiemaßnahme bei allergischem Asthma bronchiale sein. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es daher, im murinen Modell zu untersuchen, ob und wie IL-17A bei der Vermittlung der Atemwegstoleranz beteiligt ist. Neben Allergenen können auch Viren zur Pathogenese des Asthma bronchiale beitragen. Hierbei spielen v. a. Rhinoviren eine bedeutende Rolle, da sie als Auslöser der Erkältungskrankheit zur Verschlimmerung der Asthmasymptomatik beitragen können. Es konnte jedoch bisher noch nicht eindeutig geklärt werden, ob Rhinoviren einen Auslöser für 54 Zielsetzung die Asthmaerkrankung darstellen. Das Hauptziel der europaweiten Studie PreDicta (Post infectious immune-reprogramming and its association with persistance and chronicity of respiratory allergic diseases) ist es daher, die Zusammenhänge zwischen wiederholt auftretenden viralen Infektionen im Kindesalter sowie der Entstehung und dem Verlauf von Asthma bronchiale zu erforschen. In einem weiteren Abschnitt der vorliegenden Arbeit sollte deshalb untersucht werden, ob und in welcher Weise das Interleukin 17A an der durch Rhinoviren hervorgerufenen antiviralen Immunantwort beteiligt ist, insbesondere vor dem Hintergrund einer bestehenden Asthmaerkrankung. Es bestehen bereits Hinweise darauf, dass IL-17A an der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort beteiligt ist, indem es die inflammatorische Immunantwort steigert, was sowohl positive als auch negative Effekte mit sich bringt. Welche Rolle IL-17A im Zuge einer Rhinovirusinfektion einnimmt, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Zu diesem Zweck sollte zum einen humanes Probenmaterial von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern, welche eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen aufwiesen, untersucht werden. Außerdem sollten murine Zellen von naiven und asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen analysiert werden, welches in vitro mit dem Rhinovirus 1b infiziert wurde. Da Asthma bronchiale üblicherweise mit 2-Sympathomimetika und Glucocorticoiden behandelt wird, sollte bei Kindern mit Asthma zusätzlich analysiert werden, wie sich die jeweilige Therapie auf die antivirale Immunantwort auswirkt. Bisher konnte bereits gezeigt werden, dass eine Therapie mit Glucocorticoiden und 2-Sympathomimetika negative Auswirkungen auf die IFN und IL-17A Produktion hat. Zusammengefasst sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob IL-17A an der Vermittlung der Atemwegstoleranz beteiligt ist und welche Rolle IL-17A bei der Entstehung und dem Verlauf des Asthma bronchiale spielt, besonders im Zusammenhang mit viralen Infektionen. 55 Material und Methoden 5 Material und Methoden 5.1 Material 5.1.1 Laborgeräte Gerät Absorptionsreader MRX TC Revelation Aerosol-Expositionssystem CO2-Inkubator HERAcell 150i Herstelle Dynex Technologies GmbH, Denkendorf FMI GmbH, Seeheim-Oberbeerbach Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA TM 4D-Nucleofector X Unit Lonza, Köln Dispergiergerät Miccra D1 ART Prozess-und Labortechnik GmbH, Müllheim TM Durchflusszytometer BD FACS Calibur BD Biosciences, Heidelberg Elektrophorese-Kammer für SDS-PAGE Bio-Rad Laboratories GmbH, München Ganzkörperplethysmograph Buxco Electronics, Sharon, CT, USA Gelelektrophorese-Stromquelle Bio-Rad Laboratories, München Gel-Dokumentationssystem Intas Science Imaging Instruments GmbH, Göttingen Heizblock Thermomixer Comfort Eppendorf AG, Hamburg Kompaktschüttler KS 15A Johanna Otto GmbH, Hechingen Laborschüttler S20 Ingenieurbüro CAT, M. Zipperer GmbH, Staufen MACS® Separationssäulen Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach Magnetrührer MR3001 Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Mikroskop Axio Vision Carl Zeiss GmbH, Jena Mikroskop Observer D.1 Carl Zeiss GmbH, Jena Mikroskop Primo Vert Carl Zeiss GmbH, Jena Neubauerkammer Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe ® OctoMACS Separation Unit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach pH-Meter InoLab® WTW Wissenschaftlich-Technische Werkstätten GmbH, Weilheim Pipetten Eppendorf AG, Hamburg Pipettierhilfe Hirschmann Laborgeräte GmbH, Heilbronn Plethysmograph für invasive Messungen der flexiVentTM, SCIREQ® Scientific AHR Respiratory Equipment Inc., Montreal, Kanada ® QuadroMACS Separation Unit Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch-Gladbach QIAxcel Advanced System Qiagen GmbH, Hilden Reagenzglasschüttler Reax Control Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Spektrophotometer Nanodrop Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Sterilbank Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Sterilbank Mars Safety Class 2 Scanlaf, LaboGene ApS, Lynge, Dänemark Thermocycler Primus 25 advanced Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Thermocyler peqSTAR 96 Universal Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Thermocycler für qPCR CFX-96 Bio-Rad Laboratories GmbH, München 56 Material und Methoden Gerät Hersteller Ultraschallbad Sonorex RK 510S Bandelin Elektronic GmbH, Berlin Vakuumpumpe MINI VAC E1 Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen Vortex Reax Control Heidolph Instruments GmbH, Schwabach Waage AE50 Mettler, Basel, Schweiz Waage PM300 Mettler, Basel, Schweiz Washer für 96-Well-Platten iLF-Bioserve, Langenau Wasserbad Memmert GmbH, Schwabach Zellzählgerät CASY 1 Cell Counter Modell Schärfe Systeme GmbH, Reutlingen TT Zentrifugen Heraeus Megafuge 1.0R, Heraeus Instruments GmbH, München Kühlzentrifuge, Eppendorf AG, Hamburg Tischzentrifuge, Eppendorf AG, Hamburg Zytospinzentrifuge Cytospin 4, Shandon, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Tabelle 5-1 Laborgeräte 5.1.2 Verbrauchsmaterial Vor Gebrauch wurden alle Glasgeräte bei 121°C autoklaviert. Verbrauchsmaterial aus Plastik wurde als sterile Einmalware bezogen. Verbrauchsmaterial Cryotubes EasyMag extractor ESwabTM FACS Röhrchen MaxiSorp 96-well-Platte für ELISA Multiplate® Low 96 well clear für qPCR NucleocuvetteTM Pasteurpipetten aus Glas Parafilm Petrischalen 5 ml Plastikpipetten, steril 10 ml Plastikpipetten, steril 25 ml Plastikpipetten, steril 50 ml Plastikpipetten, steril 24-well Platte 48-well Platte Hersteller Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Biomeriex, Mary l´Etoile, Frankreich Copan, Brescia, Italien BD Bioscience, Heidelberg Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Bio-Rad Laboratories GmbH, München Lonza, Köln Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen 57 Material und Methoden Verbrauchsmaterial 96-well Platte Polylysin-Objektträger 15 ml Röhrchen 50 ml Röhrchen 0,2 ml Reaktionsgefäß für PCR 0,5 ml Reaktionsgefäß 1,5 ml Reaktionsgefäß 2,0 ml Reaktionsgefäß Sieb Cell strainer 40 µm Nylon Skalpelle, steril Spritzen Omnifix®-F Spritzen Injekt F Sterican®-Insulinkanülen G26 Hersteller Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Menzel, Braunschweig Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen VWR International GmbH, Darmstadt Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg Eppendorf AG, Hamburg BD Falcon, Bedford, MA, USA Feather Safety Razor Co, Köln B.Braun Melsungen AG, Melsungen B.Braun Melsungen AG, Melsungen B.Braun Melsungen AG, Melsungen Tabelle 5-2 Verbrauchsmaterialien 5.1.3 Chemikalien und Reagenzien Chemikalie / Reagenz Hersteller Aceton Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Agarose STARLAB GmbH, Ahrensberg Aluminiumkaliumdisulfat (AlK(SO4)2) Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche Aluminiumkaliumbisulfat Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche Ammoniumchlorid (NH4Cl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Aprotinin Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, Münche Assay Diluent für ELISA BD Bioscience, Heidelberg BD Golgi-StopTM Protein Transport Inhibitor BD Bioscience, Heidelberg Biocoll seperating solution 1,077 g/ml Biochrom GmbH, Berling Bovines Serumalbumin Fraktion V (BSA), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München gereinigt Casy® Clean Lösung Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ® Casy ton Isotone Salzlösung Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Chloroform Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Desoxy-Nucleosid-Triphosphate (dNTPs) Promega GmbH, Mannheim Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Dinatriumcarbonat (Na2CO3) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Dinatrium-EDTA Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe DNase-I Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Entellan Mounting Medium Merck KGaA, Darmstadt Essigsäure 100% Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ethanol 99,5%, reinst Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Fetal bovine serum (FBS), Hitze inaktiviert Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Fetal calf serum (FCS) PAA Laboratories GmbH, Cölbe Formaldehyd (37%) Merck KGaA, Darmstadt GelRed® Biotium Inc., Hayward, CA, USA 58 Material und Methoden Chemikalie / Reagenz Giemsa-Stammlösung Ham´s F12K (Kaighn´s) Medium Hersteller Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Life technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA L-Glutamin Invitrogen GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Glycerin Merck KGaA, Darmstadt Glykogen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Glyzin Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Igepal® (NP-40) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Ionomycin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Isofluran Abbott, GmbH + Co. KG, Wiesbaden Isopropanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Kaliumchlorid (KCl) Merck KgaA, Darmstadt Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ketamin Ratiopharm, Ulm Kollagenase Typ Ia Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München TM Mag Max (Isolations-Kit für RNA) Life technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA May-Grünwald-Lösung Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe -Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München MEM Non-essential amino acid solution Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München MEM Vitamin solution 100x Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Methacholin Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Methanol Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe M-MuLV Reverse Transkriptase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Nacoren® (Pentobarbital-Natrium) Merial Gmbh, Hallbergmoos Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Natriumhydroxid (NaOH) Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Ovalbumin (Albumin chicken egg, 5x Calbiochem GmbH, Bad Soden crystalline) Paraformaldehyd Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Penicillin/Streptomycin Lösung Invitrogen GmbH, Karlsruhe TM PeqGold RNA Pure PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen Permfix Puffer eBioscience (Natu Tec GmbH), Frankfurt Permwash Konzentrat (10x) eBioscience, Frankfurt Phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) Invitrogen GmbH, Karlsruhe Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)-EDTA Lonza GmbH, Köln Proteinase K Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Puffer für Reverse Transkriptase (5x) Fermentas GmbH, St. Leon-Rot ® QUIazol Lysis Reagent Quiagen Sciences, Maryland, USA Random Hexamer Primer Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Release 300mg/ml (Pentobarbital-Natrium) WDT, Garbsen Red Load Taq Master Jena Bioscience GmbH, Jena 59 Material und Methoden Chemikalie / Reagenz RiboLock RNase Inhibitor Rompun® (Xylazin) Roti-Load Rotiphorese® Gel 40 RPMI 1640 Salzsäure 37%, reinst Schwefelsäure 98% Sodium pyruvate solution 100 mM SsoFastTMEvaGreen® Supermix für qPCR Sterofundin 3,3´5,5´Tetramethylbenzidin (TMB) N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Tempus® Blood RNA Tube TM Tris-Base Tris-HCl Trypanblau 0,4% Trypsininhibitor Tween-20 Wasser (UltraPureTM DEPC treated Water) Wasser (nuclease frei) Wasser (steril, zur Injektion) Wasserstoffperoxid (H2O2) 30% Zitronensäure- Monohydrat Hersteller Fermentas GmbH, St. Leon-Rot Bayer AG, Leverkusen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Invitrogen GmbH, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Bio-Rad Laboratories GmbH, München B. Braun Melsungen AG, Melsungen Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Life technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Gibco, Invitrogen Cor., New York, USA Sigma-Aldrich Chemie Gmbh, München Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Invitrogen GmbH, Karlsruhe Fermentas GmbH, St. Leon-Rot B. Braun Melsungen AG, Melsungen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe Tabelle 5-3 Chemikalien und Reagenzien 5.1.4 ELISA-Kits ELISA-Kit Histamin ELISA Fast Track Lactate Dehydrogenase Activity Kit Human IL-17 (DuoSet®) Maus IFN (OptEIATM) Maus IgE (OptEIATM) Maus IL-3 (OptEIATM) Maus IL-4 (OptEIATM) Maus IL-5 (OptEIATM) Maus IL-10 (OptEIATM) Maus IL-13 (DuoSet®) Maus IL-17A (DuoSet®) Maus Tgf (DuoSet®) Hersteller Labor Diagnostika Nord GmbH + Co. KG, Nordhorn Sigma-Aldrich, Steinheim R&D Systems GmbH, Wiesbaden BD Bioscience, Heidelberg BD Bioscience, Heidelberg BD Bioscience, Heidelberg BD Bioscience, Heidelberg BD Bioscience, Heidelberg BD Bioscience, Heidelberg R&D Systems GmbH, Wiesbaden R&D Systems GmbH, Wiesbaden R&D Systems GmbH, Wiesbaden Tabelle 5-4 ELISA-Kits 60 Material und Methoden 5.1.5 Antikörper und Zytokine Reagenz Maus anti-CD3 Antikörper Maus anti-CD28 Antikörper Maus anti-CD4 Antikörper Maus anti-IFN-Antikörper Rekombinantes IL-17A (human) Rekombinantes IL-17A (murin) Rekombinantes IL-6 (murin) Rekombinantes TGF- (murin) Hersteller Generiert aus Hybridoma-Zellen bzw. BD Bioscience, Heidelberg Generiert aus Hybridoma-Zellen bzw. BD Bioscience, Heidelberg Generiert aus Hybridoma-Zellen Generiert aus Hybridoma-Zellen PeproTech GmbH, Hamburg R&D Systems GmbH, Wiesbaden PeproTech GmbH, Hamburg PeproTech GmbH, Hamburg Tabelle 5-5 Antikörper und Zytokine 5.1.6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen Antikörper CCR-3 CD3 CD4 CD8 CD25 (Interleukin-2 Rezeptor, alpha) CD45R CD117 (ckit) CD123 (Interleukin-3 Rezeptor, alpha) Foxp3 FcεRIα Ly-6G (GR-1) IL-13 Hersteller BD Bioscience, Heidelberg eBioscience, Frankfurt eBioscience, Frankfurt BD Bioscience, Heidelberg eBioscience, Frankfurt eBioscience, Frankfurt eBioscience, Frankfurt eBioscience, Frankfurt Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach eBioscience, Frankfurt BD Bioscience, Heidelberg eBioscience, Frankfurt Tabelle 5-6 Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen 5.1.7 Beads zur magnetischen Zellseparation Isolationskits und Beads CD4 (L3T4) microbeads CD11c (N418) microbeads Hersteller Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Tabelle 5-7 Beads zur magnetischen Zellseparation 61 Material und Methoden 5.1.8 Oligonukleotide Die verwendeten Oligonukleotide stammten von der Firma Eurofins MWG Operon aus Ebersberg. Genotypisierungs-Primer Common primer 1 WT primer 1 KO primer 1 Sequenz 5´-3´ ACT CTT CAT CCA CCT CAC ACG A GTA CAC CAG CTA TCC TCC AGA TAG TCC TTG AAG TCG ATG CCC TTC A Tabelle 5-8 Sequenzen der Genotypisierungs-Primer für IL-17A(-/-) PCR Oligonukleotide für Rhinovirus PCR OL 26 OL 27 Sequenz 5´-3´ GCA CTT CTG TTT CCC C CGG ACA CCC AAA GTA G Tabelle 5-9 Sequenzen der Primer für die Rhinovirus PCR qPCR-Oligonukleotide Human ETS1 Human HPRT Human IFN- Human IL-6 Human IL-17A Human OAS1 Human T-BET Human TYK2 Maus Batf Maus Bcl6 Maus Cxcr5 Maus Foxp3 Sequenz 5´-3´ Fwd: TGG AGT CAA CCC AGC CTA TC Rev: TCT GCA AGG TGT CTG TCT GG Fwd: TGA CAC TGG CAA AAC AAT GCA Rev: GGT CCT TTT CAC CAG CAA GCT Fwd: AGT AGG CGA CAC TGT TCG TG Rev: AGC CTC CCA TTC AAT TGC CA Fwd: TAC CCC CAG GAG AAG ATT CC Rev: TTT TCT GCC AGT GCC TCT TT Fwd: CAA GAC TGA ACA CCG ACT AAG Rev: TCT CCA AAG GAA GCC TGA Fwd: AGC TGG AAG CCT GTC AAA GA Rev: GGT TTA TAG CCG CCA GTC AA Fwd: CAG AAT GCC GAG ATT ACT CAG Rev: GGT TGG GTA GGA GAG GAG AG Fwd: CCT CCT GGA GAT CTG CTT TG Rev: TCT GGG TTG GCT CAT AGG TC Fwd: GTT CTG TTT CTC CAG GTC C Rev: GAA GAA TCG CAT CGC TGC Fwd: ATG TAC AGC CAT CTC CCG CT Rev: TTA GGG ACT TGC CTG GCA CT Fwd: GAC TCC TTA CCA CAG TGC ACC TT Rev: GGA AAC GGG AGG TGA ACC A Fwd: AGA GCC CTC ACA ACC AGC TA Rev: CCA GAT GTT GTG GGT GAG TG 62 Material und Methoden qPCR-Oligonukleotide Maus Gata3 Maus Hprt Maus Ifn Maus Il-6 Mauls Il-6r Maus Il-9 Maus Il-10 Maus Il-13 Maus Il-21 Maus Il-21r Maus Oas1a Maus Oas1g Maus Tgf Sequenz 5´-3´ Fwd: GTC ATC CCT GAG CCA CAT CT Rev: TAG AAG GGG TCG GAG GAA CT Fwd: GCC CCA AAA TGG TTA AGG TT Rev: TTG CGC TCA TCT TAG GCT TT Fwd: CCC TAT GGA GAT GAC GGA GAA G Rev: GAG CAT CTC TTG GAT GGC AAA Fwd: AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA Rev: TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC Fwd: GCC CAA ACA CCA AGT CAA CT Rev: TAT AGG AAA CAG CGG GTT GG Fwd: CTG ATG ATT GTA CCA CAC CGT GC Rev: GCC TTT GCA TCT CTG TCT TCT GG Fwd: CCA AGC CTT ATC GGA AAT GA Rev: TTT TCA CAG GGG AGA AAT CG Fwd: CAG CTC CCT GGT TCT CTC AC Rev: CCA CAC TCC ATA CCA TGC TG Fwd: CAG GAG GGG AGG AAA GAA AC Rev: GGG AAT CTT CTC GGA TCC TC Fwd: CTC CCC CCT TGA ACG TGA CT Rev: TTG CCC CTC AGC ACG TAG TT Fwd: TTC CAG CAA GCC TGA TCC CA Rev: CCC AGC TTC TCC TTA CAC AGT T Fwd: AAT GAT GGT TCC CGA GTG AG Rev: GGC TGT GAT TGG ACA GGA GT Fwd: GTC CTT GCC CTC TAC AAC CA Rev: GTT GGA CAA CTG CTC CAC CT Tabelle 5-10 Sequenzen der qPCR Oligonukleotide 5.1.9 Humanes Probenmaterial (PreDicta-Studie) Bei allen Studienteilnehmern wurde zu Beginn der Studie ein Nasopharynxabstrich durchgeführt und auf Rhinoviren hin untersucht. Der jeweilige Befund ist in der Spalte „Rhinovirus Nachweis“ mit „positiv“ bzw. „negativ“ angegeben. Ein „-“ in dieser Spalte bedeutet, dass das Testergebnis nicht eindeutig war. In der Spalte „Therapie“ ist bei Kindern mit Asthma angegeben, mit welcher Medikamentengruppe sie behandelt wurden. Hierbei bedeutet „s“, dass die Kinder mit Steroiden (= Glucocorticoide) behandelt wurden, 63 Material und Methoden wohingegen „ns“ für nicht-steroidale Arzneimittel wie beispielsweise 2-Sympathomimetika oder Leukotrienantagonisten steht. Die meisten Asthmakinder erhielten sowohl steroidale- als auch nicht-steroidale („s, ns“) Arzneimittel. Ein „-“ in dieser Spalte bedeutet, dass bei dem jeweiligen Kind keine Dauermedikation vorgesehen war. Sie nahmen nur im Bedarfsfall Medikamente (Reliever) ein. Patient Alter Geschlecht [Jahre] Rhinovirus Therapie Nachweis Kontrollkinder K1 6 männlich negativ - K2 5 weiblich positiv - K3 5 männlich positiv - K4 4 männlich negativ - K5 4 weiblich positiv - K6 5 weiblich - - K7 5 weiblich negativ - K8 4 männlich positiv - K9 6 männlich negativ - K10 4 weiblich - - K11 6 männlich negativ - K12 4 männlich positiv - K13 5 weiblich positiv - K14 5 weiblich positiv - K15 4 männlich positiv 64 Material und Methoden Patient Alter Geschlecht [Jahre] Rhinovirus Therapie Nachweis K16 5 männlich negativ - K17 4 männlich negativ - K18 4 weiblich positiv - K19 4 männlich positiv - K20 5 weiblich - - K21 4 männlich negativ - K22 4 männlich - - Kinder mit Asthma A1 5 männlich positiv s, ns A2 5 männlich positiv s A3 5 weiblich negativ s A4 6 männlich negativ s, ns A5 5 männlich negativ s, ns A6 5 weiblich positiv s A7 5 männlich negativ s, ns A8 4 weiblich negativ s A9 6 weiblich negativ ns A10 5 männlich negativ s, ns A11 4 männlich positiv s, ns A12 5 weiblich negativ s, ns A13 6 weiblich negativ s A14 5 männlich positiv s, ns 65 Material und Methoden Patient Alter Geschlecht [Jahre] Rhinovirus Therapie Nachweis A15 4 weiblich - S A16 4 männlich positiv s, ns A17 5 männlich negativ - A18 4 männlich positiv ns A19 5 männlich positiv - A20 4 männlich negativ s, ns A21 4 männlich positiv s, ns A22 5 weiblich positiv - A23 5 männlich - s, ns A24 5 weiblich positiv s, ns Tabelle 5-11 Übersicht der an der PreDicta-Studie beteiligten Kinder: Die Kontrollkiner (K) waren im Durchschnitt 4,6 Jahre alt (SEM ± 0,2), die an Asthma erkrankten Kinder (A) 4,8 Jahre (SEM ± 0,1). Ein „ – “ in der Spalte „Rhinovirus Nachweis“ bedeutet, dass hier keine eindeutigen Ergebnisse vorlagen. In der Spalte „Therapie“ steht „s“ für steroidale Arzneimittel, „ns“ für nicht-steroidale Medikamente. Ein „ – “ bei Kindern mit Asthma in dieser Spalte bedeutet, dass bei diesen Kindern keine Dauermedikation vorgesehen war. Sie nahmen nur im Bedarfsfall Medikamente (Releaser) ein. 5.1.10 Rhinovirus 1b (RV1b) Da bei den Analysen der vorliegenden Arbeit sowohl humane als auch murine Zellen mit dem Rhinovirus infiziert werden sollten, wurde der Rhinovirus 1b benutzt. Dieser zählt zu der kleineren Untergruppe der humanen Rhinoviren und bindet sowohl an die humanen als auch die murinen Proteine der LDL-Rezeptorengruppe. Im Gegensatz dazu binden die Serotypen der Hauptgruppe nur das humane ICAM-1 (Bartlett et al., 2008). Um den Virus zu vermehren wurden, wie von Tuthill et al. beschrieben (Tuthill et al., 2003), Ohio HeLa Zellen verwendet. Der RV1b wurde dazu aus infektiösen cDNA Klonen generiert. Durch Endpunkttitration wurde ein Titer von TCID50/ml 107 ermittelt. TCID50 steht für „Tissue culture infective dose“ und stellt die Verdünnung einer geometrischen Verdünnungsreihe dar, bei der 50 % der 66 Material und Methoden beimpften Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Der Rhinovirus 1b wurde uns freundlicherweise im Zuge der PreDicta Studie von der Abteilung für Allergie und Immunologie der Nationalen und Kapodistrischen Universität Athen (Griechenland; Nikolaos G. Papadopoulos, Stella Taka und Rena Stergiou) zur Verfügung gestellt. 5.1.11 Puffer und Lösungen 5.1.11.1 Zellkulturmedium für humane PBMCs Komponente RPMI 1640 + HEPES 25mM + L-Glutamin Penicillin Streptomycin 1M -Mercaptoethanol L-Glutamin MEM Vitamin Non-essential Amino Acid Solution Sodium Pyruvat FBS Konzentration 100 IU/ml 100 µg/ml 50 µM 1% 1% 1% 1% 10% 5.1.11.2 Zellkulturmedium für humane A549 Zellen Komponente Ham´s F12K (Kaighn´s) Medium Penicillin Streptomycin L-Glutamin FCS Konzentration 100 IU/ml 100 µg/ml 1% 10% 5.1.11.3 Puffer für die Genotypisierung von Mäusen Stammlösung für Ohrbiopsie-Verdau Komponente Tris-Base EDTA NaCl SDS Konzentration 100 mM 500 mM 200 mM 0,2 % 67 Material und Methoden Verdaupuffer für eine Ohrbiopsie Komponente Stammlösung Proteinase K (10 mg/ml) Tween 20 Igepal® (10%) Volumen 200 µl 5 µl 1 µl 1 µl 5.1.11.4 Puffer und Lösungen für die Zellisolation und Zellkultur Kollagenase-DNase Lösung Komponente PBS Kollagenase Typ Ia DNaseI (10 mg/ml) Konzentration 300 U/ml 0,01% ACK-Lyse Puffer (pH 7,2-7,4) Komponente Aqua dest. NH4Cl KHCO3 Na2-EDTA Konzentration 0,15 M 0,1 mM 0,1 mM Puffer für MACS® Separation Komponente PBS-EDTA BSA Konzentration 0,5 % Carbonatpuffer für anti-CD3 Beschichtung der Zellkulturplatte (pH 8,2) Komponente NaHCO3 Konzentration 0,1 M 68 Material und Methoden Zellkulturmedium Komponente RPMI 1640 (+ L-Glutamin) FCS Penicillin/Streptomycin Konzentration 10 % 1% 5.1.11.5 Puffer und Lösungen für ELISA Carbonatpuffer (pH 9,5) Komponente Aqua dest. Na2CO3 NaHCO3 Konzentration 3 mM 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) Komponente Aqua dest. Na2HPO4 NaH2PO4 Konzentration 8 mM 13 mM Waschpuffer Komponente PBS Tween-20 Konzentration 0,05 % TMB-Lösung Komponente TMB Aceton Ethanol H2O2 (30%) Konzentration 2mM 172 mM 1,95 M 50 mM 69 Material und Methoden Substratpuffer (pH 4,1) Komponente Aqua dest. Zitronensäure Monohydrat Konzentration 30 mM TMB-Substratlösung Für 96 well Platte Komponente TMB-Lösung Substratpuffer Volumen 500 µl 9500 µl Stopplösung Komponente H2SO4 Konzentration 30 % 5.1.11.6 Kulturmedium für die Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark Komponente RPMI 1640 FCS L-Glutamin Penicillin Streptomycin -Mercaptoethanol EPES IL-3 SCF Konezntration 10% 2 mM 100 U/ml 100 µg/ml 50 µM 10 mM 10 ng/ml 10 ng/ml 5.1.11.7 Tyrod´s Puffer für Histamin-Release aus Mastzellen (pH 7,4) Komponente NaCl Glucose KCl CaCl2 x 2 H2O BSA HEPES NaH2PO4 x H2O Konezntration 8 g/l 1 g/l 0,2 g/l 0,147 g/l 1 g/l 2,38 g/l 0,0552 g/l 70 Material und Methoden 5.1.11.8 Sontige Puffer und Lösungen TAE Puffer Komponente Tris Na2-EDTA Essigsäure Konzentration 400 mM 10 mM 200 mM 71 Material und Methoden 5.2 Methoden 5.2.1 PreDicta-Studie Im Zuge dieser Arbeit wurde humanes Probenmaterial analysiert, welches aus der Studie PreDicta (post-infectious immune reprogramming and its association with persistence and chronicity of respiratory allergic diseases) hervorging (s. Tabelle 5-11). Bei PreDicta handelt es sich um eine europaweite, prospektive, multizentrische Kohorten Studie. Das Projekt basiert auf der Beobachtung, dass Asthma im Kindesalter meist nach einer viralen Infektion der Atemwege auftritt. Hierbei scheint vor allem der humane Rhinovirus eine wichtige Rolle zu spielen. Aufgrund dieser Erkenntnisse ergibt sich die zentrale Hypothese dieser Studie, welche besagt, dass wiederholte, akute infektionsbedingte Vorkommnisse sowohl das angeborene als auch das erworbene und möglicherweise auch das regulatorische Immunsystem so beeinflussen, dass die Wahrscheinlichkeit für eine chronische Entzündung steigt. Ziel der PreDicta Studie ist es, die Zusammenhänge zwischen Infektionen und der Persistenz des Asthma bronchiale eingehender zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Vorschulkinder in fünf europäischen Ländern (Belgien, Deutschland, Finnland, Griechenland und Polen) im Alter von vier bis sechs Jahren über einen Zeitraum von zwei Jahren untersucht. Studienzentrum in Deutschland ist die Abteilung für Molekulare Pneumologie des Universitätsklinikums Erlangen in Zusammenarbeit mit der Kinder- und Jugendklinik sowie dem Mikrobiologischen Institut des Universitätsklinikums Erlangen. Die an der Studie beteiligten Kinder waren entweder gesund (Kontrollgruppe) oder hatten eine positive Diagnose für Asthma bronchiale (Asthmagruppe). Die Studie wurde von der Ethikkommission der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg genehmigt (Registriernummer 4435). Eine Einverständniserklärung der Eltern der teilnehmenden Kinder wurde eingeholt (Deutsches Register Klinischer Studien DRKS00004914). Das Studienprotokoll sah vor, dass die Kinder über einen Zeitraum von 24 Monaten hinweg untersucht wurden. Beim ersten und beim letzten Besuch wurde peripheres Blut 72 Material und Methoden abgenommen, um daraus einerseits periphere mononukleäre Zellen (PBMCs) zu isolieren, andererseits wurde auch Serum gewonnen. Außerdem wurde aus dem Vollblut direkt RNA extrahiert. Des weiteren wurde an diesen Tagen ein Nasenabstrich entnommen, um Infektionen mit Viren nachweisen zu können. Ebenfalls wurde bei diesen Terminen die Lungenfunktion überprüft und ein Lauftest durchgeführt. Zwischen dem ersten und dem letzten Besuch in der Klinik wurde bei den Kindern der Asthmagruppe zusätzlich im halbjährlichen Abstand die Lungenfunktion überprüft sowie ein Nasenabstrich und ein Lauftest durchgeführt. Zwischen den halbjährlichen Besuchen wurden die an Asthma erkrankten Kinder telefonisch zu ihrem Gesundheitszustand befragt (s. Abb. 5-1). Für die Kinder der Asthmagruppe galt außerdem, dass sie in der Klinik vorstellig werden mussten, wenn eine Infektion der oberen Atemwege bzw. eine Exazerbation des Asthmas vorlag (Krankheitsbesuch). Außerdem war ein sogenannter Genesungsbesuch sechs bis acht Wochen nach dem Krankheitsbesuch notwendig. An beiden Terminen wurde Blut zur Gewinnung von Serum sowie ein Nasenabstrich abgenommen. Zusätzlich wurde die Lungenfunktion überprüft. Für die vorliegende Arbeit wurde nur Proben- und Datenmaterial des ersten Besuchs verwendet. Abb. 5-1 Zeitverlauf der PreDicta Studie 73 Material und Methoden 5.2.1.1 RNA Isolation aus dem Vollblut In der Kinderklinik wurde den Studienteilnehmern Vollblut abgenommen und sofort in Tempus® Blood RNA Tubes überführt. Diese Tubes enthalten ein Stabilisierungsreagenz, welches die zelluläre RNase inaktiviert und die RNA selektiv präzipitiert. Bis zur weiteren Verwendung wurde das Probenmaterial bei -80 °C gelagert. Die Extraktion der RNA wurde anschließend laut Herstellerangaben mit dem MagMaxTM System durchgeführt. Dazu wurden die Tempus® Blood RNA Tubes zunächst auf Eis aufgetaut und anschließend der gesamte Inhalt in ein frisches 50 ml Röhrchen überführt und mit Tempus® 1 x PBS zu einem Gesamtvolumen von 12 ml ergänzt. Nach dem Zentrifugieren (15 min, 4 °C, 5000 g) wurde der Überstand verworfen und das Probenmaterial in 4 ml Tempus® Pre-Digestion Wash resuspendiert und erneut zentrifugiert (10 min, 4 °C, 5000 g). Nach sorgfältigem Entfernen des kompletten Überstands wurde die RNA in 120 µl einer Lösung bestehend aus Tempus® Resuspension Solution und Tempus® Proteinase gelöst und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt. Die Aufreinigung der RNA erfolgte mittels magnetischer Beads. Dazu wurde zu der gelösten RNA zunächst 50 µl Binding Solution-Concentrate und 20 µl RNA Binding beads gegeben, homogenisiert und anschließend 200 µl 100 % Isopropanol hinzugefügt und erneut gemischt. Die magnetischen RNA binding beads wurden dann in einem magnetischen Feld von der Lösung abgetrennt, der Überstand vorsichtig abgenommen und anschließend das Reaktionsgefäß aus dem Magnetstativ entfernt. Die Beads wurden je zweimal mit der Washing Solution 1 bzw. Washing Solution 2 gewaschen, indem die jeweilige Waschlösung zu den Beads gegeben wurde und diese im magnetischen Feld wieder von der Lösung abgetrennt wurden. Nach dem Waschen wurden die Beads bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend in 80 µl Elutionspuffer aufgenommen. Nach dem Entfernen der Beads im magnetischen Feld, wurde der Überstand, welcher die aufgereinigte RNA enthielt, in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. 74 Material und Methoden 5.2.1.2 Isolation peripherer mononukleärer Zellen aus dem Vollblut Zu Studienbeginn wurde den Kindern mit Hilfe einer mit Lithium-Heparin beschichteten Monovette peripheres Vollblut entnommen. Daraufhin wurde zunächst das Volumen an Vollblut bestimmt und daraufhin in ein steriles 15 ml Röhrchen überführt, um es mit dem gleichen Volumen an warmen (Raumtemperatur) PBS zu vermischen. Entsprechend dem Ausgangsvolumen an Blut wurde in einem zweiten sterilen 15 ml Röhrchen das entsprechende Volumen an Biocoll Seperating Solution vorgelegt und anschließend mit dem Blut-PBS Gemisch vorsichtig überschichtet. Daraufhin erfolgte eine Dichtegradientzentrifugation bei 800 g und 20 °C für 20 min bei ausgeschalteter Bremse. Die PBMCs (peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) sammelten sich als Ring entsprechend ihrer spezifischen Dichte in der Interphase zwischen Überstand (Serum/Thrombozyten) und Biocoll. Erythrozyten und Granulozyten, welche eine höhere Dichte aufweisen, bildeten das Zellsediment (s.Abb. 5-2). Dieser Zellring wurde vorsichtig abgenommen und zwei Mal bei 800 g bzw. 200 g für 10 min bei 8 °C mit RPMI 1640 Medium gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in Kulturmedium (s. 5.1.11.1) aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Ein Teil der Zellen wurde direkt in PeqGoldRNAPure® aufgenommen um RNA zu isolieren, die verbleibenden Zellen für die Zellkultur verwendet (s. 5.2.1.3). Abb. 5-2 Isolation von PBMCs aus Gesamtblut: Die PBMCs wurden unter Verwendung der Biocoll Seperating Solution und anschließender Dichtegradientzentrifugation aus dem Vollblut isoliert 75 Material und Methoden 5.2.1.3 Zellkultur der PBMCs Die isolierten PBMCs wurden zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in Zellkulturmedium (s. 5.1.11.1) aufgenommen. Die Zellkultur erfolgte in der 48-well Platte, wobei pro Well 5 x 105 Zellen ausgesät wurden. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 entweder für 24 h mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern oder für 48 h ohne weitere Stimuli kultiviert. Nach Ablauf der Stimulationszeit wurde die Zellkulturplatte bei 1500 rpm für 5 min zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für weitere Analysen bei -80 °C gelagert. Die Zellen wurden in PeqGoldRNAPure® (24 h Zellkultur) oder in QUIazol® Lysis Reagent (48 h Zellkultur) aufgenommen und bis zur Extraktion der RNA bei -80 °C gelagert. 5.2.1.4 Entnahme des Nasenabstrichs und Rhinovirusdetektion Der Nasopharynxabstrich wurde mit Hilfe eines Nylon-Flockfaser Abstrichtupfers (ESwabTM) in der Kinder- und Jugendklinik des Universitätsklinikums Erlangen entnommen. Dabei wurde der Tupfer in die Nasenöffnung eingeführt, bis ein Widerstand zu spüren war. Daraufhin wurde der Tupfer sanft rotiert, damit Sekret am Tupfer haften blieb. Vor der letztendlichen Entnahme des Tupfers wurde dieser noch an der Mucosa der Naris gerieben. Der Tupfer wurde anschließend im ESwab Medium unter Rotation ausgespült und die Flüssigkeit bis zu weiteren Untersuchungen bei -80 °C gelagert. Der Nachweis von Rhinoviren in den gewonnen Proben erfolgte am Virologischen Institut der Universität von Turku in Finnland. Dafür wurde unter Benutzung des easyMAg extractors entsprechend der Herstellerangaben aus 200 µl Probenmaterial Nukleinsäuren isoliert. Mittels PCR wurden, wie von Peltola et al. beschrieben, Enteroviren, Rhinoviren und Respiratorische-Synzytial-Viren detektiert (Peltola et al., 2008). Mittels Anyplex™ II RV16 Detection Kit wurden 16 verschiedenen respiratorischen Viren nachgewiesen: Adenovirus, Influenzavirus A und B, Parainfluenzavirus 1, 2, 3 und 4, Rhinovirus A, B und C, 76 Material und Methoden Respiratorischer-Synzytial-Virus A und B, Bocavirus 1, 2, 3 und 4, Coronavirus 229E, NL63 und OC43, Metapneumovirus und Enterovirus. Für die vorliegende Arbeit wurde berücksichtigt, welche Kinder positiv auf Rhinoviren getestet wurden. 5.2.2 Zellkultur mit der humanen Epithelzelllinie A549 Zellen der humanen Epithelzelllinie A549 wurden zunächst mit dem RV1b infiziert (s. 5.2.4). Nach Aufnahme der Zellen zu einer Konzentration von 1x106 Zellen/ml in Kulturmdium (s. 5.1.11.2), wurden diese in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an rIL-17A (s. 5.1.5) für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. 5.2.3 Murine Studien 5.2.3.1 Versuchstiere und Genotypisierung Für die Experimente der vorliegenden Arbeit wurden, je nach Versuchsptorokoll, 6 - 12 Wochen alte Wildtyp-(wt) Mäuse sowie IL-17A defiziente (IL-17A(-/-) bzw. IL-17A ko) Mäuse auf Balb/c Hintergrund verwendet. Die IL-17A(-/-) Mäuse wurden uns freundlicherweise von Yoichiro Iwakura, National Instiute of Animal Health, Tsukuba in Japan zur Verfügung gestellt. Um die IL-17A(-/-) Maus zu generieren, wurde das Exon 1 und 2 des IL-17 Gens durch eine Neomycin resistentes Gen ersetzt (Nakae et al., 2002). Die WildTyp Mäuse stammten aus der Zucht des Universitätsklinikums. Die Mäuse hatten stets freien Zugang zu Futter und Wasser und waren an ein spezifisches Frischluftventilationssystem angeschlossen. Der Genotyp der IL-17A(-/-) Mäuse wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt. Dazu wurden von den Mäusen Ohrbiopsien entnommen, in den detergenzienhaltigen Puffer (s. 5.1.11.3) überführt und zur Extraktion der DNA über Nacht 77 Material und Methoden bei 55°C verdaut. Die im Puffer enthaltene Proteinase K wurde durch Erhitzen (95°C, 5 min) deaktiviert, was einen Abbruch der enzymatischen Reaktion zur Folge hatte. Anschließend wurde die DNA in einer PCR mittels des Red Load Taq Master Mix und entsprechender Primer amplifiziert (s. Tabelle 5-8). Abschließend wurde das Endprodukt der PCR auf ein Agarose-Gel (1.5 %, s. 5.1.11.8) aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Anfärben des Gels mit dem DNA-interkalierenden Farbstoff GelRed® wurden die Banden unter UV-Licht analysiert. Bei 700 bp (Basenpaare) befindet sich im Gel die Wildtyp-Bande, bei 500 bp diejenige der IL-17A-defizienten Tiere. 5.2.3.2 Induktion des allergischen Asthma bronchiale Zur Induktion des allergischen Asthmas wurden die Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse entsprechend dem Behandlungsprotokoll an den Tagen 0 und 7 intraperitoneal (i. p.) mit 100 µg einer OVA/Alum (Ovalbumin/Aluminiumkaliumsulfat) -Suspension sensibilisiert (s. 5.1.3). Zur Herstellung dieser Suspension bedarf es zweier unterschiedlicher Komponenten. Zum einen wurden 5 mg OVA in 10 ml 0,9 % NaCl gelöst. Zum anderen wurde aus 1 g Aluminiumkaliumsulfat (Alum) und 10 ml Wasser (für Injektionszwecke) eine zweite Lösung hergestellt. Beide Lösungen wurden anschließend vereinigt und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, so dass es zur Komplexbildung kam. Nach 1h Inkubationszeit bei Raumtemperatur erfolgte ein Zentrifugationsschritt (5 min, 1500 rpm). Der Rückstand wurde anschließend ad 10 ml in 0,9 % NaCl resuspendiert. An den Tagen 18 - 20 des Versuchsprotokolls erfolgte die Allergenkonfrontation, indem die Mäuse intranasal (i. n.) mit 25 µl OVA-Lösung (2 µg/ml PBS) behandelt wurden. Für diesen Behandlungsschritt wurden die Mäuse zunächst mit Ketamin/Xylazin bzw. Isofluran sediert und anschließend die Lösung mit einer Pipette vorsichtig auf die Nase der Mäuse gegeben. Die Kontrollmäuse wurden nicht behandelt. Bei 78 Material und Methoden einigen Experimenten wurde an Tag 20 die AHR gemessen. An Tag 21 endete das Experiment (s. Abb. 5-3). Abb. 5-3 Behandlungsprotokoll zur Induktion des allergischen Asthmas 5.2.3.3 Induktion der Atemwegstoleranz Um eine Atemwegstoleranz zu induzieren, wurden die Mäuse zunächst an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit 25 µl OVA-Lösung (2 µg/ml PBS) i. n. behandelt. An Tag 12 des Experiments wurden die Mäuse i. p. mit 100 µg einer OVA/Alum -Suspension sensibilisiert (s. 5.2.3.2). An den Tagen 20 – 22 erfolgte die Allergenkonfrontation mit 25 µl OVA-Lösung (2 µg/ml PBS) i. n. Am 22. Tag des Experiments wurde die AHR gemessen. Das Experiment endete an Tag 23 des Versuchsprotokolls (s. Abb. 5-4). Abb. 5-4 Behandlungsprotokoll zur Induktion der Atemwegstoleranz 5.2.3.4 Messung des Atemwegswiderstandes Die Bestimmung der AHR gilt als wichtiges Kriterium um die Schwere einer allergischen Reaktion feststellen zu können. Im Asthmamodell erfolgte die Messung sowohl mittels eines 79 Material und Methoden nicht-invasiven Verfahrens mit einem Ganzkörperplethysmographen bzw. mit Hilfe einer invasiven Methode an Tag 20 des Versuchsprotokolls etwa zwei Stunden nach der letzten Allergenkonfrontation. Im Toleranzmodell wurde die AHR mit Hilfe der nicht-invasiven Methode an Tag 22 bestimmt. Bei dem nicht-invasiven Verfahren wurden die Mäuse in die Kammern des Ganzkörperplethysmographen gesetzt und steigenden Dosen (12,5; 25; 50, 100 mg/ml) des Bronchokonstriktums MCh (Methacholin) ausgesetzt, welches als vernebeltes Aerosol in die Kammer einströmte. Der Atemwegswiderstand wird als Penh (pause enhanced) angegeben. Dabei handelt es sich um einen Parameter der veränderten Atemwegsfunktion. Dieser errechnet sich aus der Exspirationszeit (Zeit in der 65 % des Volumens ausgeatmet werden) und dem Quotienten aus der maximalen Exspirationshöhe (PEF) und der maximalen Inspirationshöhe (PIF, s. Abb. 5-5 und Formel 5-1). Nach Gabe des Methacholins kommt es zu einem deutlichen Anstieg der Penh, welcher bei Asthmatikern bzw. allergenkonfrontierten Mäusen deutlich stärker ausfällt als bei Kontrollen (s. Abb. 5-5). Abb. 5-5 Diagramm zum Verlauf der Atmung (nach www.buxco.com): Te = Expirationszeit; Rt = Zeit, um 65 % des Volumens auszuatmen; PEF = Peak Expiratory Flow; PIF = Peak Inspiratory Flow 80 Material und Methoden Formel 5-1 Berechnung der Penh: Te = Expirationszeit; Rt = Zeit, um 65 % des Volumens auszuatmen; PEF = Peak Expiratory Flow; PIF = Peak Inspiratory Flow Die invasive Lungenfunktionsmessung wurde mit einem computerkontrollierten Kleintier-Kolben-Respirator (flexiVentTM) durchgeführt. Die Mäuse wurden zunächst mit Pentobarbital narkotisiert. Anschließend wurde die Trachea freipräpariert, mit einem waagrechten Schnitt zwischen zwei Knorpelspangen geöffnet, ein Trachealtubus eingeführt und mit einem Faden fixiert. Daraufhin wurde der Tubus mit dem Endotrachealschlauch des flexiVentTM verbunden. Mit diesem Respirator wurden die Mäuse mechanisch beatmet und die Parameter der Atemwegsmechanik gemessen. Mittels Verneblers wurde zunächst PBS aerosolisiert, welches als Basiswert diente. Zur Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve wurden daraufhin 12.5, 25 und 50 mg/ml Methacholin in PBS vernebelt. Nach jeder Dosis wurde der Atemwegswiderstand (Respiratory System Resistance, Rrs) erfasst. Dieser errechnet sich aus dem Vergleich des pulmonalen Drucks und des Körperdrucks (Rrs[cm H2O sek/ml]). Pro Dosis wurden 12 Einzelmessungen durchgeführt. Die je 12 Messwerte aller Tiere einer Gruppe (z. B. PBS) wurden zusammengefasst und daraus der Mittelwert gebildet. 5.2.3.5 Gewinnung und Analyse der Bronchoalveolären Lavage (BAL) An Tag 21 (Asthmamodell) bzw. an Tag 23 (Toleranzmodell), 24 Stunden nach der letzten Allergenkonfrontation bzw. nach der invasiven Messung der AHR (Tag 20), wurden die Mäuse entweder unter Verwendung von Ketamin / Xylazin sediert und anschließend durch zervikale Dislokation getötet oder mittels Release eingeschläfert. Die Bronchoalveoläre Lavage wurde nach einem standartisierten Protokoll durchgeführt (Maxeiner et al., 2007). Dazu wurde zunächst die Trachea freigelegt, um die Mäuse anschließend intubieren zu 81 Material und Methoden können. Unter Verwendung von je 800 µl Sterofundin wurde die Lunge zwei Mal lavagiert. Die so erhaltene BAL-Flüssigkeit (BALF) wurde bei 1500 rpm für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand abgenommen und für weitere Zytokinanalysen mittels ELISA bei -20 °C gelagert. Das Zellpellet wurde in 1ml PBS resuspendiert und die Zellzahl bestimmt. Daraufhin erfolgte eine durchflusszytometrische Analyse der BAL-Zellen. Hierzu wurden 5 x 105 Zellen mit Antikörpern gegen CD3, CD45R, GR-1 und CCR3 für 30 min inkubiert und anschließend analysiert. 5.2.3.6 Organpräperation Am Ende des Experiments wurden die Mäuse entweder nach vorheriger Narkotisierung durch zervikale Dislokation getötet oder mittels Release eingeschläfert. Unter sterilen Bedingungen und nach Öffnen des Brustkorbes erfolgte die Entnahme der Lunge. Für histologische Untersuchungen wurde ein Teil der Lunge in einer 4 % Formaldehyd Lösung fixiert. Ein weiteres Stück der Lunge wurde entnommen und bei -80 °C gelagert, um später daraus RNA zu isolieren. Die verbleibende Lunge wurde für die Gesamtzellisolation verwendet. Bei einigen Versuchen erfolgte die Entnahme der Lymphknoten der Axillarregion, um ebenfalls Gesamtzellen zu isolieren. Bei einigen Versuchen wurde auch die Milz entnommen, indem die linke Flanke geöffnet wurde. Nach Entnahme der Organe wurde das Blut, welches sich in der Körperhöhle angesammelt hat, mittels einer Spritze aufgenommen. Nach Koagulation erfolgte ein Zentrifugationsschritt bei 1500 rpm für 30 min bei 20 °C. Das so erhaltene Serum wurde abgenommen und bis zu weiteren Analysen bei -20 °C gelagert. 82 Material und Methoden 5.2.3.7 Gesamtzellisolation aus Lunge, Milz und Lymphknoten Die Isolation der Gesamtzellen aus dem Lungengewebe bzw. aus der Milz erfolgte nach einem in unserer Arbeitsgruppe etablierten und standardisierten Protokoll (Sauer et al., 2007). Das Lungengewebe enthält viel Kollagen, in welches die Zellen eingebettet sind. Daher war zunächst ein Verdau des Kollagens nötig. Dazu wurde die Lunge in eine Petrischale überführt, mit Hilfe eines Skalpells in kleine Stücke geschnitten und anschließend in einer Kollagenase/DNase-Lösung (s. 5.1.11.4) 45 min bei 37 °C unter ständigem horizontalem Schütteln verdaut. Dieser erste Schritt war bei der Milz nicht nötig. Sie wurde, ähnlich wie die verdaute Lunge, sofort mittels des Stempels einer Spritze durch ein Zellsieb der Porengröße 40 µm in ein 50 ml Röhrchen gedrückt, um so die Zellen zu vereinzeln. Nach einem Zentrifugationsschritt (1500 rpm, 10 min, 4 °C) wurde der Überstand verworfen und das Zellpellet in 10 ml ACK-Lyse Puffer (s. 5.1.11.4) 2 min bei Raumtemperatur inkubiert, um so die Erythrozyten zu lysieren. Nach erneuter Zentrifugation (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und Verwerfen des Überstandes erfolgte ein Waschschritt mit 10 ml PBS, um störendes Fett abzutrennen. Nach einer abschließenden Zentrifugation (1500 rpm, 5 min, 4 °C) wurde der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 10 ml PBS aufgenommen und die Zellzahl mittels Trypanblau und einer Neubauerkammer bestimmt. Um die Gesamtzellen aus den Lymphknoten zu isolieren, mussten diese zunächst durch ein Zellsieb der Porengröße 40 µm gedrückt werden. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C), der Überstand verworfen und die Zellen in 3 ml PBS aufgenommen, um sie anschließend zu zählen. 5.2.3.8 Isolation der CD4+ T-Zellen und CD11c+ T-Zellen Die Isolation der verschiedenen Zellpopulationen aus den Gesamtzellen der Lunge bzw. Milz erfolgte mit Hilfe magnetischer Zellseperation der Firma Miltenyi Biotec (MACS ®: Magnetic 83 Material und Methoden activated cells sorting). Das Prinzip der Zellseperation beruht darauf, dass die zu isolierenden Zellen mit einem Oberflächenmarker-spezifischen Antikörper, an den ein Magnet gekoppelt ist („Bead“), markiert werden. Die Aufreinigung erfolgt über Säulen, die sich in einem magnetischen Feld befinden. Für die Isolation wurde die Zellsuspension auf die Säulen gegeben. Die unmarkierten Zellen passierten die Säule (negative Zellfraktion), wohingegen die mit magnetischen Beads behafteten Zellen im Magnetfeld und somit auf der Säule verblieben. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Säulen mit der gewünschten positiven Zellfraktion aus dem Magnetfeld entfernt, um anschließend die Zellen von der Säule zu eluieren. Um CD4+ T-Zellen aus der Lunge und der Milz bzw. CD11c+ T-Zellen aus den Gesamtzellen der Lunge zu isolieren, wurden die Zellen zunächst in MACS-Puffer (s. 5.1.11.4) aufgenommen (CD4+ T-Zellen: 90 µl Puffer/107 Zellen; CD11c+ T-Zellen: 400 µl Puffer/108 Zellen). Anschließend gab man die magnetischen Beads hinzu (CD4+ T-Zellen: 10 µl Beads/107 Zellen; CD11c+ T-Zellen: 100 µl Beads/108 Zellen) und inkubierte die Zellen für 15 min bei 4 °C. Die Reaktion wurde durch Zugabe von MACS-Puffer (1-2 ml/107 Zellen) abgestoppt und die Zellsuspension daraufhin zentrifugiert (300 g, 10 min, 4 °C). In der Zwischenzeit wurden die MACS-Säulen in der MACS-Vorrichtung befestigt und mit MACS-Puffer äquilibriert. Nach dem Zentrifugationsschritt wurde der Überstand verworfen und die Zellen in 500 µl MACS-Puffer pro 108 Zellen aufgenommen und anschließend auf die Säule gegeben. Daraufhin wurden die Säulen dreimal mit je 500 µl MACS-Puffer gespült. Der so erhaltene Durchfluss enthielt die unmarkierte negative Zellfraktion. Nach den erfolgten Waschschritten wurden die Säulen aus dem Magnetfeld enfternt und die Zellen mit 1 ml Puffer in ein frisches 15 ml Röhrchen eluiert. 84 Material und Methoden 5.2.3.9 Zellkultur der isolierten CD4+ und CD11c+ Lungenzellen Die isolierten Gesamtzellen bzw. Zellpopulationen wurden zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in Zellkulturmedium (s. 3.1.10.3) aufgenommen und ausgesät. Mittels antiCD3 und anti-CD28 Antikörper wurden die T-Zellen während der Kultur stimuliert, damit diese Zytokine produzierten und freisetzten. Dafür wurde die Zellkulturplatte zuvor mit 2 µg/ml anti-CD3 in 0,5 M NaHCO3 beschichtet (s. 3.1.10.3), eine Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert und abschließend mit PBS gewaschen. Anti-CD28 (2 µl/ml Medium) wurde in löslicher Form direkt dem Zellkulturmedium zugesetzt. Die Zellen wurden für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Nach der Inkubationszeit wurde das Medium abgenommen und bei -20 °C bis zu weiteren Analysen gelagert. Die Zellen wurden in PeqGoldRNAPureTM zur späteren RNA-Extraktion geerntet und bei -80 °C aufbewahrt. 5.2.3.10 Transfektion der CD4+ T-Zellen der Milz mit Il-17a siRNA Wie in Kapitel 5.2.3.8 beschrieben, wurden aus den Gesamtzellen der Milz CD4+ TLymphozyten aufgereinigt. Anschließend wurden die Zellen kultiviert, um sie dann für die Transfektion mit Il-17a siRNA (small interfering RNA) zu verwenden. Die Zellen wurden jeweils zu einer Konzentration von 1 Millionen Zellen/ml in Kulturmedium 5.1.11.4 aufgenommen und entweder mit IL-6 oder unter sogenannten Th17-skewing Bedingungen kultiviert. Für die Kultur mit IL-6 wurden die Zellen in Anwesenheit von rIL-6 (20 ng/ml) für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Für das Th17-skewing der CD4+ T-Zellen der Milz wurde zunächst eine Zellkulturplatte mit CD3 (2 µg/ml) beschichtet und daraufhin die Zellen mit IL-4 (10 µg/ml), IFN- (10 µg/ml), CD28 (2 µg/ml), TGF- (2 ng/ml) und IL-6 (20 µg/ml) in Kulturmedium (s. 5.1.11.4) für drei Tage kultiviert. Anschließend wurden die Zellen gesplittet und neues Medium mit CD28 (2 µg/ml) zugesetzt und für weitere zwei Tage bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach der jeweiligen Kultur wurden die Überstände 85 Material und Methoden abgenommen und bei -20 °C aufbewahrt, wohingegen die Zellen für die Transfektion benutzt wurden. Bei der siRNA handelt es sich um kurze, doppelsträngige Ribonukleinsäure-Moleküle von 20 – 25 bp Länge. Sie kodieren nicht für ein Protein, sondern unterdrücken die Expression von Genen. Dazu wird die siRNA in die Zellen (Transfektion) eingebracht, wo sie an einen zellulären Endonukleasekomplex, RISC (RNA-induced silencing complex) binden, was zu einer Trennung der siRNA Stränge führt. Der Antisense Strang bindet daraufhin im RISC an seine komplementäre mRNA, woraufhin diese mRNA durch Nucleasen im RISC hydrolisiert wird. Somit sinken die mRNA-Spiegel und zeitlich versetzt auch die Konzentrationen des entsprechenden Proteins (Fire et al., 1998; Schütt and Bröker, 2009). Für die Transfektion der CD4+ T-Zellen wurde eine Il-17a siRNA verwendet. Bei der verwendeten Il-17a siRNA handelte es sich um ein sogenanntes „Set of 4“. Das bedeutet, dass zunächst vier verschiedene siRNA Sequenzen zur Verfügung standen, aus denen durch Vorversuche die am besten geeignetste ermittelt wurde. Die Il-17a siRNA wurde unter Verwendung der 4D-NucleofectorTM X Unit und unter Zuhilfenahme des AmaxaTM 4D-NucleofectorTM Protokolls für murine T-Zellen (Lonza) gemäß Herstellerangaben in die Zellen eingeschleust. Dazu wurden die Zellen nach der Kultur geerntet, die Zellzahl ermittelt und die benötigte Anzahl an Zellen abgenommen und zentrifugiert (10 min, 90 g, RT). Nach Verwerfen des Überstandes und Aufnahme in 4D-NucleofectorTM Lösung, wurden die Zellen in die Vertiefungen der NucleocuvetteTM überführt. Nach Zugabe der Il-17a siRNA (150nM), pmaxGFPTM (green fluorescent protein) oder beide in Kombination, wurde die NucleocuvetteTM in der 4D-NucleofectorTM X Unit platziert und die siRNA mittels eines spezifischen Pulses in die Zellen eingeschleust. Als Kontrolle diente eine Kondition, bei der der Puls fehlte. Als weitere Kontrolle dienten unbehandelte Zellen, welche auch nicht in der 4D-NucleofectorTM X Unit waren. Nach 24 h Zellkultur wurden die Überstände abgenommen, 86 Material und Methoden um sie bis zu weiteren Analysen aufzubewahren. Die Zellen wurden geerntet und bei -80 °C für weitere Analysen gelagert. 5.2.3.11 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark Für die Isolation des Knochenmarks wurden die Mäuse zunächst nach vorheriger Narkotisierung durch zervikale Dislokation getötet oder mittels Release® eingeschläfert. Die weiteren Arbeitsschritte erfolgten unter sterilen Bedingungen. Die Hinterbeine wurden zunächst oberhalb des Hüftgelenks abgetrennt, so dass der Knochen geschlossen blieb und anschließend wurden die Knochen freigelegt. Daraufhin erfolgte die Trennung des Ober- und Unterschenkelknochens, indem das Bein vorsichtig entgegen der Beugerichtung gebogen wurde. Zur Desinfektion wurden die einzelnen Knochen für 3 – 5 min in eine Petrischale mit 70 % Ethanol gelegt und anschließend in eine Petrischale mit PBS überführt. Der jeweilige Knochen wurde am oberen und unteren Ende mit Hilfe einer Schere geöffnet. Mittels einer sterilen 10 ml Spritze, einer Kanüle und sterilem PBS wurde das Knochenmark aus dem Knochen in ein steriles 50 ml Röhrchen gespült, bis der Knochen statt einer rötlichen eine weiße Färbung aufwies. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C), die Zellen in 10 ml Kulturmedium (s. 5.1.11.6) aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Danach wurde die Zellsuspension in eine 10 ml Zellkulturflasche überführt und die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für vier Wochen kultiviert. Während dieser Zeit wurden die Zellen einmal pro Woche mit neuem Kulturmedium versorgt und in diesem Zuge auch gezählt. Nachdem mittels Durchlusszytometrie festgestellt wurde, dass mindestens 85 % der Zellen c-kit und FcεRI positiv waren, wurden die Zellen für weitere Experimente verwendet. 87 Material und Methoden 5.2.3.12 Histamin-Release Um das Histamin aus den Mastzellen freizusetzen, wurde ein sogenannter „Histamin-Relase“ durchgführt. Dazu wurden die generierten Mastzellen zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml in 1 ml warmen (37 °C) Tyord´s Puffer (s. 5.1.11.7) aufgenommen und für 5 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 0,66 µl PMA (Phorbol-12-myristate-13-acetate) und 0,5 µl Ionomycin zugegeben und für weitere 10 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml kaltem Tyrod´s Puffer abgestoppt und die Zellsuspension anschließend bei 200 g und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und das Zellpellet in 3 ml Tyrod´s Puffer resuspendiert. Dann wurde das Probenmaterial im Wasserbad gekocht und anschließend bei -20 °C gelagert. 5.2.4 Infektion von Zellen mit dem Rhinovirus 1b Für einige Experimente wurden humane A549 Zellen bzw. murine Zellen mit dem Rhinovirus 1b (RV1b, s. 5.1.10) infiziert. Um die isolierten Zellen zu infizieren, wurden diese 1 h bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit dem RV1b (500 µl Virussuspension/1x106 Zellen) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von Medium gewaschen, zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und zu einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml im Zellkulturmedium (s. 5.1.11.2; 5.1.11.4) aufgenommen. Anschließend wurden die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. 5.2.5 Rhinovirus PCR Um den Nachweis zu erbringen, dass die Infektion der Zellen mit dem RV1b erfolgreich war, wurde eine PCR durchgeführt. Dazu wurde zuerst RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben 88 Material und Methoden (s. 5.2.6 und 5.2.8). Daraufhin wurde die PCR dann in Anlehnung an vorherige Publikationen (Papadopoulos et al., 2000; Tuthill et al., 2003) durchgeführt. Dazu wurden 2 µl cDNA, je 0,5 µl Primer, 4,5 µl DEPC-Wasser und 12,5 µl KAPA2G Fast Ready Mix eingesetzt. Die Primer OL 26 und OL 27 (s. 5.1.8) sind komplementär zu der Antisense-RNA in den Positionen 542-557 und 169-185 in der 5´-nicht-kodierenden Region des RV1b. Die PCR verlief über 32 Zyklen und begann mit der Denaturierung bei 94 °C für 30 sek gefolgt von der Primerhybridisierung (primer annealing) bei 50 °C für 30 sek und der Elongation bei 72 °C für 2 min und einem post-PCR-Extending Schritt bei 72 °C für 4 min. So entstand ein 380 bp schweres Amplikon, welches mit Hilfe des QIAxcel Advanced Systems analysiert und quantifiziert wurde. 5.2.6 RNA-Extraktion Die RNA-Isolation aus dem Probenmaterial beruhte auf der Phenol-Chlorofom ExtraktionsTechnik. Die Zellen wurden entweder direkt nach der Isolation oder nach Beendigung der Zellkultur in PeqGoldRNAPureTM oder in QUIazol® Lysis Reagent (PBMCs nach 48 h Kultur) aufgenommen. Das Lungengewebe wurde vor der eigentlichen RNA-Extraktion zunächst in 1 ml PeqGoldRNAPureTM homogenisiert. Die Isolation der RNA aus Zellen und Gewebe erfolgte bei beiden verwendeten Reagenzien nach demselben Protokoll. Zunächst musste das Probenmaterial im jeweiligen Lysereagenz für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, wodurch es zur Dissoziation der Nukleotidkomplexe kam. Anschließend wurde Chloroform hinzugegeben und das Probenmaterial nach der Homogenisierung für 3 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Zentrifugation (12 000 g, 5 min, 4 °C) kam es zur Phasentrennung. In der unteren organischen Phenol-Chloroform-Phase und in der Interphase befinden sich DNA und Proteine, wohingegen in der oberen wässrigen Phase die RNA vorliegt. Die wässrige Phase wurde vorsichtig abdekantiert, in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert und 89 Material und Methoden nochmals mit Chloroform homogenisiert, um die Effizienz und Reinheit der Extraktion zu steigern. Die Proben wurden nochmals zentrifugiert (12 000 g, 5 min, 4 °C), was zur erneuten Phasentrennung führte. Die obere wässrige Phase wurde wiederum abgenommen. Durch Zugabe von Isopropanol und Glykogen (10 mg/ml) kam es zur Präzipitation der RNA. Nach Mischen der Proben wurden diese für 15 min bei 4°C inkubiert und anschließend zentrifugiert (12 000 g, 10 min, 4 °C), wodurch die RNA pelletierte. Das Pellet wurde zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen und anschließend an der Luft zu getrocknet. Abschließend wurde die RNA in 20 µl Nuklease-freiem Wasser aufgenommen und bei 65 °C gelöst. Unter Verwendung von 1 µl Probenmaterial erfolgte die Bestimmung der RNA-Konzentration mittels Nanodrop®-Spektrophotometer. 5.2.7 Microarray Die aus murinem Lungengewebe isolierten CD4+ T-Zellen wurden mittels Microarray analysiert. Microarrays dienen der RNA-Expressionsanalytik. Dazu werden Tausende von Genen, welche durch Oligonukleotide repräsentiert werden, in einer definierten Anordnung (array) als mikroskopisch kleine Punkte an Glasobjektträger gekoppelt. Die Oligonukleotide dienen als zur Probe komplementäre „Fängermoleküle“. Für die Analyse wurde der GeneChip® Mouse Gene 1.0 ST Array der Firma Affymetrix verwendet und laut Herstellerangaben durchgeführt. Zunächst wurde die Qualität der zu untersuchenden mRNA überprüft und anschließend in cDNA umgeschrieben. Nach einem Aufreinigungsschritt erfolgte eine in vitro Transkription, bei der biotinylierte cRNA produziert wurde. Die Biotinylierung ermöglicht die spätere Detektion mittels Floureszenzmarker. Danach wurden die cRNA-Ketten hydrolisiert un zu einem Hybridisierungscocktail hinzugefügt und auf den Genchip aufgetragen. Bei dem Hybridisierungsschritt gehen zueinanderpassende Moleküle eine Bindung ein. Danach wurde die Platte gewaschen und unspezifisch gebundene Moleküle 90 Material und Methoden entfernt. Um anschließend die Bindungen sichtbar zu machen, wurde mit einem Fluoreszenzmarker gefärbt. Mit einem Scanner wurde das Fluoreszenzsignal für jeden Punkt des Microarrays detektiert. Anhand des Fluoreszenzsignals kann die Menge der gebunden Probe ermittelt und somit die Expressionswerte der verschiedenen Gene bestimmt werden. Die erhaltenen Daten des Arrays wurden als sogenannte Heatmap dargestellt. Die Analyse des Probenmaterials sowie die Auswertung der Genexpressionsprofile erfolgte in freundlicher Kollaboration mit Dr. Arif Ekici und Dr. Fulvia Ferrazzi, Institut für Humangenetik, Universitätsklinikum Erlangen. 5.2.8 cDNA-Synthese Für die Synthese der cDNA (complementary DNA) wurden 100 – 1000 ng Gesamt-RNA eingesetzt. Dazu wurde das entsprechende Volumen RNA abgenommen und mit DEPC-Wasser auf 11 µl verdünnt. Es folgte die Zugabe von 5 x Reaktionspuffer, 1 mM dNTPs, 200 U RevertAidTM Reverse Trankskriptase , 20 U RiboLockTM RNase Inhibitor und 0,5 µg Random Hexamer Primer, so dass sich ein Endvolumen von 20 µl ergab. Daraufhin schloss sich eine Inkubation von 5 min bei 25 °C an, um die Primer zu aktivieren. Die eigentliche cDNA-Synthese fand bei 42 °C für eine Stunde statt, der optimalen Temperatur für die Aktivität der Reversen Transkriptase. Durch fünfminütige Denaturierung der Reversen Transkriptase bei 70 °C wurde die Reaktion terminiert. Die cDNA wurde zu einer Endkonzentration von 5 ng/µl mit DEPC-Wasser verdünnt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. 91 Material und Methoden 5.2.9 Quantitative real-time PCR (qPCR) Die quantitative real-time PCR (qPCR) ermöglicht es, gemäß den Prinzipien einer PCR, Nukleinsäuren zu vervielfältigen und diese in Echtzeit mittels einer Fluoreszensmessung nach jedem Zyklus zu quantifizieren. Der Floureszenzfarbstoff, z. B. SYBR ®-Green, interkaliert mit der doppelsträngigen DNA und flouresziert. Somit ist die Floureszenzintensität einer Probe direkt proportional zu ihrem Gehalt an doppelsträngiger DNA. Die Quantifizierung der DNA wird in der exponentiellen Phase der PCR durchgeführt. Das Gerät ermittelt dabei den sogenannten Schwellenwert-Zyklus (Ct = threshold cycle). Dabei handelt es sich um den PCR-Zyklus, bei dem sich die Floureszenzintensität stark von der Hintergrundfluoreszenz unterscheidet und einen bestimmten Schwellenwert erreicht hat. Um zu gewährleisten, dass nur das gewünschte PCR-Produkt amplifiziert wurde und keine anderen PCR-Produkte oder Primer-Dimere, wird nach dem letzten Zyklus eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dazu wird die Temperatur kontinuierlich von 50 °C auf 95 °C erhöht, woraufhin die DNA aufgeschmolzen wird. Bei einer für das Fragment spezifischen Temperatur denaturiert die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge und setzt den Floureszenzfarbstoff frei. Die Floureszenzintensität nimmt somit ab und kann detektiert werden. Da das spezifische PCR-Produkt eine höhere Schmelztemperatur als Primer-Dimere oder ungewünschte PCR-Produkte aufweist, dient die Schmelzkurvenanalyse als Qualitätskontrolle. Für die vorliegende Arbeit wurde mit dem Gerät CFX96 der Firma Bio-RAD sowie mit dem Floureszenzfarbstoff-enthaltenden SsoFast™ EvaGreen® Supermix gearbeitet. In eine 96 well Platte wurden zunächst 17 µl eines Mastermixes bestehend aus 10 µl SsoFast™ EvaGreen® Supermix und Primern (125 pmol/ml) vorgelegt. Anschließend wurde 3 µl cDNA hinzugegeben. Die Analyse des Probenmaterials erfolgte immer im Duplikat. In Tabelle 5-10 sind die Sequenzen der verwendeten humanen und murinen Oligomere aufgelistet. Die PCR setzte sich aus 50 Zyklen zusammen. Dabei wurde die Polymerase zu Beginn bei 98 °C für 92 Material und Methoden 2 min aktiviert. Daran schloss sich die Denaturierung (95 °C, 5 sek), sowie die Hybridisierung und Elongation bei 60 °C für 10 min an. Als Referenzgen (Housekeeping gene) diente die HPRT (Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase), ein nicht-reguliertes Gen, welches unabhängig von Zelltyp, Zellstadium und äußeren Einflüssen ubiquitär exprimiert wird. Für die Quantifizierung wurde die ΔΔCt-Methode (s. Formel 5-2) herangezogen, bei der die n-fache Expression berechnet wird. Hierfür wurde der Ct-Wert benötigt, welcher von der CDX96 Software ermittelt wurde. Der Ct-Wert des Zielgens wurde zunächst auf den Ct-Wert des Referenzgenes bezogen (ΔCt-Wert). Anschließend wurde aus den ΔCt-Werten der Bezugsgruppe (z. B. Wild-Typ PBS Mäuse bzw. gesunde Kontrollkinder) der Mittelwert berechnet. Dieser Mittelwert wurde anschließend vom ΔCt-Wert jeder einzelner Probe subtrahiert. Dies ergab den ΔΔCt-Wert. Abschließend wurde die Expression (E) berechnet. Formel 5-2 ∆∆Ct Methode zur Berechnung der relativen Quantifizierung 5.2.10 Durchflusszytometrie Bei der Durchlusszytometrie handelt es sich um ein Verfahren, bei dem Oberflächenmoleküle und intrazelluläre Proteine quantitativ bestimmt werden. Das Prinzip beruht auf einer Antigen/Antikörper-Reaktion. Dazu werden die Zellen mit Floureszenzfarbstoff-markierten spezifischen Antikörpern gefärbt. Die Zellen liegen als Suspension vor und werden im Durchflusszytometer vereinzelt. So gelangen sie in die Durchflusszelle, in der sie durch Laserlicht angeregt werden. Das dabei erzeugte Streu- und Floureszenzlicht wird separat detektiert. Beim Streulicht unterscheidet man Vorwärtsstreulicht (FSC = Forward Scatter) welches Aufschluss über das Volumen der Zelle gibt, sowie das Seitwärtsstreulicht (SSC = Side Scatter), welches Rückschlüsse auf die Granularität, Größe und Struktur der Zelle 93 Material und Methoden zulässt. Wenn die Floureszenz-markierten Zellen den Laser passieren, werden die Flourochrome der auf den Zellen gebundenen Antikörper angeregt und emittieren Licht charakteristischer Wellenlänge. Dieses Emissionssignal wird detektiert und ist direkt proportional zur Menge des gebundenen Antikörpers. Da gleichzeitige Mehrfachfärbungen möglich sind und die Zellen so innerhalb kürzester Zeit analysiert werden können, gilt die Durchlusszytometrie als multiparametrisches Analyseverfahren, mit der Zellen charakterisiert werden können. Die Messungen erfolgten mit dem FACS-CaliburTM der Firma BD Bioscience. Das Gerät verfügt über einen Argon Laser (488 nm) und eine rote Laserdiode (̴ 635 nm). Das emittierte Licht wird über die Detektoren FL 1-4 erfasst. In Tabelle 5-12 sind die verwendeten Flourochrome mit den dazu passenden Detektoren angegeben. Die Messung wurde über die Software BD CellQuestTM Pro gesteuert und mittels der Software FlowJo (Treestar, Can Carlos, USA) ausgewertet. Flourochrom Alexa 488 FITC PE PerCP PerCP/Cy5.5 Alexa 647 APC Detektor FL-1 FL-1 FL-2 FL-3 FL-3 FL-4 FL-4 Tabelle 5-12 Übersicht über verwendete Flourochrome und deren Detektoren Je nachdem, ob sich das nachzuweisende Antigen auf der Zelloberfläche befindet oder in der Zelle exprimiert wird, unterscheidet man zwischen der Oberflächen- und der intrazellulären Färbung. 94 Material und Methoden 5.2.10.1 Oberflächenfärbung Um Oberflächenmarker anzufärben, wurden 5 x 105 Zellen verwendet und mit einem Färbemix aus PBS und dem jeweiligen Antikörper für 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubiert. Um die Reaktion abzustoppen und ungebundenen Antikörper zu entfernen, wurde 200 µl PBS hinzugegeben und die Zellsuspension (1500 rpm, 5 min, 4 °C) zentrifugiert. Abschließend wurden die Zellen in 200 µl PBS aufgenommen und im Durchflusszytometer analysiert. Falls die Messung nicht direkt erfolgen konnte, wurden die Zellen in 2 % Paraformaldehyd fixiert und bei 4 °C im Dunkeln gelagert. 5.2.10.2 Intrazelluläre Färbung Für die intrazelluläre Färbung wurden 1 x 106 Zellen verwendet. Zunächst wurden, wie vorher beschrieben, die Oberflächenmoleküle markiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und fixiert. Dazu wurden die Zellen in 100 µl Permfix-Lösung (1:4 verdünnt, eBioscience) aufgenommen und bei 4 °C für 35 min inkubiert. Nach der Zentrifugation (1500 rpm, 5 min, 4°C) erfolgte die Permeabilisierung der Zellmembranen. Hierfür wurde 50 µl Permash-Lösung (1:10 verdünnt, eBioscience) zu den Zellen gegeben, welche den gelösten intrazellulären Antikörper enthielt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 4 °C im Dunkeln wurde die Reaktion durch Zugabe von 200 µl Permwasch-Lösung abgestoppt, die Zellsuspension zentrifugiert (1500 rpm, 5 min, 4 °C) und die Zellen abschließend in 200 µl PBS resuspendiert und im Durchflusszytometer analysiert. Zusätzlich zu der Oberflächenbzw. intrazellulären Färbung wurden Einzelfärbungen mitgeführt, um das Gerät vor der Messung optimal einstellen zu können. 95 Material und Methoden 5.2.11 Enzyme linked Immunosorbent Assay Der ELISA (enzyme linked Immunosorbent Assay) wurde für die Quantifizierung von Zytokinen in murinen und humanen Zellkulturüberstanden bzw. BALF, sowie von Immunglobulinen aus dem Serum benutzt. Außerdem wurde die Konzentration an Histamin in Zellkulturüberständen detektiert. Die Basis dieser Methode bildet eine Antigen/AntikörperReaktion, wobei in der vorliegenden Arbeit in der Regel sogenannte „Sandwich-ELISAs“ verwendet wurden, bei dem das nachzuweisende Antigen am Ende gebunden zwischen zwei Antikörpern vorliegt, an die das Enzym Meerretichperoxidase (=horse-radish-peroxidase, HRP) gekoppelt wird. Durch die Zugabe des Substrats TMB (Tetramethylbenzidin) kommt es zu einer Farbreaktion, über die der Gehalt an Antigen bestimmt werden kann. Die verwendeten ELISAs lagen als Fertigsysteme vor und wurden gemäß Herstellerangaben durchgeführt. Zunächst erfolgte die Kopplung des Fängerantikörpers (Captur-Antikörper), welcher spezifisch für das zu analysierende Antigen ist, an eine feste Phase, d. h. die Plastikoberfläche der Kavitäten einer 96 well Platte. Dies geschah über Nacht, wobei der Capture-Antikörper gelöst in einem Capture-Puffer (Carbonatpuffer oder Phosphatpuffer, s. 5.1.11.5) vorlag. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Waschpuffer (s. 5.1.11.5) gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Anschließend wurden für eine Stunde mit BSAoder FCS-haltigen Puffer freie Proteinbindungsstellen geblockt, um unspezifische Signale zu reduzieren. Daraufhin erfolgte ein erneuter Waschschritt, um dann die Antigen-haltigen Proben aufzutragen. Es bildeten sich nun Antigen/Antikörper-Komplexe. Zusätzlich wurde eine genau definierte Standardreihe des zu detektierenden Antigens aufgetragen. Nach Ablauf der zweistündigen Inkubationszeit wurde die Platte gewaschen, um überschüssige Antigene zu entfernen. Im nachfolgenden Schritt gab man einen biotinylierten Zweitantikörper (Detection-Antikörper) zu und inkubierte die Platte für 1 h bei Raumtemperatur. Hierbei ist es wichtig, dass dieser Antikörper ein anderes Epitop des Zielmoleküls erkennt als der 96 Material und Methoden Fängerantikörper. Je nach verwendetem Protokoll wurde die an Streptavidin gebundene HRP gleichzeitig oder in einem anschließenden Inkubationsschritt zugegeben. Dieses bindet an die biotinylierten Antikörper, sodass es zur Bildung eins Sandwich-Komplexes kam. Nach erneutem Waschen wurde eine TMB-Substratlösung (s. 5.1.11.5) auf die Platte gegeben. Die HRP oxidiert das TMB, wodurch ein blaues Produkt entsteht. Die Blaufärbung korreliert dabei positiv mit der Menge des zu untersuchenden Antigens. Die Reaktion wurde nach ca. 10 min durch Zugabe 30 % H2SO4 abgestoppt, was einen Farbumschlag von blau nach gelb zur Folge hatte. Die Absorption dieses Reaktionsproduktes wurde anschließend mittels eines Photometers bei 450 nm ermittelt. Unter Berücksichtigung der Standardverdünnungsreihe konnte die in den Proben enthaltene Antigen-Konzentration bestimmt werden. Bestimmung der Lactat-Dehydrogenase Aktivität in Zellkulturüberständen Die LDH (Lactat-Dehydrogenase) ist eine Oxidoreduktase und spielt innerhalb des anaeroben Stoffwechsels eine wichtige Rolle, da sie die Bildung von Lactat und NAD+ (Nicotinamidadenindinukleotid) aus Pyruvat und NADH katalysiert. Dieses Enzym ist sehr stabil und kommt in den Zellen nahezu aller Lebewesen vor. Zellen setzen die LDH z. B. nach Verletzungen des Gewebes in die Blutlaufbahn frei. Deshalb wird die LDH Aktivität dazu genutzt, eine Beschädigung des Gewebes nachzuweisen. Bei dem verwendetem LDH Assay Kit wird NAD+ durch die LDH zu NADH reduziert, wobei es zusammen mit einem im Substrat enthaltenen Bestandteil zu einem Farbumschlag kommt, der bei 450 nm detektiert werden kann. Das LDH Assay Kit wurde gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Zunächst wurde in einer 96 well Platte eine Standardreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen an NADH vorbereitet. Danach wurde das Probenmaterial in Form von Zellkulturüberständen auf die Platte aufgetragen und ggf. mit LDH-Assay-Puffer verdünnt. Anschließend wurde in jede Vertiefung der Platte ein Master Mix bestehend aus 97 Material und Methoden LDH-Assay-Puffer und LDH-Substrat-Mix gegeben, die Platte für 2 - 3 min unter leichtem Schütteln inkubiert und danach die sogenannte Initialmessung bei 450 nm ((A450)initial) durchgeführt. Daraufhin wurde die Platte bei 37 °C inkubiert und in regelmäßigen Abständen Messungen durchgeführt, bis der Wert der aktivsten Analyseprobe den höchsten Standardwert (12,5 nmol/well) überstieg. Für die spätere Berechnung wurden die Daten der letzten Messung ((A450)final) verwendet, bevor der Wert des höchstens Standards überschritten wurde. Die LDH Aktivität wird als nmol/min/ml = milliunits/ml angegeben. Eine Einheit LDH Aktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, welche benötigt wird, um die Umwandlung von Lactat in Pyruvat zu katalysieren, um so 1 µmol NADH pro Minute bei 37 °C zu generieren (s. Formel 5-3). Formel 5-3 Berechnung der LDH Aktivität 5.2.12 Histologie Für histologische Analysen wurde murines Lungengewebe entnommen und zunächst in 4 % Formaldehyd-Lösung fixiert. Nach Einbettung in Paraffin wurden 3 – 5- µm dicke Schnitte angefertigt und mittels standardisierter Protokolle in freundlicher Kollaboration von den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie (Universitätsklinikum Erlangen), gefärbt. Mittels HE (Haematoxylin-Eosin) gefärbten Schnitten, wurde der Grad der Entzündung im Lungengewebe ermittelt (Doganci et al., 2008b). Dabei färbt das Haematoxylin alle sauren bzw. basophilen Strukturen, wie z. B. auch Zellkerne mit enthaltener DNA, blau an. Eosin lässt alle acidophile bzw. basische Strukturen (z. B. Zellplasmaproteine, endoplasmatisches 98 Material und Methoden Retikulum und Kollagen) rot erscheinen. Um Informationen über die Mucusproduktion zu erhalten, wurde die PAS-Reaktion (Periodic Acid Schiff Reaction) angewandt. Hierbei werden u. a. neutrale Mucopolysaccaride und Mucoproteine magenta-rot angefärbt. 5.2.13 Statistik Bei der Analyse der humanen Daten wurden die Kinder entsprechend der angegeben Gruppen analysiert. Gezeigt sind Daten des ersten klinischen Besuchs. Die murinen Experimente wurden 2 – 3 Mal durchgeführt mit jeweils 3 - 5 Tieren pro Versuchsgruppe. Gezeigt wurde entweder ein repräsentatives Exeriment oder zusammengefasste Daten mehrer Experimente. Für die Auswertung wurde jeweils das arithmetische Mittel der Messwerte gebildet, sowie der Standardfehler (SEM = standard error of the mean) berechnet. Die Ergebnisse sind jeweils als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Messwerte wurden mit dem Student´s t-Test (PreDicta Studie) bzw. der einfachen ANOVA (murine Studien) auf Signifikanz getestet. Dabei gilt: * p ≤ 0,05 (schwach signifikant), ** p ≤ 0,01 (signifikant), *** p ≤ 0,001 (hoch signifikant). 99 Ergebnisse 6 Ergebnisse IL-17A ist ein Zytokin mit entzündungsfördernden Eigenschaften, dessen Rolle im Krankheitsbild Asthma bronchiale noch nicht vollständig geklärt ist. Es wird sowohl von Zellen der angeborenen (z. B. Mastzellen), als auch der erworbenen (z. B. CD4+ T-Zellen) Immunantwort gebildet. Bisher konnte gezeigt werden, dass IL-17A bei Patienten mit Asthma vermehrt gebildet wird und v. a. zur Akkumulation von neutrophilen Granulozyten im Lungengewebe beiträgt (Aujla and Alcorn, 2011). Weiterhin ist bekannt, dass IL-17A an der mukosalen und epithelialen Abwehr und Bekämpfung von Pilzen und extrazellulären Bakterien beteiligt ist (Hirota et al., 2011; Hirota et al., 2012). IL-17A spielt außerdem bei der Immunpathophysiologie viraler Infektionen eine Rolle. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse über die Rolle des Zytokins IL-17A im allergischen Asthma bronchiale, auch in Hinblick auf die Entstehung einer Atemwegstoleranz, zu erhalten. Weiterhin wurde untersucht, welche Rolle IL-17A während der antiviralen Immunantwort bei bestehendem Asthma bronchiale spielt. Zu diesem Zweck wurde sowohl humanes als auch murines Probenmaterial untersucht. 6.1 Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse in einem Modell allergischen Asthmas Zunächst wurde untersucht, wie IL-17A defiziente (IL-17A(-/-), IL-17A ko) Mäuse in einem murinen Modell allergischen Asthmas reagieren. Dazu wurde bei den Mäusen, wie in Abschnitt 5.2.3.2 beschrieben, Asthma induziert. An den Tagen 20 bzw. 21 des Protokolls wurden sie dann eingehender untersucht. 100 Ergebnisse 6.1.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation Bei der Atemwegshyperreaktivität (AHR) handelt es sich um eines der charakteristischsten Merkmale der Asthmaerkrankung. Die Messung der AHR erfolgte an Tag 20 des Protokolls, sowohl mit einer nicht-invasiven als auch mit einer invasiven Plethysmographie. Dabei ermittelt man die Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Arzneistoffs Methacholin (MCh), welcher eine Obstruktion der Bronchien hervorruft. Die nicht-invasive Messung der AHR zeigte, dass IL-17A(-/-) Mäuse sowohl im naiven (PBS) Zustand, als auch nach Induktion des Asthmas durch OVA signifikant stärker auf MCh reagierten als die jeweiligen Wildtyp-Mäuse (wt) (s. Abb. 6-1 A). Bei der invasiven Plethysmographie wiesen die IL-17A defizienten und mit OVA behandelten Mäuse v. a. bei niedrigen Konzentrationen des Methacholins eine erhöhte AHR auf. Bei der höchsten Konzentration des bronchokonstriktorischen Stoffes reagierten jedoch die erkrankten Wildtyp-Mäuse am stärksten (s. Abb. 6-1 B). Abb. 6-1 Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: An Tag 20 des Versuchsprotokolls wurde bei Wildtyp- und IL-17A ko Mäusen die Atemwegshyperreaktivität (AHR) gemessen. A) Die Bestimmung der AHR mit Hilfe einer nicht-invasiven Ganzkörperplethysmographie ergab einen signifikanten Anstieg der AHR sowohl bei naiven als auch bei erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen der jeweiligen Gruppe. B) Die Messung der AHR mittels einer invasiven Methode zeigte, dass IL-17A(-/-) Mäuse nach der Asthmainduktion v. a. auf niedrigere Dosen MCh verstärkt reagierten. Bei Dosen ab 25 mg/ml MCh konnte bei den erkrankten WildtypMäusen eine erhöhte AHR beobachtet werden. 101 Ergebnisse 6.1.2 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der bronchoalveolären Lavage Beim allergischen Asthma bronchiale infiltrieren v. a eosinophile Granulozyten die Wände der Atemwege, aber auch neutrophile Granulozyten wandern nach Kontakt mit einem Allergen in die Lunge ein und tragen somit zur Entzündungsreaktion bei (Cohn et al., 2004). Man geht davon aus, dass IL-17A die Akkumulation neutrophiler Granulozyten im Lungengewebe fördert und so zur Entzündungsreaktion beiträgt (Sun et al., 2005). Die BALF der Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse wurde durchflusszytometrisch analysiert. Dafür wurden die Zellen mit Antikörpern gegen CD3, CD45R, CCR3 und Gr-1 inkubiert. AbbildungAbb. 6-2 zeigt beispielhaft die sogenannte „Gating“-Strategie zur Analyse der Granulozyten. Abb. 6-2 „Gating“-Strategie zur Analyse eosinophiler und neutrophiler Granulozyten in der BAL: Eosinophile Granulozyten zählen zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen, wohingegen neutrophile Granulozyten zu den CD3-CD45RGr1+CCR3—Zellen gehören Die eosinophilen Granulozyten sind in der Population der CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen enthalten, wohingegen die neutrophilen Granulozyten zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3--Zellen gehören. Die Analyse der BAL-Zellen ergab, dass die Anzahl der eosinphilen Granulozyten nach Induktion des Asthma bronchiale sowohl in den Wildtyp-Mäusen als auch in den IL-17A defizienten Mäusen signifikant anstieg, wobei innerhalb der PBS- bzw. OVA-Gruppe beider Stämme keine weiteren Unterschiede zu erkennen waren (s. Abb. 6-3 A). Weiterhin konnte beobachtet werden, dass sich in den 102 Ergebnisse Atemwegen der IL-17A(-/-) Mäuse sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand weniger neutrophile Granulozyten befanden als in den Wildtyp-Mäusen (s. Abb. 6-3 B). Abb. 6-3 Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der BAL von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen Asthmamodell mit Hilfe der Durchlusszytometrie: Die Zellen der BAL wurden durchflusszytometrisch analysiert. Hierfür wurden die Zellen mit Antikörper gegen CD3, CD45R, Gr-1 und CCR3 inkubiert. Eosinophile Granulozyten gehören zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3+-Zellen. Die neutrophilen Granulozyten zählen zu den CD3-CD45R-Gr-1+CCR3--Zellen. A) Die Asthmainduktion führte bei beiden Genotypen zu einem signifikanten Anstieg der eosinophilen Granulozyten. B) Bei gesunden und erkrankten IL-17A defizienten Mäusen waren im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen tendenziell weniger neutrophile Granulozyten nachweisbar. 6.1.3 Analyse der Mastzellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen Mastzellen gehören einerseits zu den Effektorzellen der allergischen Typ I Sofortreaktion, andererseits sind sie durch die Freisetzung von Zyokinen und Chemokinen an der Entstehung einer Entzündungsreaktion beteiligt. Somit sind sie nicht nur Teil der akuten Reaktion sondern auch der chronischen Entzündung (Busse and Lemanske, 2001; Mutschler et al., 103 Ergebnisse 2008; Schütt and Bröker, 2009). Ihre Expansion wird u. a. durch IL-3, IL-4 und IL-9 gefördert (Arinobu et al., 2009). Zunächst wurde die Konzentration von IL-3 in den Überständen der BALF gemessen. Innerhalb der unbehandelten Gruppe deuteten die Ergebnisse auf eine Reduktion von IL-3 in IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen hin. Nach Behandlung mit dem Allergen wiesen auch die Wildtyp-Mäuse geringere Konzentration des Zytokins auf (s. Abb. 6-4 A). Die Genexpression des Interleukins 9 wurde in CD4+ T-Zellen der Lunge untersucht. Es konnte in beiden Mausstämmen nach Auslösen der Asthmaerkrankung ein signifikanter Anstieg der Il-9 mRNA Expression detektiert werden. Der IL-17A-Gendefekt schien sich innerhalb dieser Gruppe außerdem in einer gesteigerten Expression dieses Zytokins auszuwirken (s. Abb. 6-4 B). Mithilfe der durchflusszytometrischen Analyse wurde der Anteil an CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen in der Lunge bestimmt. Bei gesunden Tieren ging die Abwesenheit des Zytokins IL-17A mit einer Reduktion der CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen einher. Die Behandlung mit dem Allergen OVA führte bei beiden Genotypen zu einem signifikanten Anstieg des analysierten Zelltyps, wobei auch hier der Gendefekt eine tendenziell geringere Anzahl an CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen hervorrief (s. Abb. 6-4 C und D). 104 Ergebnisse Abb. 6-4 Analyse der Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Die Differenzierung von Mastzellen wird durch IL-3 und IL-9 gefördert. Deshalb wurden diese beiden Zytokine näher untersucht. A) Die Konzentration von IL-3 wurde in der BALF gemessen. Gesunde IL-17A(-/-) Mäuse sezernierten tendenziell weniger IL-3 als gesunde wt Mäuse. Das Auslösen der Asthmaerkrankung führte in wt Mäusen zu einer Reduktion der IL-3 Konzentration in der BALF. B) Die Il-9 Genexpression wurde in CD4+ T-Zellen der Lunge gemessen. Die Behandlung mit OVA führte zu einer gesteigerten Genexpression bei beiden Mausstämmen, wobei der Gendefekt zu einem höheren Anstieg der Il-9 mRNA Expression führte. C) Um Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge zu detektieren, wurden dafür zunächst die ckit+FcεRIα+ Zellen ermittelt, um anschließend die CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellpopulation prozentual zu berechnen. D) Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass sich in den Lungen gesunder IL-17A(-/-) Mäuse signifikant weniger CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen befanden als bei wt Mäusen. Erkrankte Tiere beider Mausstämme wiesen eine erhöhte Anzahl an Mastzellen auf, wobei IL-17A defiziente Mäuse tendenziell weniger Mastzellen in ihren Lungen hatten. Um die Mastzellen der beiden Mausstämme weiter zu analysieren, wurden sie aus dem Knochenmark generiert. Dazu wurde aus dem Ober- und Unterschenkel der Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse das Knochenmark isoliert und anschließend für vier Wochen in 105 Ergebnisse Anwesenheit von IL-3 und SCF kultiviert (s. 5.2.3.11). Einmal pro Woche wurde das Kulturmedium gewechselt und zeitgleich die Zellzahl bestimmt. Hierbei fiel auf, dass aus dem Knochenmark der IL-17A defizienten Mäuse deutlich weniger Mastzellen hervorgingen als aus dem Knochenmark der Wildtyp-Mäuse (s. Abb. 6-5 A). Nach vier Wochen Zellkultur wurde mittels Durchflusszytometrie festgestellt, dass mehr als 85 % der Zellen FcεRIckit+ waren (s. Abb. 6-5 B), zwei typische Oberflächenmarker für Mastzellen (Heneberg, 2011). Wie zuvor erwähnt gehört IL-3 zu den Wachstumsfaktoren für Mastzellen. Dieses Zytokin bindet an das Oberflächenmolekül CD123. Nachdem in Abwesenheit von IL-17A die Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark beeinträchtigt war, wurde mittels qPCR Analyse überprüft, ob diese Zellen den IL-3 Rezeptor überhaupt bilden. Es zeigte sich, dass nach vier Wochen Zellkultur in den IL-17A defizienten Zellen sogar signifikant mehr CD123 mRNA nachweisbar war als in den Wildtyp-Zellen (s. Abb. 6-5 C). Von den generierten Mastzellen wurden auch Zytospins angefertigt, mit May-Grünwald-Giemsa Lösung gefärbt und unter dem Mikroskop analysiert. Morphologisch betrachtet machte es den Anschein, als hätten die IL-17A defizienten Zellen weniger vorgefertigte Botenstoffe in ihren Granula gespeichert (s. Abb. 6-5 D). Ein Histamin-ELISA ergab, dass die Gesamtmenge an Histamin im Überstand und Zellpellet der IL-17A defizienten Zellen sowohl unstimuliert als auch nach Stimulation mit PMA/Ionomycin signifikant geringer war als in den Analyseproben der Wildtyp-Zellen (s. Abb. 6-5 E). Betrachtete man nun den prozentualen Anteil an freigesetztem Histamin, so zeigte sich, dass die Stimulation mit PMA/Ionomycin bei den Zellen beider Genotypen zu einer verstärkten Freisetzung von Histamin führte, wobei die IL-17A(-/-) Zellen tendenziell weniger Histamin freisetzten als die Zellen ohne Gendefekt (s. Abb. 6-5 F). 106 Ergebnisse Abb. 6-5 Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Für die Generierung von Mastzellen wurde das Knochenmark aus den Ober- und Unterschenkeln von wt und IL-17A ko Mäusen isoliert und anschließend für vier Wochen in Anwesenheit von IL-3 und SCF kultiviert. A) Die Zellzahl wurde einmal pro Woche bestimmt. Die jeweilige Zellzahl wurde ins Verhältnis zu den an Tag 0 isolierten Knochenmarkszellen gesetzt. IL-17A(-/-) Zellen proliferierten signifikant weniger als wt Zellen. B) Nach vier Wochen Kultur wurde mittels Durchflusszytometrie festgestellt, dass mindestens 85 % der Zellen FcεRIckit+ waren. C) Aus den für 4 Wochen kultivierten Mastzellen wurde RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mithilfe der qPCR Anlyse wurde die CD123 mRNA Expression ermittelt. Es zeigte sich, dass in IL-17A defizienten Zellen die CD123 mRNA Expression im Gegensatz zu wt Zellen erhöht war. D) Von den generierten Mastzellen wurden Zytospins angefertigt und mit MayGrünwald-Giemsa Lösung gefärbt. Mikroskopisch betrachtet erschien es, dass IL-17A ko Zellen weniger vorgefertigte Botenstoffe in ihren Granula gespeichert hatten. E,F) Mit den generierten Mastzellen wurde ein Histamin Release durchgeführt. Dazu wurden die Zellen zunächst mit PMA/Ionomycin stimuliert. In den Überständen und Zellpellets wurde anschließend mittels ELISA die Histaminkonzentration gemessen. Die Gesamtmenge an Histamin (= Histaminkonzentration im Überstand + Histaminkonzentration im Pellet) war bei IL-17A defizienten Zellen sowohl mit als auch ohne vorherige Stimulation mit PMA/Ionomycin geringer als bei wt Zellen (E). Die Konzentration an freigesetztem Histamin (= Verhältnis Histaminkonzentration im Überstand zu Histaminkonzentration im Pellet) stieg nach Stimulation sowohl bei den wt- als auch bei den IL-17A ko Zellen an, wobei die IL-17A defizienten Zellen trotz Stimulation tendenziell weniger Histamin freisetzten als die wt Zellen (F). Es ist bereits bekannt, dass TGF- die IL-3 und IL-4 abhängige Proliferation von Mastzellen aus dem Knochenmark negativ beeinflusst (Broide et al., 1989; Toyota et al., 1995). Aufgrund dessen erfolgte eine weitere Analyse der Zellkulturüberstände, welche beim wöchentlichen Wechsel des Kulturmediums aufbewahrt wurden (s. 5.2.3.11). Die Konzentrationsbestimmung von TGF- mittels ELISA ergab, dass die IL-17A defizienten 107 Ergebnisse Zellen zu jedem Zeitpunkt deutlich mehr TGF- freisetzten als die Mastzellen, welche aus dem Knochenmark von Wildtyp-Mäusen generiert wurden. Für die Mastzellen beider Genotypen galt, dass die freigesetzte Menge an TGF- nach einer Woche am höchsten war (s. Abb. 6-6). Abb. 6-6 TGF- Konzentration in den Kulturüberständen während der Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen: Während der Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von wt und IL-17A ko Mäusen wurde einmal pro Woche das Kulturmedium gewechselt. Ein Teil des Mediums wurde für weitere Analysen aufbewahrt. Mittels ELISA wurde die Konzentration von TGF- im Kulturmedium bestimmt. Es zeigte sich, dass IL-17A defiziente Zellen zu jedem Zeitpunkt mehr TGF- freisetzten als die wt Zellen. Außerdem konnte bei beiden Genotypen beobachtet werden, dass die freigesetzten Mengen an TGF- nach 1 Woche am höchsten waren. (# p ≤ 0,05 relativ zu wt 1. Woche; ### p ≤ 0,001 relativ zu wt 1. Woche; + p ≤ 0,05 relativ zu ko 1. Woche) 6.1.4 Ermittlung des Entzündungsgrades und Mukusproduktion in der Lunge Die Ermittlung des Entzündungsgrades des Lungengewebes stellt ein weiteres wichtiges Kriterium dar, um auf die Schwere der Asthmaerkrankung rückschließen zu können. Hierbei wird mit Hilfe von HE gefärbten histologischen Paraffinschnitten die Infiltration des Lungengewebes mit Lymphozyten und Granulozyten analysiert. Die Untersuchung ergab, dass die Behandlung Entzündungsreaktion mit dem hervorrief, Allergen OVA jedoch konnten in beiden innerhalb Mausstämmen der eine jeweiligen Behandlungsgruppen keine weiteren Unterschiede festgestellt werden (s. Abb. 6-7). 108 Ergebnisse Abb. 6-7 Bestimmung des Entzündungsgrades der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas: Gewebeschnitte der Lunge wurden mit HE gefärbt und histologisch analysiert. A) wt PBS B) IL-17A(-/-) PBS C) wt OVA D) IL-17A(-/-) OVA E) Quantifizierung des Entzündungsgrades (Doganci et al., 2008b): Das Auslösen der Asthmaerkrankung führte in beiden Mausstämmen zu einer vermehrten Entzündungsreaktion im Lungengewebe. Innerhalb der OVA-Gruppe konnten keine weiteren Unterschiede festgestellt werden. Charakteristisch für das Asthma bronchiale ist, neben der beschriebenen Entzündungsreaktion im Lungengewebe, auch eine vermehrte Mukusproduktion, was zusätzlich zur Verengung der Bronchien und somit zu einer erschwerten Atmung beiträgt. Mittels PAS-Färbung werden mukusproduzierende Becherzellen im Lungengewebe angefärbt. In erkrankten Mäusen beider Genotypen konnte im Vergleich zu den unbehandelten Tieren eine vermehrte Schleimproduktion festgestellt werden. Die histologische Analyse des Lungengewebes ergab weiterhin, dass die an Asthma erkrankten IL-17A ko Mäuse signifikant weniger PAS+-Zellen aufwiesen als die mit Allergen behandelten wt Tiere (s.Abb. 6-8). 109 Ergebnisse Abb. 6-8 Detektion der PAS+-Zellen im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen Asthmamodell: Lungenschnitte wurden mittels PAS-Färbung auf mukusproduzierende Zellen hin untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Zahl der PAS+-Zellen pro Bronchus bestimmt und diese Anzahl anschließend ins Verhältnis zum Durchmesser des jeweiligen Bronchus gesetzt. Die mikroskopischen Aufnahmen (A, B) stellen eine 63x Vergrößerung dar. A) wt OVA B) IL-17A(-/-) OVA. In C) ist die Quantifizierung dargestellt. Erkrankte Tiere beider Genotypen zeigten eine vermehrte Schleimproduktion. Im Lungengewebe mit Allergen behandelter wt Mäuse ließen sich signifikant mehr PAS+ Zellen detektieren als bei erkrankten IL-17A ko Mäusen. 6.1.5 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum Ein Merkmal des allergischen Asthmas ist die Bildung von allergenspezifischem IgE. An dessen Klassenwechsel ist der Transkriptionsfaktor BATF in B-Zellen direkt und über Tfh-Zellen indirekt beteiligt. IgE ist das charakteristischste Immunglobulin, welches von B-Zellen sezerniert wird. An Tag 21 des Versuchsprotokolls wurde zum einen die Lunge entnommen, um daraus Gesamtzellen und anschließend CD4+ T-Lymphozyten zu isolieren, zum anderen wurde den Mäusen Blut abgenommen, um daraus Serum zu gewinnen und anschließend die IgE Konzentration bestimmen zu können. Aus den CD4+ T-Zellen wurde RNA isoliert und anschließend in cDNA umgeschrieben, um mittels qPCR die Genexpression des Transkriptionsfaktors Batf weiter untersuchen zu können. Die Analyse ergab, dass die Behandlung mit OVA in beiden Genotypen zu einem Anstieg der Batf Genexpression führte (s. Abb. 6-9 A). Die IgE–Konzentrationsbestimmung zeigte, dass bei unbehandelten Mäusen kein Unterschied zwischen den beiden Genotypen im Serum IgE-Spiegel nachweisbar war. 110 Ergebnisse Weiterhin konnte beobachtet werden, dass die Erkrankung in beiden Mausstämmen zu einem signifikanten Anstieg der IgE Konzentration führte, wobei keine Unterschiede zwischen wt und IL-17A ko Mäusen zu verzeichnen waren (s. Abb. 6-9 B). Abb. 6-9 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: A) Am Ende des Experiments wurde die Lunge entnommen, um daraus Gesamtzellen und anschließend CD4+ T-Zellen zu isolieren. In den so erhaltenen Zellen wurde die Genexpression des Transkriptionsfaktors Batf untersucht. Es zeigte sich, dass nach der Behandlung mit OVA die Expression von Batf in beiden Genotypen anstieg. B) Aus dem Blut von wt und IL-17A ko Mäusen wurde das Serum gewonnen und die IgE Konzentration mittels ELISA bestimmt. Unbehandelte Tiere beider Mausstämme wiesen nur geringe Konzentrationen von IgE auf, wohingegen die Behandlung mit OVA zu einer starken Zunahme der IgE-Spiegel sowohl in wt als auch in IL-17A(-/-) Mäusen führte. 6.1.6 Analyse der Th2- und Th1-Zytokine in der Lunge Während der Pathogenese des allergischen Asthmas spielen Th2-Lymphozyten eine entscheidende Rolle. Durch die Produktion und Freisetzung von Zytokinen wie IL-4, IL-5 und IL-13 sind sie maßgeblich am Entzündungsprozess und der Ausprägung der Symptomatik beteiligt (Hansen, 2001; Lloyd and Hessel, 2010; Zhu, 2010; Lloyd and Saglani, 2013). Die Proteinkonzentrationen dieser Zytokine wurden in der BALF mittels ELISA bestimmt. Innerhalb der PBS-Gruppe konnten bei den jeweiligen Zytokinen keine Unterschiede festgestellt werden. Für alle drei untersuchten Interleukine galt, dass die Induktion der Asthmaerkrankung zu einem Anstieg der Proteinkonzentrationen führte (s. Abb. 6-10 A - C). Dies war in Bezug auf IL-4 und IL-5 für beide Genotypen der Fall, bei IL-13 sah man nur innerhalb der IL-17A defizienten Mäuse einen signifikanten Anstieg. In der BALF der 111 Ergebnisse erkrankten IL-17A defizienten Mäuse konnte zudem signifikant mehr IL-4 nachgewiesen werden als in der Wildtyp-Vergleichsgruppe (s. Abb. 6-10 A-C). Bei Gata3 handelt es sich um den Haupttranskriptionsfaktor der Th2-Zellen. Aufgrund der erhöhten Konzentrationen an Th2-Zytokinen wurde die Expression von Gata3 auf mRNA Ebene untersucht. Es zeigte sich, dass das Auslösen der Asthmaerkrankung lediglich in IL-17A defizienten Mäusen zu einer tendenziell erhöhten Expression von Gata3 führte, nicht jedoch in wt Mäusen (s. Abb. 6-10 D). Abb. 6-10 Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell: Nach Durchführung der Lavage wurde die erhaltene Flüssigkeit zentrifugiert und die Überstände mittels ELISA analysiert. A) Die erkrankten Mäuse beider Genotypen produzierten signifikant höhere Proteinkonzentrationen an IL-4 als die gesunden Tiere, wobei der Gehalt an IL-4 bei den IL-17A(-/-) Mäusen auch im Vergleich zu OVA behandelten Wildtyp-Tieren signifikant erhöht war. B) An Asthma erkrankte Tiere beider Mausstämme produzieren signifikant mehr IL-5 als die jeweiligen PBS-Vergleichstiere. C) In der BAL von IL-17A ko Mäusen konnten signifikant höhere Konzentrationen an IL-13 nachgewiesen werden als bei gesunden IL-17A(-/-) Mäusen. Bei erkrankten Wildtyp-Tieren konnte ein tendenzieller Anstieg festgestellt werden. D) Die Gata3 mRNA Expression im Lungengewebe wurde mit Hilfe der qPCR analysiert. Die Behandlung mit OVA führte zu einem tendenziellen Anstieg der Gata3 Expression in IL-17A defizienten Mäusen. Das Interleukin 13, von welchem bekannt ist, dass es an der Entstehung der Atemwegshyperreaktivität maßgeblich beteilig ist (Mattes et al., 2001), wurde mittels Durchflusszytometrie und qPCR eingehender untersucht. Für die durchflusszytometrische 112 Ergebnisse Analyse wurden zunächst die Lungen von Wiltyp- und IL-17A defizienten Mäusen entnommen, um daraus die Gesamtzellen zu isolieren. Im Anschluss erfolgte die Oberflächenfärbung mit einem Antikörper gegen CD4, gefolgt von der intrazellulären Färbung mit einem Antikörper gegen IL-13. Die Auswertung ergab eine signifikant erhöhte Anzahl der IL-13+CD4+ T-Lymphozyten in den Lungenzellen naiver IL-17A(-/-) Mäuse im Vergleich zu wt Mäusen. Nach Behandlung mit dem Allergen kam es auch bei dem wt Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der IL-13-produzierenden CD4+ T-Zellen, wohingegen bei den erkrankten IL-17A ko Mäusen kein weiterer Anstieg zu beobachten war (Abb. 6-11 A). Für die Untersuchungen auf mRNA Ebene wurden CD4+ T-Zellen aus der Lunge von Wildtyp und IL-17A defizienten Mäusen isoliert. Es konnte gezeigt werden, dass IL-17A(-/-) Mäuse, die mit OVA behandelt wurden, signifikant mehr Il-13 mRNA in den CD4+ T-Lymphozyten der Lunge exprimierten. Bei den Wildtyp-Mäusen konnte zwischen den PBS und den OVA Tieren ein tendenzieller Anstieg der Il-13 mRNA Expression beobachtet werden (Abb. 6-11 B). 113 Ergebnisse Abb. 6-11 Analyse des Interleukins 13 in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell: A) Durchflusszytometrische Analyse der IL-13-produzierenden CD4+ T-Zellen. Unbehandelte IL-17A ko Mäuse wiesen mehr IL-13-produzierende CD4+ T-Lymphozyten auf als wt Mäuse. Die Behandlung mit OVA hatte einen signifikanten Anstieg dieser Zellen in wt Mäusen zur Folge, wohingegen die Zellzahlen in erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen nicht weiter anstieg. B) Die Il-13 mRNA Expression wurde in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge gemessen. Es konnte bei mit OVA behandelten IL-17A(-/-) Mäusen ein signifikanter, bei wt Mäusen ein tendenzieller Anstieg der Il-13 mRNA Expression beobachtet werden. Th1-Zellen wird bei Asthma bronchiale ein protektiver Effekt zugeschrieben. Sie gelten als wichtige Gegenspieler der Th2-Zellen, da sie in der Lage sind, die Produktion der Th2-Zytokine zu hemmen, welche bei Asthma bronchiale vermehrt vorliegen (Hansen, 2001). Daher wurde die Produktion von IFN-, das Marker-Zytokin dieser Zellklasse, in der BALF mittels ELISA gemessen. In unbehandelten Mäusen zeigte sich kein Unterschied zwischen den beiden Genotypen, wohingegen nach der Gabe des Allergens in der BALF der Wildtyp-Mäuse signifikant mehr IFN- nachgewiesen werden konnte als bei IL-17A defizienten Mäusen (s. Abb. 6-12). 114 Ergebnisse Abb. 6-12 IFN- in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas: An Tag 21 des Protokolls wurde eine BAL durchgeführt. Die erhaltene Flüssigkeit wurde in Bezug auf die IFN- Konzentration untersucht. In der Lavage von erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen wurde signifkant weniger IFN- detektiert als bei erkrankten Wildtyp-Mäusen. 6.1.7 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen Treg-Zellen und deren immunsuppressorische Eigenschaften spielen bei Asthma bronchiale eine wichtige Rolle. Sie sind gekennzeichnet durch die Oberflächenmoleküle CD4 und CD25, sowie durch den Transkriptionsfaktor Foxp3. Ihre immunsuppressorische Wirkung erzielen sie u. a. durch die Freisetzung der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF- (s. 3.2.5.5). Zunächst wurden die Gesamtzellen der Lunge durchflusszytometrisch analysiert (s. Abb. 6-13 A). Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Behandlung mit dem Allergen OVA in beiden Genotypen zu einem Anstieg der CD4+CD25+Foxp3+ T-Zellen führte, wobei innerhalb dieser Behandlungsgruppe keine weiteren Unterschiede mehr nachweisbar waren (s. Abb. 6-13 B). Auch auf mRNA Ebene zeichnete sich im Lungengewebe von asthmatischen Mäusen, im Vergleich zu unbehandelten Mäusen, eine gesteigerte Foxp3 mRNA Expression ab. Eine IL-17A Defizienz zeigte auch hier keine weiteren Auswirkungen (s. Abb. 6-13 C). 115 Ergebnisse Abb. 6-13 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas: Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse wurden mit OVA behandelt, um Asthma zu induzieren. Anschließend wurden die Lungen entnommen und weiter untersucht. A) Aus dem Lungengewebe wurden die Gesamtzellen isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dafür wurden zunächst die CD4+ T-Zellen ermittelt, um anschließend die CD25+Foxp3+ Treg-Population prozentual zu berechnen. B) In beiden Mausstämmen führte die Asthmaerkrankung zu einer vermehrten Proliferation der CD4+CD25+Foxp3+ Treg-Zellen. C) Aus dem Lungengewebe wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und die Foxp3 mRNA Expression mittels qPCR untersucht. So konnte nachgewiesen werden, dass die OVATiere beider Genotypen im Vergleich zu PBS-Tieren mehr Foxp3 exprimierten. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass auch die Bildung der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und TGF-nicht von IL-17A beeinflusst wurde. So führte die Asthmaerkrankung in beiden Genotypen zu einer verstärkten Il-10 mRNA Expression in den CD4+ T-Zellen (s. Abb. 6-14 A). Auch in den Kulturüberständen dieser Zellen konnte eine 116 Ergebnisse erhöhte Konzentration an IL-10 nachgewiesen werden. (s. Abb. 6-14 B). Die Analyse der Tgf mRNA Expression zeigte, dass weder die Behandlung mit dem Allergen, noch der Gendefekt zu weiteren Veränderungen führte (s. Abb. 6-14 C). Abb. 6-14 Analyse der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und Tgf im murinen Asthmamodell: Aus den Gesamtzellen der Lunge wurden CD4+ T-Zellen isoliert und danach entweder kultiviert oder für die RNA Extraktion verwendet um mRNA Analysen durchführen zu können. A und B) Die Asthmaerkrankung führte in beiden Genotypen zu einem signifikanten Anstieg der Il-10 mRNA Expression. Diese Beobachtung spiegelte sich auch in einer erhöhten IL-10 Proteinkonzentration nach 24 h Zellkultur wider. C) Bezüglich der Tgf mRNA Expression ergaben sich weder durch die Allergenbehandlung noch durch den IL-17A Defekt weitere Unterschiede. 6.2 Analyse des Phänotyps IL-17A defizienter Mäuse im Atemwegstoleranzmodell Bei der Atemwegstoleranz handelt es sich um eine besondere Form der Immunüberwachung. Darunter versteht man, dass harmlose Antigene von Pathogenen unterschieden werden und nur gegen potenziell schädigende Stoffe vorgegangen wird. Es kann jedoch auch vorkommen, dass ein eigentlich harmloses Antigen nicht als solches erkannt wird und so allergische 117 Ergebnisse Erkrankungen wie z. B. Asthma auftreten. Ziel der Forschung ist es, die zugrunde liegenden Mechanismen besser zu verstehen, um die gezielte Induktion einer Atemwegstoleranz möglicherweise als Therapie des allergischen Asthmas einzusetzen. Diese Form der Therapie würde sich beispielsweise bei Kindern eignen, die zwar noch nicht an Asthma erkrankt sind, die aber aufgrund z. B. genetischer Faktoren prädestiniert sind, eine Allergie beispielsweise in Form von Asthma zu entwickeln. Um herauszufinden, ob IL-17A bei der Atemwegstoleranz eine Rolle spielt, wurden Wildtypund IL-17A defiziente Mäuse benutzt, um wie unter 5.2.3.3 beschrieben, eine Atemwegstoleranz zu induzieren. 6.2.1 Messung der Atemwegshyperreaktivität nach Methacholin-Provokation im Toleranzmodell Wie zuvor (s. 6.1.1) beschrieben, zeigten asthmatische IL-17A Mäuse im nicht-invasiven Modell eine starke Reaktion nach Provokation mit dem Bronchokonstriktor Methacholin. Nun sollte untersucht werden, ob sich die Induktion der Atemwegstoleranz positiv auf die AHR in IL-17A(-/-) Mäusen auswirkt. Die Messung der AHR erfolgte an Tag 22 (s. Abb. 3-4) des Protokolls mithilfe einer nicht-invasiven Methode. Es zeigte sich, dass tolerogene IL-17A defiziente Mäuse deutlich weniger auf das Methacholin reagierten als asthmatische IL-17A ko Mäuse. Sie wiesen allerdings immer noch eine höhere AHR auf als tolerogene WildtypMäuse bzw. naive IL-17A(-/-) Mäuse. Auch bei wt Mäusen bewirkte die intranasale Applikation von OVA vor der Sensibilisierungsphase eine Abnahme der AHR (s. Abb. 6-15 A-C). 118 Ergebnisse Abb. 6-15 Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach Induktion der Atemwegstoleranz: An Tag 22 des Versuchsprotokolls wurde bei wt und IL-17A(-/-) Mäusen die AHR gemessen. A-C) Nach Induktion der Atemwegstoleranz wiesen sowohl wt als auch IL-17A ko Mäuse eine geringere AHR auf als asthmatische Mäuse des jeweiligen Genotyps. Tolerogene IL-17A defiziente Mäuse reagierten jedoch immer noch stärker auf das MCh als tolerogene Wildtyp-Mäuse bzw. unbehandelte IL-17A ko Mäuse. 6.2.2 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum Die Bestimmung der IgE Konzentration spielt eine wichtige Rolle, um die Schwere einer allergischen Erkrankung beurteilen zu können. So wurde auch im Toleranzmodell die Konzentration an IgE im Serum ermittelt. Wie im Asthmamodell bereits beobachtet, kommt es bei an Asthma erkrankten Tieren beider Stämme zu einem Anstieg der IgE Konzentration im Serum. Die Induktion der Atemwegstoleranz bewirkte bei beiden Mausstämmen einen Rückgang der IgE Spiegel im Serum im Vergleich zu asthmatischen Mäusen, jedoch konnte innerhalb der Toleranzgruppe kein Unterschied zwischen den beiden Genotypen festgestellt werden (s. Abb. 6-16). 119 Ergebnisse Abb. 6-16 Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell: Am Ende des Experiments wurde aus dem Blut der Mäuse Serum gewonnen und die IgE Konzentration mittels ELISA bestimmt. Unbehandelte Tiere beider Genotypen wiesen nur geringe Konzentrationen an IgE auf. Bei asthmatischen Tieren war ein Anstieg der IgE Konzentration sowohl bei den wt- als auch den IL-17A ko Mäusen zu verzeichnen. Die Induktion der Atemwegstoleranz schützte die Mäuse beider Mausstämme vor gesteigerten IgE-Spiegeln im Serum. 6.2.3 Analyse der Th2-Zellen nach Induktion der Atemwegstoleranz Im murinen Asthmamodell konnte bereits nachgewiesen werden, dass IL-17A Einfluss auf die Th2-Zytokine nimmt. Es sollte in der vorliegenden Arbeit auch überprüft werden, welche Auswirkungen eine IL-17A Defizienz im Toleranzmodell mit sich bringt, bei dem die Mäuse während der Sensibilisierungsphase nur einmalig mit OVA i.p. behandelt wurden (s. Abb. 5-4). Dazu wurde die BALF naiver, asthmatischer und tolerogener wt- und IL-17A ko Mäuse mittels ELISA untersucht. In der BALF asthmatischer Mäuse konnte bei beiden Genotypen eine erhöhte Konzentration an IL-4 und IL-5 im Vergleich zu gesunden Mäusen detektiert werden (s. Abb. 6-17 A und B). Im Vergleich zu naiven Mäusen nahm die IL-13 Proteinkonzentration bei dem verwendeten Protokoll allerdings nur in asthmatischen IL-17A (-/-) Mäusen zu (s. Abb. 6-17 C). Bei den Tieren beider Genotypen konnte nach Induktion der Atemwegstoleranz ein Rückgang der IL-4 und IL-5 Proteinkonzentration in der BALF ermittelt werden (s. Abb. 6-17 A und B). Des Weiteren sezernierten IL-17A (-/-) Mäuse im Toleranzmodell weniger IL-13, wohingegen bei wt Mäusen im Vergleich zu den naiven und asthmatischen Tieren eher ein Anstieg der IL-13 Proteinkonzentration zu ermitteln war (s. Abb. 6-17 C). 120 Ergebnisse Abb. 6-17 Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell: Die BALF wurde zentrifugiert und die Überstände mittels ELISA analysiert. A) Gesunde IL-17A ko Mäuse sezernierten weniger IL-4 als wt Mäuse. Bei asthmatischen Mäusen beider Genotypen konnte in der BALF eine erhöhte Konzentration an IL-4 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu produzierten sowohl wt als auch IL-17A(-/-) Mäuse im Toleranzmodell weniger IL-4. B) An Asthma erkrankte Tiere beider Genotypen setzen mehr IL-5 frei als gesunde Mäuse. Nach Induktion der Atemwegstoleranz produzierten die Mäuse beider Stämme zwar mehr IL-5 als naive Tiere, jedoch weniger als asthmatische Tiere. C) In der BALF asthmatische IL-17 ko Mäuse waren höhere IL-13 Proteinkonzentrationen nachweisbar als bei gesunden IL-17A ko Mäusen. Im Toleranzmodell produzierten IL-17A(-/-) Mäuse tendenziell weniger IL-13 als asthmatische Mäuse. 6.2.4 Analyse der Treg-Zellen im Toleranzmodell Treg-Zellen spielen bei der immunologischen Toleranz eine wichtige Rolle. Sie unterdrücken Teffektor-Zellen, welche gegen das körpereigene Immunsystem gerichtet sind und sie sind Vermittler der Anergie (= fehlende Reaktion auf ein Antigen durch Abschalten der Immunantwort). Die Hemmung anderer Zellen verläuft u. a. durch das Freisetzen immunsuppressiver Zytokine wie IL-10 und TGF-. Der Anteil an Treg-Zellen in den Lungen der zu untersuchenden Mäuse wurde durchflusszytometrisch bestimmt. So konnte gezeigt werden, dass sich eine IL-17A Defizienz negativ auf die Anzahl der Treg-Zellen auswirkte, da 121 Ergebnisse tolerogene IL-17A defiziente Mäuse signifikant weniger regulatorische T-Zellen aufwiesen als tolerogene Wildtyp-Mäuse (s. Abb. 6-18 A). Dennoch konnte beobachtet werden, dass IL-17A im Falle der Atemwegstoleranz wohl eine hemmende Wirkung auf die immunsuppressiven Zytokine Il-10 und Tgf ausübte, da diese im Toleranzmodell in IL-17A ko Mäusen verstärkt exprimiert wurden, sowohl im Vergleich zu gesunden IL-17A ko Mäusen als auch zu asthmatischen wt Mäusen. Auch innerhalb der Wildtyp-Mäuse konnte im Toleranzmodell eine gesteigerte Il-10 mRNA Expression ermittelt werden. Im Gegensatz dazu führte die Induktion der Atemwegstoleranz in den Wildtyp-Mäusen zu einer Abnahme der Tgf Genexpression (s. Abb. 6-18 B und C). 122 Ergebnisse Abb. 6-18 Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell: Wildtypund IL-17A(-/-) Mäuse wurden vor der Sensibilisierungsphase intranasal mit OVA behandelt, um eine Atemwegstoleranz zu induzieren. Am Ende des Versuchs wurden die Lungen entnommen und weiter untersucht. A) Aus dem Lungengewebe wurden die Gesamtzellen isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dafür wurden zunächst die Lymphozyten und anschließend die CD4+ T-Zellen ermittelt. Aus der CD4+CD25+ Zellpopulation wurde daraufhin die CD4+Foxp3+ Treg-Population prozentual berechnet. B) Die durchlusszytometrische Analyse ergab, dass tolerogene IL-17A ko Mäuse signifikant weniger Foxp3+CD4+CD25+ Treg-Zellen ausbildeten als tolerogene wt Mäuse. C) Tolerogene wt und IL-17A ko Mäuse exprimierten im Lungengewebe mehr Il-10 als unbehandelte Tiere. Außerdem war die Genexpression in den asthmatischen und tolerogenen IL-17A ko Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen tendenziell erhöht. D) Nach Induktion der Atemwegstoleranz wurde in den Lungen der IL-17A defizienten Mäusen Tgf tendenziell verstärkt exprimiert. 123 Ergebnisse 6.2.5 Analyse der Tfh-Zellen im Atemwegstoleranzmodell Tfh-Zellen stellen eine spezielle T-Helferzell-Population dar, welche die humorale Immunantwort unterstützt. Darüber hinaus sind sie an der Entstehung und Regulation der B-Zell-vermittelten Toleranz beteiligt (s. 3.2.5.6). Aufgrund ihrer Rolle während der Vermittlung der immunologischen Toleranz wurden diese Zellen auch in der vorliegenden Arbeit im murinen Modell untersucht. Zu diesem Zweck wurde aus dem Lungengewebe von naiven, asthmatischen und tolerogenen wt- und IL-17A ko Mäusen RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR analysiert. Zunächst wurden die beiden Zytokine IL-6 und IL-21 untersucht, da gezeigt wurde, dass diese beiden Faktoren Tfh-Zellen induzieren und auch von diesen sezerniert werden (s. 3.2.5.6). Es zeigte sich, dass sowohl Il-6 als auch Il-21 im Toleranzmodell in Abwesenheit von IL-17A vermehrt gebildet wurden (s. Abb. 6-19 A und B). Die höchste Il-6 mRNA Expression konnte bei asthmatischen wt und IL-17A ko Mäusen nachgewiesen werden. Im Verhältnis dazu fiel die Expression im Toleranzmodell geringer aus, war aber im Falle der IL-17A ko Mäuse immer noch signifikant höher als in unbehandelten Mäusen (s. Abb. 6-19 A). Betrachtet man in Bezug auf die Il-21 mRNA Expression die drei unterschiedlichen Versuchsgruppen – PBS, Asthma, Toleranz – so nahm die Genexpression dieses Zytokins bei beiden Genotypen stetig zu, wobei die relativen Unterschiede in Abwesenheit von IL-17A ausgeprägter ausfielen (s. Abb. 6-19 B). 124 Ergebnisse Abb. 6-19 Analyse der Il-6 und Il-21 mRNA Expression im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell: Aus dem Lungengewebe von wt und IL-17A ko Mäusen wurde RNA extrahiert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR analysiert. A) Die Behandlung mit dem Allergen führte sowohl bei wt als auch bei IL-17A (-/-) Mäusen zu einem signifikanten Anstieg der Il-6 mRNA Expression. Die Induktion der Atemwegstoleranz bewirkte in beiden Mausstämmen zwar eine Reduktion Il-6 Genexpression, jedoch blieb diese höher als bei unbehandelten Mäusen. B) Die Genexpression des Zytokins Il-21 wurde durch OVA induziert. Dies galt besonders für das Toleranzmodell. Sowohl asthmatische als auch tolerogene IL-17A ko Mäuse bildeten mehr der Il-21 mRNA als die wt Mäuse der jeweiligen Gruppe. Bcl6 gilt als Haupttranskriptionsfaktor der Tfh-Zellen. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass BATF bei diesem Zelltyp eine wichtige Rolle spielt (s. 3.2.5.6). In der vorliegenden Arbeit konnte in Bezug auf die Transkriptionsfaktoren lediglich ein leichter Anstieg der Bcl6 Genexpression in tolerogenen IL-17A ko Mäusen im Vergleich zu tolerogenen wt Mäusen beobachtet werden. Auch verglichen mit asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen war die Bcl-6 mRNA Expression erhöht (s. Abb. 6-20 A). Die Induktion von Asthma mit dem Allergen OVA führte bei beiden Genotypen zu einer gesteigerten Batf mRNA Expression. Im Gegensatz zu den wt Mäusen konnte zwischen naiven und tolerogenen IL-17A(-/-) Mäusen auch ein signifikanter Anstieg der Genexpression dieses Transkriptionsfaktors beobachtet werden (s. Abb. 6-20 B). 125 Ergebnisse Abb. 6-20 Analyse der Transkriptionsfaktoren Bcl6 und Batf im Lungengewebe von tolerogenen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Am Ende des Experiments wurden die Lungen entnommen und nach RNA Extraktion und cDNA Synthese auf mRNA Ebene untersucht. A) Nach Induktion der Atemwegstoleranz wurde Bcl6 in Abwesenheit von IL-17A im Vergleich zu asthmatischen Tieren oder auch zu tolerogenen wt Mäusen tendenziell vermehrt exprimiert. B) Die Batf mRNA Expression stieg nach Asthmainduktion in beiden Genotypen deutlich an. Im Gegensatz zu wt Mäusen exprimierten auch tolerogene IL-17A ko Mäuse mehr Batf mRNA als unbehandelte IL-17A(-/-) Mäuse. Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren und in Richtung Tfh-Zellen einzuschränken, wurde die RNA aus den Lungen auch auf die für Tfh-Zellen typischen Oberflächenmarker CXCR5, IL-6R und IL-21R hin untersucht. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit OVA, sei es um Asthma oder aber um Toleranz zu induzieren, bei beiden Genotypen zu einem Rückgang der Cxcr5 mRNA Expression führte. Allerdings war dieser Vorgang bei IL-17A (-/-) Mäusen weniger stark ausgeprägt als bei wt Mäusen. So konnte beobachtet werden, dass sowohl asthmatische als auch tolerogene IL-17A ko Mäuse signifikant mehr Cxcr5 mRNA exprimierten als wt Mäuse (s. Abb. 6-21 A). Die Il-6r Genexpression schien in asthmatischen im Vergleich zu gesunden IL-17A (-/-) Mäusen verringert zu sein. Durch Induktion der Atemwegstoleranz kam es zu einer vermehrten Il-6r mRNA Expression, verglichen sowohl mit naiven und asthmatischen IL-17A (-/-) Mäusen als auch mit tolerogenen wt Mäusen. Bei Wildtyp-Mäusen konnte dagegen in keiner der drei zu untersuchenden Gruppen eine Veränderung beobachtet werden (s. Abb. 6-21 B). Die Induktion des allergischen Asthmas führte bei Wildtyp-Mäusen zu einem signifikanten Rückgang der Il-21r mRNA Expression. Im Toleranzmodell exprimierten 126 Ergebnisse Wildtyp-Mäuse dann wieder tendenziell mehr Il-21r mRNA als asthmatische wt Mäuse. In Abwesenheit von IL-17A lag sowohl im Vergleich zu naiven v. a. aber verglichen mit asthmatischen Tieren eine erhöhte Il-21r Genexpression vor (s. Abb. 6-21 C). Abb. 6-21 Untersuchung der Oberflächenmarker Cxcr5, Il-6r und Il-21r im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell: Aus dem Lungengewebe von naiven, asthmatischen und tolerogenen Mäusen wurde RNA isoliert und anschließend cDNA synthetisiert. Die weiteren Analysen erfolgten auf mRNA Ebene. A) Cxcr5 wurde in den Lungen gesunder wt und IL-17A ko Mäuse am stärksten exprimiert. In asthmatischen und tolerogenen Mäusen war ein Rückgang der Cxcr5 mRNA zu beobachten, wobei in beiden Gruppen IL-17A ko Mäuse mehr Cxcr5 mRNA bildeten als wt Mäuse. B und C) Sowohl die Il-6r mRNA als auch die Il-21r mRNA wurde im Toleranzmodell in Abwesenheit von IL-17A stärker exprimiert als in wt Mäusen. Verglichen mit unbehandelten und asthmatischen IL-17A ko Mäusen war ein tendenzieller Anstieg beider Faktoren zu erkennen. 6.3 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A in einem murinen Modell allergischen Asthmas Es ist bereits bekannt, dass eine Sensibilisierung durch Aeroallergene einer der stärksten Risikofaktoren für das Auslösen des allergischen Asthmas ist. Dabei spielen v. a. auch CD4+ T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. So geht man z. B. bei Th1-Zellen davon aus, dass 127 Ergebnisse sie eine protektive Funktion einnehmen (s. 3.2.5.1), wohingegen die Th2-Zellen für die typischen Asthmasymptome, wie beispielsweise bronchiale Hyperreaktivität verantwortlich sind (s. 3.2.5.2). Man nimmt außerdem an, dass virale Infektionen beim Verlauf dieser Erkrankung eine wichtige Rolle einnehmen (s. 3.1.2.3). Untersuchungen ergaben, dass IL-17A an mukosalen und epithelialen Abwehrmechanismen beteiligt ist. Außerdem geht man davon aus, dass Th17-Zellen und IL-17A die Immunpathophysiologie bei viralen Infekten modulieren. Allerdings ist ihre genaue Rolle dabei noch nicht vollständig geklärt. Um herauszufinden, ob das Zytokin IL-17A einen direkten Einfluss auf Gene der antiviralen Immunantwort hat, wurde zunächst ein Genearray durchgeführt. 6.3.1 Analyse der Genexpression in CD4+ T-Zellen der Lunge mittels Microarray CD4+ T-Lymphozyten wurden aus dem Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen isoliert und mittels Microarray-Analyse eingehender untersucht. Dazu wurden je drei Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäuse verwendet, bei denen zuvor Asthma induziert wurde. Die Analysen ergaben, dass die Abwesenheit von IL-17A in CD4+ T-Zellen zu einer signifikanten Verminderung der Oas1a, Oas1g, Oas1c, Cxcr3 und Rnasel, sowie einer erhöhten Genexpression von Ighg (Immunoglobulin heavy chain, gamma polypeptide), Il-6, PDC-Trem (PDC = plasmacytic dendritic cell, TREM = triggering receptor expressed on myeloid cells), Il-13 und Nfil3 (nuclear factor, IL-3 regulated) führte. Diese Gene können mit Entzündungsprozessen und/oder der antiviralen Immunantwort in Verbindung gebracht werden. In der Tabelle 6-1 sind die Ergebnisse der Microarray-Analyse aufgeführt. 128 Ergebnisse Tabelle 6-1 Ergebnisse des Microarrays: Die Analyse der CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe von erkrankten Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen ergab, dass in der Abwesenheit von IL-17A viele Gene reguliert sind, welche in der pro-/antiinflammatorischen und/oder der pro-/anti-viralen Immunantwort eine Rolle spielen. Die Darstellung der Ergebnisse erfolgte auch in Form einer sogenannten „Heat-map“. Dabei sind auf der linken Seite die Analyseproben der IL-17A defizienten Zellen zu sehen, auf der rechten Seite die der Wildtyp-Zellen. Rot bedeutet, dass eine Induktion der Genexpression vorliegt, wohingegen die blaue Farbe eine Reduktion anzeigt (s. Abb. 6-22 A). Die Ergebnisse der Microarray-Analyse sind zusätzlich noch als graphische Darstellung zu sehen (s. Abb. 6-22 B). 129 Ergebnisse Abb. 6-22 Heat-map und graphische Darstellung der Microarry-Analyse: A) Darstellung der Ergebnisse des Microarrays als Heat-map. Gene, deren Expression reduziert war, wurden in blau, eine induzierte Genexpression in rot dargestellt. B) Graphische Darstellung (Fold-change) der reduzierten und induzierten Genexpression in IL-17A defizienten Zellen. 6.3.2 Analyse der Oas1g mRNA Expression mittels qPCR Die Untersuchung der CD4+ T-Zellen aus der Lunge mit Hilfe des Microarrys ergab, dass eine IL-17A Defizienz sowohl Auswirkungen auf die beteiligten Gene einer Entzündungsreaktion, als auch auf die durch Viren induzierten Gene, insbesondere auf die Familienmitglieder der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase, hat. Im Folgenden lag nun der Fokus auf Oas1g, dessen Expression laut Microarray am stärksten von IL-17A abhing. Zunächst wurde die Genexpression in den CD4+ T-Lymphozyten der Lunge ermittelt, um so die Ergebnisse des Microarrays zu verifizieren. Die Analyse ergab einen signifikanten Rückgang der Oas1g mRNA Expression sowohl in gesunden, als auch in erkrankten IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen (s. Abb. 6-23 A). Weiterhin konnte beobachtet werden, dass die Asthmaerkrankung in Wildtyp-Mäusen zu einer verstärkten Genexpression führte (s. Abb. 6-23 A). Es konnte auch gezeigt werden, dass in Abwesenheit von IL-17A die Oas1a Genexpression sowohl mit als auch ohne OVA-Behandlung stark reduziert vorlag verglichen 130 Ergebnisse mit wt Kontrollmäusen. Auch hier nahm nach Behandlung mit dem Allergen die Oas1a mRNA Expression in den Wildtyp-Mäusen tendenziell zu. (s. Abb. 6-23 B). Abb. 6-23 Analyse der Oas1g und Oas1a mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: CD4+ T-Zellen wurden aus den Lungen von gesunden und kranken Wildtyp und IL-17A defizienten Mäusen isoliert und mittels qPCR analysiert. A) Die Oas1g mRNA Expression ist sowohl in behandelten als auch in unbehandelten IL-17A(-/-) Mäusen signifikant reduziert im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Die Asthmaerkrankung führte bei wt Mäusen zu einer verstärkten Genexpression. B) Auch die Genexpression von Oas1a ist in gesunden und kranken IL-17A(-/-) Mäusen inhibiert. Asthmatische wt Mäuse neigten zu einer vermehrten Oas1a mRNA Expression verglichen mit e gesunden wt Mäusen. Nachdem nachgewiesen werden konnte, dass das antiviral wirksame Gen Oas1g in IL-17A defizienten CD4+ T-Zellen der Lunge nahezu gar nicht exprimiert wurde, stellte sich die Frage, ob das nur für diesen Zelltyp galt. Aus diesem Grund wurde die Expression dieser 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase in weiteren Zelltypen, sowie im Lungen- und lymphatischen Gewebe untersucht. Zunächst wurden aus dem Lungengewebe und den Gesamtzellen der Lymphknoten RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben, um anschließend die Oas1g mRNA Expression zu ermitteln. Es zeigte sich, dass sowohl in unbehandelten als auch in behandelten IL-17A(-/-) Mäusen signifikant weniger der Oas1g mRNA exprimiert wurde als in Wildtyp-Mäusen. Dies galt sowohl für das gesamte Lungengewebe (s. Abb. 6-24 A) als auch für die Gesamtzellen der Lymphknoten (s. Abb. 6-24 B) 131 Ergebnisse Abb. 6-24 Analyse der Oas1g mRNA Expression im Lungengewebe und in den Lymphknotenzellen von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: Aus dem Lungengewebe und den Gesamtzellen der Lymphknoten wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR weiter analysiert. A) Die Oas1g mRNA war sowohl in naiven als auch asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen kaum nachweisbar. B) Die Analyse der Lymphknoten Gesamtzellen ergab eine signifikante Reduktion der Oas1g Genexpression sowohl in gesunden als auch in erkrankten IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu wt Mäusen. Auch in CD11c+ Lungenzellen von gesunden und erkrankten IL-17A ko Mäusen war die Oas1g mRNA Expression im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen gehemmt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen in CD4+ T-Zellen konnte in diesem Zelltyp nach Allergenkonfrontation kein Anstieg der Genexpression in wt Zellen beobachtet werden (s. Abb. 6-25 A). In ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark führte die IL-17A Defizienz ebenfalls zu einer Unterdrückung der Oas1g mRNA Expression (s. Abb. 6-25 B). Abb. 6-25 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD11c+ Lungenzellen im murinen Asthmamodell und in ausdifferenzierten Mastzellen des Knochenmarks von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen: Aus CD11c+ Lungenzellen und generierten Mastzellen wurde RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels qPCR weiter analysiert. A) In CD11c+ Lungenzellen war die Oas1g mRNA sowohl in naiven als auch in OVA-behandelten IL-17A(-/-) Mäusen signifikant reduziert. B) Die Untersuchung der Mastzellen, welche aus dem Knochemark generiert wurden, ergab eine signifikante Reduktion der Oas1g Genexpression in IL-17A defizienten Zellen im Vergleich zu wt Zellen. 132 Ergebnisse 6.3.3 Analyse der Ifn mRNA Expression in unterschiedlichen Zelltypen Wie in Abschnitt 3.4 beschrieben, wird der antivirale OAS1-RNaseL Signalweg durch Typ I Interferone (z. B. IFN-) induziert. Deshalb wurde die Ifn Genexpression eingehender untersucht. Zunächst erfolgte die Analyse der CD4+ T-Lymphozyten der Lunge, wobei ersichtlich wurde, dass in beiden Genotypen eine Behandlung mit dem Allergen OVA zu einer signifikanten Reduktion der Ifn Expression führte. Innerhalb der PBS-Gruppe wiesen die IL-17A defizienten Mäuse tendenziell geringere Ifn mRNA Werte auf, wobei dieser Unterschied nach Asthmainduktion nicht mehr erkennbar war (s. Abb. 6-26 A). In CD11c+ Zellen, welche ebenfalls aus den Gesamtzellen der Lunge aufgereinigt wurden, lag die Ifn mRNA Expression sowohl in gesunden als auch in erkrankten IL-17A(-/-) Tieren signifikant verringert vor. Nach Auslösen der Asthmaerkrankung wurde dieses Typ I Interferon in Wildtyp-Mäusen tendenziell verstärkt exprimiert verglichen mit unbehandelten Mäusen (s. Abb. 6-26 B). Weiterhin wurden die Mastzellen, welche über vier Wochen hinweg aus dem Knochenmark differenziert wurden, untersucht. Im Gegensatz zu den vorher beschriebenen CD4+ T-Zellen und CD11c+ Zellen aus der Lunge konnte hier kein Unterschied in der Genexpression festgestellt werden (s. Abb. 6-26 C). 133 Ergebnisse Abb. 6-26 Analyse der Ifn mRNA Expression in Wildtyp- und IL-17A defizienten Zellen: Aus den Gesamtzellen der Lunge wurden CD4+- und CD11c+ Zellen isoliert, um die Ifn mRNA Expression zu untersuchen. A) Die Behandlung mit OVA führte in beiden Mausstämmen zu einer signifikanten Reduktion der IfnGenexpression in CD4+ T-Zellen. Innerhalb der naiven Tiere schien eine IL-17A Defizienz zu einer verringerten IfnmRNA Menge zu führen. B) In IL-17A defizienten CD11c+ Zellen wurde die Ifn mRNA sowohl in behandelten als auch in unbehandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrolltieren weniger exprimiert. C) In ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark konnte kein Unterschied in der Ifn Genexpression nachgewiesen werden. 6.3.4 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen Wie in Abschnitt 3.2.6 bereits beschrieben, gehören CD8+ T-Lymphozyten zu den zytotoxischen Zellen. Diese sind besonders bei der Bekämpfung von virusinfizierten Zellen äußerst effektiv. Aufgrund dessen wurde mittels durchflusszytometrischer Analyse die Anzahl der CD8+ T-Zellen in dem zu untersuchenden Asthmamodell überprüft. Es stellte sich heraus, dass in naiven IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verringerte Anzahl an CD8+ T-Zellen in der Lunge vorlag (s. Abb. 6-27 A). Nach Behandlung mit dem Allergen nahm die Anzahl dieser Zellen innerhalb der IL-17A(-/-) Mäuse tendenziell zu, jedoch konnte kein Unterschied im Vergleich zu den Kontrolltieren beobachtet werden (s.Abb. 6-27 A). Aus den Lymphknoten beider Genotypen wurden ebenfalls die Gesamtzellen isoliert. Die 134 Ergebnisse Ergebnisse stimmten mit den Beobachtungen der Gesamtzellen der Lunge überein (s. Abb. 6-27 B). Abb. 6-27 Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell: Die Gesamtzellen der Lunge bzw. der Lymphknoten wurden mittels Durchflusszytometer auf den Anteil an CD8+ T-Lymphozyten hin untersucht. Es zeigte sich, dass IL-17A(-/-) Mäuse im gesunden Zustand sowohl in den Lungenzellen (A) als auch in den Lymphknotenzellen (B) weniger CD8+ T-Lymphozyten aufwiesen. Nach Behandlung der IL-17A defizienten Mäuse mit OVA nahm die Anzahl der CD8+ T-Zellen sowohl in den Gesamtzellen der Lunge (A) als auch den Gesamtzellen der Lymphknoten (B) tendenziell zu. 6.3.5 Unterdrückung der Il-17a Genexpression mittels siRNA Wie die vorherigen Untersuchungen zeigen konnten, scheint die antivirale Wirkung des Zytokins IL-17A in Zusammenhang mit der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase zu stehen. Um herauszufinden, ob IL-17A dieses Enzym direkt oder indirekt beeinflusst, wurden CD4+ T-Zellen aus den Gesamtzellen der Milz von Wildtyp-Mäusen mit Il-17a siRNA transfiziert (s. 5.2.3.10). Zunächst wurde überprüft, ob mittels der verwendeten siRNA tatsächlich die Il-17a Genexpression unterdrückt werden kann. Da erfahrungsgemäß naive 135 Ergebnisse Zellen nur sehr wenig IL-17A sezernieren und der Effizienznachweis der Il-17a siRNA dadurch erschwert werden könnte, wurden die Zellen zunächst zu Th17-Zellen differenziert (s. 5.2.3.10). Anschließend wurde in die zu Th17-Zellen differenzierten Zellen die Il-17a siRNA eingeschleust und für 24 Stunden kultiviert. Nachfolgend wurde in den Zellkulturüberständen die Konzentration des IL-17A Proteins ermittelt. Hierbei dienten zum einen die geskewten Zellen ohne siRNA (=SN Th17 Skewing), sowie die für weitere 24 h unstimulierten Zellen (=unst.) als Kontrolle. Weiterhin wurden die Überständer der mit siRNA alleine (= Il-17a siRNA) und zusammen mit GFP (= Il-17a siRNA + GFP) behandelten Zellen analysiert. Als zusätzliche Kontrolle diente die Kondition mit Il-17a siRNA, jedoch ohne den für die Transfektion notwendigen Puls (= Il-17a siRNA –Puls; s. 3.2.2.9). Anschließend wurde unter dem Mikroskop gezeigt, dass die Transfektion erfolgreich und das GFP-Signal detektierbar war (s. Abb. 6-28 A). Die IL-17A Proteinkonzentration wurde mit Hilfe eines ELISAs ermittelt. Es zeigte sich, dass in den Überständen des Th17 Skewings die größte Konzentration an IL-17A enthalten war, wohingegen die Einschleusung der siRNA zu signifikant verminderten Konzentrationen an IL-17A führte, wie die erhaltenen Konzentrationen in den Überständen „Il-17a siRNA“ bzw. „Il-17a siRNA + GFP zeigten“. Man konnte zwar auch einen signifikanten Rückgang der IL-17A Konzentration in den Überständen der „unst.“ Kondition erkennen, jedoch produzierten die Zellen dieser Kondition immer noch signifikant mehr Proteine als die mit der Il-17a siRNA transfizierten Zellen (s. Abb. 6-28 B). 136 Ergebnisse Abb. 6-28 Analyse der IL-17A Konzentration in den Zellkulturüberständen der CD4+ T-Zellen der Milz nach Transfektion mit Il-17a siRNA: CD4+ T-Zellen der Milz wurden zunächst zu Th17-Zellen differenziert. Die Überstände wurden zur Bestimmung der IL-17A Konzentration verwendet, die Zellen wurden mit Il-17a siRNA mit und ohne GFP Vektor transfiziert. Als Kontrolle diente zum einen eine Kondition, ohne notwendigen Puls sowie unstimulierte Th17-Zellen. A) Mikroskopischer Nachweis des GFP-Signals in transfizierten Zellen (obere Abbildung: Vergößerung 40x, untere Abbildung: Vergrößerung 63x) B) Nach Transfektion mit der siRNA sezernierten die Zellen weniger IL-17A verglichen mit den freigesetzten Mengen direkt nach dem Skewing bzw.von unbehandelten Zellen. Da nun gewährleistet war, dass die verwendete Il-17a siRNA die Genexpression hemmte, wurde in einem neuen Versuchsansatz überprüft, ob man unter Benutzung der Il-17a siRNA die Genexpression von Oas1g unterdrücken kann. So wurden CD4+ T-Zellen aus den Gesamtzellen der Milz von Wildtyp-Mäusen isoliert und für 24 h in Gegenwart von rIL-6 kultiviert. In diesem Fall wurde nur rIL-6 als Stimulus verwendet, um so die IL-17A Produktion zu fördern. Zum einen wurden Zellen analysiert, die mit Il-17a siRNA transfiziert wurden (= Il-17a siRNA), zum anderen Zellen, in die nur der GFP Vektor eingeschleust wurde (= GFP). Als weitere Kontrolle dienten Zellen, zu denen zwar der GFP Vektor gegeben wurde, jedoch der nötige Puls fehlte, um das GFP in die Zellen einzubringen (= GFP – Puls). Nach RNA-Extraktion und cDNA-Synthese wurde die Genexpression von Oas1g mittels der qPCR Methode ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Oas1g Gens in den Zellen nach Transfektion mit der siRNA unterdrückt wurde, wie aus dem Vergleich mit den beiden Kontrollkonditionen (GFP bzw. GFP –Puls) ersichtlich wurde (s. Abb. 6-29). 137 Ergebnisse Abb. 6-29 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz nach Kultur und Transfektion mit Il-17a siRNA: CD4+ T-Zellen wurden aus den Milzzellen von naiven Wiltyp-Mäusen isoliert und 24 h in Anwesenheit von rIL-6 kultiviert. Anschließend wurden sie entweder mit Il-17a siRNA oder GFP Vektor transfiziert. Als Kontrolle diente eine Kondition, bei der GFP zugegeben wurde, jedoch der für die Transfektion nötige Puls fehlte. Es konnte eine Reduktion der Oas1g mRNA Expression nach Transfektion mit Il-17a siRNA beobachtet werden. Um den Effekt der Il-17a siRNA weiter untersuchen zu können, wurden Wildtyp-Mäuse mit dem Allergen OVA behandelt, um so eine Asthmaerkrankung auszulösen (s. 5.2.3.2), was erfahrungsgemäß zu einem Anstieg der IL-17A Produktion führt. Anschließend wurden die Milzen entnommen, die Gesamtzellen isoliert und die CD4+ T-Zellen aufgereinigt. Diese CD4+ T-Zellen wurden daraufhin sofort mit Il-17a siRNA transfiziert (= Il-17a siRNA). Als Kontrolle dienten zum einen Zellen, bei denen sowohl die siRNA als auch GFP zugegeben wurde, jedoch der nötige Puls zum Einschleusen fehlte (= Il-17a siRNA – Puls) und zum anderen komplett unstimulierte Zellen (= unst.). Unter diesen drei verschiedenen Konditionen wurden die Zellen für 24 h kultiviert. Die Analyse der Oas1g mRNA Expression zeigte eine tendenzielle Abnahme der Genexpression nach Transfektion mit der siRNA im Vergleich zu unstimulierten Zellen (s. Abb. 6-30). 138 Ergebnisse Abb. 6-30 Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz von asthmatischen Wildtyp Mäusen nach in vitro Transfektion mit Il-17a siRNA: Bei Wildtyp Mäusen wurde Asthma induziert und anschließend die Milz entnommen, um aus den Gesamtzellen CD4+ T-Zellen zu isolieren. Im Anschluss daran wurden die Zellen entweder mit Il-17a siRNA transfiziert, oder im unbehandelten Zustand ausplattiert. Als weitere Kontrollkondition dienten Zellen, zu denen die siRNA zugesetzt wurde, jedoch der für die Transfektion nötige Puls fehlte. Nach Transfektion mit der Il-17a siRNA exprimierten die Zellen tendenziell weniger Oas1g mRNA als die unstimulierten Zellen. 6.3.6 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Interleukins 17A nach Infektion verschiedener Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b Virale Infektionen, insbesondere durch Rhinoviren verursachte, gehören zu den häufigsten Auslösern von Exazerbationen bei einer bestehenden Asthmaerkrankung. Zu den über 100 verschiedenen Serotypen der Rhinovirus-Familie gehört auch der RV1b. Er zählt zu der kleineren der beiden Rhinovirusgruppen und bindet sowohl an die humanen als auch die murinen Proteine der LDL-Rezeptorengruppe (Bartlett et al., 2008). Wie anhand der vorherigen Ergebnisse gezeigt werden konnte, steht das Zytokin IL-17A mit Komponenten der antiviralen Immunantwort in Verbindung. Aus diesem Grund wurden für die folgenden Analysen unterschiedliche Zelltypen mit dem Rhinovirus 1b infiziert und die darauf folgende Immunantwort untersucht. 139 Ergebnisse 6.3.6.1 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von Mastzellen mit dem Rhinovirus 1b Wie in Abschnitt 5.2.3.11 beschrieben, wurde aus den Ober- und Unterschenkelknochen von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen das Knochenmark isoliert, um daraus über vier Wochen hinweg Mastzellen zu differenzieren. Nach Beendigung der Kultur wurden die Zellen mit dem RV1b infiziert und für 24 h kultiviert (s. 5.2.4). Anschließend wurden die Überstände für weitere Untersuchungen abgenommen und aus den Zellen die RNA extrahiert, welche anschließend in cDNA umgeschrieben wurde. Zunächst erfolgte mit Hilfe der PCR Analyse (s. 5.2.5) der Nachweis, dass die Zellen mit dem RV1b infiziert wurden. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die IL-17A defizienten Mastzellen signifikant stärker infiziert waren als die Zellen ohne Gendefekt. Daraus lässt sich schließen, dass diese Zellen nicht gegen die Virusinfektion vorgehen konnten (s. Abb. 6-31 A und B). Abb. 6-31 Analyse der Viruslast in Mastzellen nach Infektion mit dem RV1b: Aus dem Knochenmark von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen wurden Mastzellen generiert, mit RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Anschließend wurde mittels PCR (A) die Viruslast ermittelt. B) Es zeigte sich, dass die Zellen in Abwesenheit von IL-17A eine signifikant erhöhte Viruslast aufwiesen. Picornaviren, darunter auch der RV1b, gehören zu den zytopathogenen Viren, da sie bei infizierten Zellen eine morphologische Änderung verursachen. Dies bedeutet, dass die Zellen abgerundet und aus dem Zellverband losgelöst werden. Anschließend erfolgt ihre Lyse. 140 Ergebnisse Dieser Vorgang wird als zytopathischer Effekt bezeichnet (Baron, 1996; Deszcz et al., 2005). Daher wurde die LDH Aktivität bestimmt, um herauszufinden, welchen Schaden die Infektion mit dem RV1b mit sich bringt. Zu diesem Zweck wurden die Zellkulturüberstände von Mastzellen untersucht, welche zuvor mit dem RV1b infiziert wurden. Als Kontrolle dienten nicht-infizierte Mastzellen (s. 5.2.11). Es konnte beobachtet werden, dass bereits in den Überständen unbehandelter IL-17A defizienter Mastzellen eine signifikant erhöhte LDH Aktivität vorlag als in den Überständen der wt Zellen. Die Virusinfektion führte dann dazu, dass v. a. wt Zellen vermehrt zu Grunde gingen, was sich in einer verstärkten LDH Aktivität widerspiegelte. Beim Vergleich der infizierten IL-17A(-/-) Zellen mit unbehandelten IL-17A defizienten oder infizierten Wildtyp-Zellen konnten keine Unterschiede in der LDH Aktivität detektiert werden (s. Abb. 6-32). Abb. 6-32 Analyse der LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen generierter Mastzellen vor bzw. nach Infektion mit dem RV1b: Die ausdifferenzierten Mastzellen aus dem Knochenmark von wt- bzw. IL-17A(-/-) Mäusen wurden mit dem RV1b infiziert und anschließend die LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen analysiert. Bereits ohne vorherige Infektion mit dem RV war in den Überständen der IL-17A defizienten Zellen eine erhöhte LDH Aktivität nachweisbar in Vergleich zu den wt Kontrollzellen. Die Infektion führte bei diesen Zellen zu keiner weiteren Steigerung der LDH Aktivität. Bei den wt Zellen rief die Infektion mit dem RV1b ein vermehrtes Zellsterben hervor, was sich in einer erhöhten LDH Aktivität widerspiegelte. Wie zuvor bereits gezeigt (s.Abb. 6-25), exprimierten IL-17A defiziente Mastzellen aus dem Knochenmark signifikant weniger Oas1g mRNA, wobei keine signifkanten Unterschiede in der Ifn Expression nachweisbar waren (s. Abb. 6-26). Die Expression dieser beiden Gene, welche bei der antiviralen Immunantwort eine essentielle Rolle spielen, wurden auch nach der Infektion mit dem RV1b analysiert. Die Inkubation mit dem RV1b führte in den Wildtyp141 Ergebnisse Zellen zu einer Erhöhung der Ifn mRNA Expression im Vergleich zu nicht infizierten Zellen, was auf eine normale antivirale Immunantwort schließen lässt (s. Abb. 6-33 A). Auch in den Zellen mit einem IL-17A Gendefekt hatte der Kontakt mit dem RV1b einen tendenziellen Anstieg der Ifn Genexpression zur Folge (s. Abb. 6-33 A). Die Untersuchung des antiviralen Gens Oas1g auf mRNA Ebene ergab jedoch, dass auch eine Virusinfektion den Defekt dieser Synthetase in IL-17A defizienten Zellen nicht zurücksetzen kann, sodass die Oas1g mRNA auch in den infizierten Zellen nicht nachweisbar war (s. Abb. 6-33 B). Abb. 6-33 Analyse der Ifn und Oas1g mRNA Expression in infizierten, generierten Mastzellen: Aus dem Knochenmark von wt- und IL-17A(-/-) Mäusen wurden Mastzellen differenziert und anschließend mit dem RV1b infiziert. Auf mRNA Ebene wurden Ifn und Oas1g weiter untersucht. (A) Die Infektion mit dem RV1b führte in wt Zellen zu einer signifikant gesteigerten Expression von Ifn. Auch bei IL-17A defizienten Zellen kam es tendenziell zu einer Erhöhung der Expremierung. B) Trotz viraler Infektion konnte in den IL-17A defizienten Zellen keine Oas1g mRNA nachgewiesen werden. 6.3.6.2 Analyse der antiviralen Immunantwort nach Infektion von CD4+ T-Zellen der Lunge mit dem Rhinovirus 1b Die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von CD4+ T-Lymphozyten erfolgt nach Aufnahme, Prozessierung und Präsentation von Antigenen durch APCs (s. 3.2). Außerdem hat man herausgefunden, dass Rhinoviren die Antigen-Präsentation umgehen können und so humane T-Zellen direkt infizieren und aktivieren können (Ilarraza et al., 2013). Um die Rolle des Zytokins IL-17A in Zusammenhang mit viralen Infektionen und Asthma bronchiale auf der Ebene von CD4+ T-Zellen zu untersuchen, wurden diese Zellen aus den 142 Ergebnisse Gesamtzellen der Lunge von gesunden und an Asthma erkrankten Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen isoliert und mit dem RV1b infiziert. Nach 24 h Zellkultur wurde die RNA der Zellen näher untersucht. Zunächst wurde mittels PCR bestätigt, dass die Infektion mit dem RV1b erfolgreich verlaufen ist (s. Abb. 6-34 A). Anschließend erfolgte mit Hilfe der erhaltenen Banden die genauere Bestimmung der Viruslast. Diese Analyse ergab, dass innerhalb der gesunden Gruppe die IL-17A defizienten CD4+ T-Zellen eine höhere Viruslast aufwiesen als die Zellen ohne Gendefekt (s. Abb. 6-34 B). Die Behandlung mit OVA führte dazu, dass die CD4+ T-Zellen, welche aus den Lungen erkrankter Wildtyp-Mäuse isoliert wurden, nicht mehr so effektiv gegen den Virus vorgehen konnten, was sich in einer gesteigerten Viruslast im Vergleich zu gesunden Wildtyp-Zellen widerspiegelte. Der Gendefekt zusammen mit der OVA-Behandlung in vivo und der viralen Infektion in vitro ergab jedoch keinen weiteren Anstieg der viralen Infektion in den CD4+ T-Zellen, sodass innerhalb der Asthmagruppe keine Unterschiede zwischen Wildtyp- und IL-17A defizienten Zellen nachweisbar war. Dies lässt darauf schließen, dass eine Vorbelastung mit einem Allergen die virale Immunantwort in Wildtyp-Zellen beeinträchtigte (s. Abb. 6-34 B). Abb. 6-34 Analyse virusinfizierter CD4+ T-Zellen im murinen Asthmamodell: Aus den Lungengesamtzellen von gesunden und asthmatischen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen wurden CD4+ T-Zellen aufgereinigt und anschließend mit dem RV1b infiziert. A) Mittels PCR-Analyse wurde bestätigt, dass die Infektion bei allen Analyseproben erfolgreich verlaufen war. B) Die Quantifizierung der erhaltenen PCR-Banden zeigte, dass IL-17A(-/-) CD4+ T-Zellen von gesunden Mäusen im Gegensatz zu den Zellen aus wt Mäusen eine erhöhte Viruslast aufwiesen. Die Behandlung mit OVA führte bei anschließender in vitro Infektion mit dem RV1b nur bei Wildtyp CD4+ T-Zellen zu einer weiteren Steigerung der Viruslast. 143 Ergebnisse Wie in Abb. 6-26 A (s. Abschnitt 6.3.3) bereits gezeigt werden konnte, führte eine Allergendisposition bei Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäuse zu einer verminderten IfnGenexpression. Da Typ I Interferone durch Viren induziert werden (Randall and Goodbourn, 2008), sollte nun untersucht werden, ob der vorher beschriebene Defekt nach einer viralen Infektion weiterhin bestehen bleibt. Zu diesem Zweck wurden die CD4+ T-Zellen der Lunge von naiven und asthmatischen Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen mit dem RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Die nachfolgenden Analysen mittels qPCR ergaben, dass die durch Allergendisposition ausgelöste Suppression des Typ I Interferons auch durch die virale Infektion nicht ausgeglichen werden konnte (s. Abb. 6-35 A). So wiesen IL-17A defiziente CD4+ T-Lymphozyten von asthmatischen Mäusen signifikant weniger Ifn mRNA auf als die Zellen der naiven IL-17A(-/-) Mäuse nach Inkubation mit dem RV1b. Eine ähnliche Tendenz konnte auch bei den Wildtyp-Zellen beobachtet werden. Dennoch kam es innerhalb der PBS-Gruppe durch Infektion mit dem RV1b zu einem signifikanten (IL-17A(-/-) Mäuse) bzw. zu einem tendenziellen (Wildtyp-Mäuse) Anstieg der Ifn mRNA Expression. Innerhalb der OVA-Gruppe neigten nur die CD4+ T-Zellen ohne IL-17A Defekt zu einer vermehrten Ifn mRNA Bildung nach Kontakt mit dem Virus (s. Abb. 6-35 A). Dessen ungeachtet verblieb die Oas1g Genexpression bei den Wildtyp-Mäusen in jeder Kondition auf einem ähnlichen Niveau, wohingegen in den IL-17A defizienten Zellen dieses antivirale Gen zu keinem Zeitpunkt nachweisbar war (s. Abb. 6-35 B). 144 Ergebnisse Abb. 6-35 Ifn und Oas1g Genexpressions-Analyse in CD4+ Lungenzellen von naiven und asthmatischen Wildtypund IL-17A defizienten Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b: Aus den Lungen von naiven und mit Allergen behandelten Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen wurden CD4+ T-Zellen isoliert und in vitro mit dem RV1b infiziert. Nach 24 h Zellkultur erfolgte die Genexpressions-Analyse. A) Nach viraler Infektion kam es in naiven wt- und IL-17A(-/-) Zellen zur vermehrten Ifn Expression. Ähnlich wie bei nicht infizierten Zellen führte eine vorherige Allergenbehandlung zu einer Suppression der Genexpression in beiden Genotypen. B) Bei Wildtyp-CD4+ T-Zellen war die Bildung der Ifn mRNA unabhängig von Allergenbehandlung und Virusinfektion. In den IL-17A defizienten Zellen konnte Oas1g in keiner der analysierten Konditionen nachgewiesen werden. Um herauszufinden, weshalb bei Wildtyp-Zellen ein bestehendes allergisches Asthma in Kombination mit einer Virusinfektion zu einer erhöhten Viruslast führte, wurden die Zellkulturüberstände dieser Zellen näher analysiert. So zeigte sich, dass der RV1b bei allergenspezifischen CD4+ T-Zellen aus der Lunge die IL-17A Freisetzung unterdrückte (s. Abb. 6-36). Abb. 6-36 Analyse der IL-17A Freisetzung allergenspezifischer CD4+ T-Zellen aus der Lunge von Wildtyp Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b: CD4+ T-Lymphozyten wurden aus den Gesamtzellen der Lunge von asthmatischen Wildtyp-Mäusen isoliert, mit RV1b infiziert und für 24 h kultiviert. Anschließend wurde die Konzentration an IL-17A in den Zellkulturüberständen analysiert. Es zeigte sich, dass der RV1b bei allergenspezifischen CD4 + T-Zellen die Freisetzung des Zytokins IL-17A unterdrückt. 145 Ergebnisse 6.4 Die Rolle des Interleukins 17A im Krankheitsbild Asthma bronchiale bei Vorschulkindern Bei Vorschulkindern basiert die Diagnose des Asthma bronchiale meist auf den auftretenden Symptomen, vorhandenen Risikofaktoren und dem Ansprechen auf Therapiemaßnahmen. Das typische Krankheitsbild bei dieser Altersgruppe besteht aus kurzen, aber wiederkehrenden Episoden von Husten und Giemen (Keuchen), welche häufig durch Infektionen der Atemwege ausgelöst werden. Im Gegensatz zu älteren Kindern sind die Vorschulkinder durch diese Symptome jedoch relativ wenig beeinträchtigt. Auf molekularer Ebene stehen bei Kindern, ähnlich wie bei Erwachsenen, die Th2-Zellen und deren Zytokine im Vordergrund. Man geht aber davon aus, dass in dieser Altersgruppe auch Th17-Zellen und IL-17A bereits eine wichtige Rolle spielen, da man z. B. bei Kindern mit schwerem Asthma einen Anstieg der IL17A Genexpression nachweisen konnte (Fitzpatrick et al., 2010; Bacharier and Guilbert, 2012; Alyasin et al., 2013). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit und im Zuge der PreDicta Studie (s 5.2.1) wurden in Zusammenarbeit mit der Kinder- und Jugendklinik Erlangen gesunde und an Asthma bronchiale erkrankte Kinder im Alter von vier bis sechs Jahren untersucht. Besonderer Fokus lag auf der Analyse der PBMCs aus dem Blut dieser Kinder. Bei den Analysen wurde weiterhin berücksichtigt, ob im jeweilig abgenommenen Nasopharynxabstrich Rhinoviren nachweisbar waren. In Erlangen nahmen 22 gesunde Kinder (Kontrollkinder) und 24 an Asthma bronchiale erkrankte Kinder (Asthmakinder) an der PreDicta-Studie teil (s. 5.1.9). Die Kontrollkinder waren zu Studienbeginn im Durchschnitt 4,6 Jahre alt (SEM ± 0,2 Jahre), die Asthmakinder 4,8 Jahre (SEM ± 0,1 Jahr; s. 5.1.9). Die Kontrollgruppe bestand aus 13 Jungen und neun Mädchen, die Asthmagruppe aus 15 Jungen und ebenfalls neun Mädchen (s. 5.1.9). Bei 10 Kindern der Kontrollgruppe konnte eine Rhinovirusinfektion im oberen Respirationstrakt 146 Ergebnisse nachgewiesen werden (s. 5.1.9). Bei vier Kindern dieser Gruppe was das Testergebnis nicht eindeutig. Elf der an Asthma bronchiale erkrankten Kinder wurden positiv auf eine Rhinoviren getestet. Bei zwei Kindern dieser Gruppe konnte kein aussagekräftiges Ergebnis erzielt werden (s. 5.1.9). Innerhalb der Asthmagruppe wurden vier Kinder nur mit Steroiden behandelt, wohingegen 13 Kinder eine Kombinationstherapie aus einem steroidalen und einem nicht-steroidalen Medikament erhielten. Bei zwei Kindern der Asthmagruppe war eine nicht-steroidale Behandlung vorgesehen und drei Kinder erhielten nur im akuten Notfall Rescue Medikamente (s. 5.1.9). 6.4.1 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 Genexpression in PBMCs Da im murinen Modell bereits gezeigt werden konnte, dass zwischen dem Zytokin IL-17A und dem antiviralen Gen OAS1 ein Zusammenhang zu bestehen scheint, wurden diese beiden Faktoren auch in den humanen Analyseproben untersucht. Dazu wurden aus dem Vollblut gesunder und erkrankter Kinder PBMCs isoliert. Anschließend wurden diese zum einen für 24 h in Anwesenheit von CD3 und CD28 Antikörpern kultiviert, um die IL-17A Freisetzung analysieren zu können. Zum anderen kultivierte man die Zellen ohne weitere Stimuli für 48 h, um nachfolgend die RNA zu isolieren und Expressionsanalysen durchzuführen. Nach 24 h Kultur sezernierten PBMCs von asthmatischen Kindern, welche ein positives Testergebnis für Rhinoviren im Nasopharynxabstrich hatten, signifikant weniger IL-17A als Kinder mit Asthma, die nicht durch Rhinoviren belastet waren (s. Abb. 6-37 A). Weiterhin ergab sich, dass die OAS1 mRNA Expression in diesen Kindern ebenfalls reduziert vorlag (s. Abb. 6-37 B). 147 Ergebnisse Abb. 6-37 Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 mRNA Expression in PBMCs von Vorschulkindern: PBMCs aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern wurden entweder für 24 h oder 48 h kultiviert. A) Nach 24 h Zellkultur wurde die IL-17A Proteinkonzentration ermittelt. Es zeigte sich, dass die PBMCs von Kindern mit Asthma, welche in vivo mit Rhinoviren belastet waren, weniger IL-17A freisetzten. B) Nach 48 h Zellkultur wurde aus den PBMCs die RNA isoliert, um die OAS1 Genexpression zu untersuchen. Die PBMCs von Kindern mit Asthma, welche positiv auf Rhinoviren getestet wurden, exprimierten signifikant weniger OAS1 mRNA im Vergleich zu Kindern mit Asthma, welche nicht mit Rhinoviren belastet waren. 6.4.2 Analyse der IFN und TYK2 Genexpression in PBMCs Die Interferone sind die wichtigsten Bestandteile der antiviralen Immunantwort. Sie initiieren den antiviralen OAS-RNaseL-Signalweg, wobei die Signaltransduktion u. a. über Tyk-2 weiter vermittelt wird. Um herauszufinden, ob die Ursache für die reduzierte OAS1 mRNA Expression eine beeinträchtigte Signalkaskade war, wurde sowohl die IFN als auch TYK2 Genexpression untersucht. Die Analyse der PBMCs auf mRNA Ebene ergab, dass IFNbei Kindern mit Asthma, welche zum Zeitpunkt der Untersuchung in den oberen Atemwegen eine Rhinovirusinfektion aufwiesen, vermehrt gebildet wurde (s. Abb. 6-38 A). Dies hatte allerdings keine Auswirkungen auf die Expression der nachgeschalteten Tyrosinkinase TYK2 (s. Abb. 6-38 B). 148 Ergebnisse Abb. 6-38 Analyse der IFNund TYK2 Genexpression in PBMCs von Vorschulkindern: Nach 48 h Zellkultur wurde aus den isolierten PBMCs die RNA extrahiert, in cDNA umgeschrieben und die IFN bzw. TYK2 Genexpression untersucht. A) Kinder mit Asthma, deren Nasenabstrich positiv auf Rhinoviren getestet wurde, wiesen mehr IFN mRNA auf als asthmatische Kinder mit negativem Testergebnis. B) Die TYK2 Genexpression wurde in den untersuchten Kontroll- und Asthmakindern nicht von Rhinoviren oder Asthma bronchiale beeinflusst. 6.4.3 Analyse von IL-17A-inhibierenden Faktoren Nachdem geklärt wurde, dass die verminderte Bildung der OAS1 mRNA nicht auf eine Beeinträchtigung des Interferonsignals zurückzuführen ist, wurden als nächstes Faktoren analysiert, welche IL-17A negativ beeinflussen, da aufgrund der vorherigen Ergebnisse davon ausgegangen wurde, dass IL-17A und OAS1 im direkten Zusammenhang stehen. Dazu wurden die beiden Transkriptionsfaktoren T-BET und ETS1 untersucht, von denen bekannt ist, dass sie IL-17A supprimieren (Moisan et al., 2007; Reppert et al., 2011; Yeh et al., 2014). Dazu wurden die PBMCs von gesunden und an Asthma erkrankten Kindern für 48 h kultiviert, die RNA der Zellen extrahiert und auf mRNA Ebene weiter untersucht. Es zeigte sich, dass bei Kindern mit Asthma eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen eine gesteigerte T-BET mRNA Expression zur Folge hatte (s. Abb. 6-39 A). Auch die ETS1 mRNA wurde in diesen Kindern tendenziell vermehrt gebildet (s. Abb. 6-39 B). 149 Ergebnisse Abb. 6-39 Analyse der T-BET und ETS1 Genexpression in gesunden und an Asthma erkrankten Vorschulkindern: PBMCs aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern wurden nach 48 h Zellkultur auf der mRNA Ebene untersucht. A) Die PBMCs von Kindern mit Asthma und mit einer Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen exprimierten signifkant mehr T-BET mRNA im Vergleich zu Asthmakindern ohne Rhinovirusinfektion. B) Der Transkriptionsfaktor ETS1 wurde in Kindern mit Asthma und einem positiven Rhinovirusnachweis in Nasopharynxabstrich tendenziell vermehrt gebildet. In der entsprechenden Gruppe der Kontrollkinder wurde kein Unterschied in der ETS1 mRNA Expression gefunden. Bisherige Studien zeigten, dass T-BET in CD4+ T-Zellen von Kindern mit Asthma vermindert exprimiert wurde (Munthe-Kaas et al., 2008), wohingegen IL-6 bei Patienten mit Asthma vermehrt gebildet wurde (Broide et al., 1992; Marini et al., 1992; Yokoyama et al., 1995).Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, dass es bei Kindern mit Asthma eine inverse Korrelation zwischen T-BET und IL-6 gibt. Dies bedeutet, dass in diesen Kindern eine reduzierte T-BET Genexpression mit dazu relativ erhöhten IL-6 mRNA Werten einhergeht (Koch et al., 2013). Aufgrund dieser vorherigen Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe, wurden in der vorliegenden Arbeit die Expressionswerte unter Berücksichtigung einer viralen Infektion in den oberen Atemwegen weiter analysiert. So konnte beobachtet werden, dass bei Kontrollkindern mit positivem Testergebnis für Rhinoviren im Nasenabstrich ebenfalls eine inverse Korrelation der IL-6 und T-BET mRNA Expression vorlag (s. Abb. 6-40). Bei Kindern mit Asthma und einer Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen konnte dieser Trend zwar immer noch beobachtet werden, allerdings nicht mehr so stark ausgeprägt, wie bei den Kontrollkindern (s. Abb. 6-40). 150 Ergebnisse Abb. 6-40 Korrelation der IL-6 und T-BET mRNA Expression in den PBMCs von Kontroll- und Asthmakindern mit positiven Rhinovirusnachweis im Nasenabstrich: Aus dem Vollblut von Kontroll- und Asthmakindern, bei welchen Rhinoviren im Nasopharynxabstrich nachgewiesen werden konnten, wurden PBMCs isoliert. Nach Extraktion der RNA wurde auf mRNA Ebene die Expression von IL-6 und T-BET analysiert und miteinander korreliert. Es zeigte sich, dass sowohl bei gesunden Kindern als auch bei Kindern mit Asthma eine inverse Korrelation vorlag, wobei diese bei den Kontrollkindern stärker ausgeprägt war. 6.4.4 Analyse der antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A in der humanen Epithelzellline A549 In den Atemwegen gehören Epithelzellen zu den ersten Zelltypen, die mit Krankheitserregern in Kontakt treten. Unter Berücksichtigung der vorherigen Ergebnisse in murinen und humanen Analyseproben, wurden unter Verwendung der humanen Epithelzelllinie A549 die antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A weiter untersucht. Zu diesem Zweck erfolgte zunächst eine Infektion der A549 Zellen mit dem RV1b (s. 5.2.4) mit anschließender 24stündiger Zellkultur in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von rIL-17A (s. 5.2.2). Die Analyse der Viruslast mittels PCR zeigte, dass IL-17A konzentrationsabhängig die intrazelluläre Replikation des RV1b unterdrückte (s. Abb. 6-41 A und B), ohne dabei die LDH Aktivität nennenswert zu beeinflussen (s. Abb. 6-41 C). Zusätzlich konnte auf mRNA Ebene beobachtet werden, dass es bei der spezifischen Konzentration von 25 ng/ml rIL-17A zu einem signifikanten Anstieg der antiviralen Oas1g Expressionswerte kam (s. Abb. 6-41 D). 151 Ergebnisse Abb. 6-41 Analyse humaner A549 Zellen nach Infektion mit dem RV1b und Zellkultur mit unterschiedlichen Konzentrationen rIL-17A: Zellen der humanen Epithelzellline A549 wurden zunächst mit dem RV1b infiziert und danach für 24 h in Anwesenheit ansteigender Dosen rIL-17A kultiviert. A und B) Die Analyse der Viruslast mittels PCR ergab eine dosisabhängige Suppression der viralen Replikation in A549 Zellen. C) Die LDH Aktivität wurde nur bei einer Konzentration von 12,5 ng/ml rIL-17A signifikant vermindert. D) Die Expression von OAS1 wurde bei einer definierten Menge von 25 ng/ml rIL-17A nach Virusinfektion induziert. (Bei der Auswertung der OAS1 Genexpression mittels der ∆∆ct-Methode, wurden die Konditionen „12,5 / 25 / 50 -RV1b“ auf die Kondition „unstimuliert –RV1b“ bezogen, die Konditionen „12,5 / 25 / 50 +RV1b“ wurden auf die Kondition „unstimuliert + RV1b“ bezogen. So ergibt sich, dass + p ≤ 0,05 verglichen mit Kondition „50 ng/ml rIL-17A –RV1b“ und # p ≤ 0,05 verglichen mit Kondition „25ng/ml rIL-17A +RV1b“ bedeutet.) 152 Ergebnisse 6.4.5 Analyse der Einflussnahme von Arzneimitteln auf die antivirale Immunantwort Wie in Kapitel 3.1.5 beschrieben, wird das Asthma bronchiale hauptsächlich mit inhalativen Corticosteroiden oder kurz- und langwirksamen β2-Sympathomimetika behandelt. Im Falle einer Verschlimmerung der Symptome, welche z. B. durch eine virale Infektion hervorgerufen werden können, kann es kurzfristig zu einer Erhöhung der einzunehmenden Dosis kommen oder zur Anwendung inhalativer Glucocorticoide (= Steroide), falls diese in der sonstigen Therapie noch nicht verwendet werden. Grundsätzlich dienen diese Medikamente der Unterdrückung der Entzündungsreaktion (Steroide) bzw. der Erweiterung der Bronchien (β2-Sympathomimetika). Hier sollte aber auch analysiert werden, wie sich die Medikamente auf die IL-17A und OAS1 Genexpression auswirkt. Dazu wurde zum einen direkt aus dem Vollblut bzw. aus frisch isolierten PBMCs RNA isoliert, in cDNA umgeschrieben, um die jeweilige Genexpression mittels qPCR Analyse zu ermitteln. Es stellte sich heraus, dass im Vollblut von Kindern mit Asthma, welche nicht mit Steroiden behandelt wurden, tendenziell mehr IL-17A exprimiert wurde als bei gesunden Kindern oder bei Kindern mit Asthma, welche ein Steroid alleine oder in Kombination mit einem anderen nicht-steroidalen Medikament erhielten (s. Abb. 6-42 A). Weiterhin zeigte sich, dass sich die nicht-steroidale Behandlung auch positiv auf die OAS1 mRNA Expression auswirkte. Hier war im Vergleich zu gesunden Kindern und Asthmakindern, bei welchen in der Therapie ein Steroid enthalten war, ein statistisch signifikanter Anstieg der Genexpression zu verzeichnen (s. Abb. 6-42 B). Dies lässt darauf schließen, dass man mithilfe von Arzneimitteln bei Kindern mit bestehendem Asthma bronchiale die antivirale Immunantwort beeinflussen kann. 153 Ergebnisse Abb. 6-42 Analyse der IL-17A und OAS1 Genexpression unter Berücksichtigung der Arzneimitteltherapie: Aus dem Gesamtblut von Kontrollkindern und Kindern mit Asthma wurde entweder direkt RNA extrahiert oder zunächst PBMCs isoliert, um anschließend aus diesen RNA zu extrahieren. Nach der cDNA Synthese wurden IL-17A und OAS1 auf mRNA Ebene mittels qPCR weiter analysiert. A, B) Eine Therapie ohne Steroide steigert bei Kindern mit Asthma sowohl die IL-17A Expression (A) als auch die OAS1 Genexpression (B). 154 Diskussion 7 Diskussion Asthma bronchiale, eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege, gehört mit zu den häufigsten chronischen Erkrankungen. Zu den ca. 300 Millionen Betroffenen weltweit zählen sowohl Kinder als auch Erwachsene. Da die zugrunde liegenden molekularen Abläufe noch nicht vollständig geklärt sind, ist die Erkrankung bist jetzt nur therapierbar, aber noch nicht heilbar. Zur Immunpathogenese des Asthma bronchiale tragen eine Vielzahl verschiedener Zelltypen bei, wobei das Ungleichgewicht zwischen Th1- und Th2-Zellen, aber auch der Einfluss von Th17- und Treg Zellen von entscheidender Bedeutung sind. Zu den Hauptsymptomen gehören Episoden akuter Atemnot, sowie eine reversible Obstruktion der Atemwege, eine bronchiale Hyperreaktivität und eine Entzündung der Atemwege (Finotto and Glimcher, 2004; Ukena et al., 2008; Barnes, 2010). In der vorliegenden Arbeit wurden IL-17A defiziente Mäuse untersucht. Dieses Zytokin wird von Th17-Zellen und einer Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. Tc17-, NK-, NKT- und Mastzellen, gebildet (Molet et al., 2001; Korn et al., 2009; Alcorn et al., 2010; Suurmond et al., 2011; Zhu and Qian, 2012). Diesem Zytokin werden u. a. entzündungsfördernde Eigenschaften zugeschrieben. So stellte man bereits fest, dass IL-17A im Sputum, in den PBMCs und im Lungengewebe von Patienten mit Asthma bronchiale in erhöhten Konzentrationen vorlag (Bullens et al., 2006; Alcorn et al., 2010). Es konnte auch gezeigt werden, dass IL-17A mit der Schwere der Erkrankung korreliert, besonders bei Neutrophilvermittelten Entzündungsreaktionen und steroidresistentem Asthma (Chakir et al., 2003; Bullens et al., 2006; Al-Ramli et al., 2009). Außerdem geht man davon aus, dass IL-17A bei der Ausbildung der bronchialen Hyperreagibilität beteiligt ist (Barczyk et al., 2003), wobei sich hier die Ansichten, ob IL-17A eine positive oder negative Wirkung hat, auseinandergehen. Man geht auch davon aus, dass dieses Interleukin bei der für Asthma typischen Mukushypersekretion beteiligt ist, indem es auf Muzin-Gene einwirkt (Chen et al., 155 Diskussion 2003). Zum Teil wurden für IL-17A jedoch auch anti-inflammatorische Eigenschaften beschrieben, besonders in Zusammenhang mit γδ-T-Zellen (Sutton et al., 2009; Murdoch and Lloyd, 2010). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die jeweilige Rolle von IL-17A, probzw. anti-inflammatorisch, vom jeweiligen Zelltyp abhängt. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, wie sich eine IL-17A Defizienz auf die Immunpathogenese des allergischen Asthmas auswirkt. Dies geschah in einem murinen Modell allergischen Asthmas. Um bei den Mäusen Asthma zu induzieren, wurde ein Protokoll verwendet, welches in unserer Arbeitsgruppe gut etabliert ist und bereits seit längerer Zeit angewandt wird (Finotto et al., 2001; Finotto et al., 2002; Maxeiner et al., 2007; Doganci et al., 2008a). Hierbei wird ein Krankheitsbild hervorgerufen, welches mit dem im Menschen vergleichbar ist. Zu den auftretenden Symptomen zählt sowohl die Entstehung der AHR, als auch das Einwandern inflammatorischer Zellen ins Lungengewebe oder die verstärkte Entwicklung von Th2-Zellen. Um die durch die Asthmaerkrankung hervorgerufenen immunologischen Vorgänge in den IL-17A defizienten Mäusen besser beurteilen zu können, wurden in den einzelnen Versuchen gesunde und an Asthma erkrankte Wildtyp-Mäuse mitgeführt, welche jeweils als Kontrollgruppe dienten. Asthma bronchiale ist bis heute nur therapierbar, aber noch nicht heilbar. Ziel der Forschung ist es, dieses Defizit auszugleichen. Ein Schritt in diese Richtung ist die gezielte Induktion einer Atemwegstoleranz. Charakteristisch für eine allergische Reaktion ist die überschießende Immunreaktion auf ein eigentlich harmloses Antigen. Bei der Atemwegstoleranz handelt es sich um eine spezielle Form der körpereigenen Immunüberwachung, bei der harmlose Antigene von Pathogenen unterschieden werden und so nur gegen potenziell gefährliche Faktoren vorgegangen wird. Aus diesem Grund geht man davon aus, dass die Induktion einer Atemwegstoleranz eine effektive Möglichkeit darstellt, vor der Entstehung von Asthma bronchiale zu schützen bzw. das Auftreten der Erkrankung besser kontrollieren zu können 156 Diskussion (Andreev et al., 2012). IL-17A zählt zu den pro-inflammatorischen Zytokinen und wird v. a. mit der durch neutrophile und eosinophile Granulozyten vermittelten Entzündungsreaktion in Verbindung gebracht. Da es sich hierbei um ein charakteristisches Symptom der Erkrankung handelt, könnte IL-17A ein geeignetes Therapieziel darstellen. Es konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl die direkte Blockade von IL-17A, als auch vor- und nachgeschalteter Faktoren zu einer verminderten Anzahl an eosinophilen und neutrophilen Granulozyten sowie Th2-Zytokinen führt (Andreev et al., 2012). Jedoch sind weitere Studien nötig, um einen besseren Einblick in die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welche Rolle das Zytokin IL-17A bei der Atemwegstoleranz spielt. Zu diesem Zweck wurde ein murines Modell herangezogen. Um in Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen eine Atemwegstoleranz zu induzieren, wurden sie vor der Sensibilisierungsphase intranasal mit dem Allergen OVA behandelt. Dies geschah in Anlehnung an ein bereits etabliertes und zuvor beschriebenes Protokoll (Akbari et al., 2001). Als Kontrollgruppen dienten sowohl unbehandelte als auch astmatische Wildtyp- und IL-17A defiziente Mäuse. Es ist mittlerweile auch bekannt, dass IL-17A bei der Abwehr extrazellulärer Pathogene, insbesondere von Bakterien und Pilzen, eine wichtige Rolle spielt. Außerdem geht man davon aus, dass IL-17A bei der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort beteiligt ist. Dies äußert sich im Falle einer Influenza Infektion z. B. in einer durch IL-17A hervorgerufenen Entzündungsreaktion, welche den Virus an seiner Ausbreitung hindern soll. Es ist jedoch auch in diesem Fall noch nicht vollständig geklärt, ob bzw. wann IL-17A pro- bzw. antiviral wirkt (Gaffen, 2011; Martinez et al., 2012). So wurde einerseits beschrieben, dass IL-17A nach primären Infektionen mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus zur Mukushypersekretion und zur vermehrten viralen Last beiträgt, anderseits unterdrückte IL-17A während dieser Erkrankung die AHR und die Entzündungsreaktion (Newcomb et al., 2013). Zusätzlich 157 Diskussion scheint die jeweilige Rolle des Interleukins davon abzuhängen, ob neben der viralen Infektion noch eine weitere Erkrankung, wie z. B. Asthma vorliegt. Daraus lässt sich schließen, dass die Hauptfunktion des Zytokins IL-17A sowohl vom jeweiligen Virus als auch von den immunologischen Gegebenheiten im Wirt abhängen. Daher sind noch weitere Untersuchungen notwendig, um die jeweiligen Mechanismen zu verstehen. In der vorliegenden Arbeit wurde eingehender untersucht, welche Rolle IL-17A nach Infektionen mit dem RV1b bei bestehendem allergischen Asthma spielt. Dazu wurden sowohl humane Epithelzellen (A549 Zellen) als auch murine Zellen von naiven und asthmatischen Mäusen in vitro mit dem RV1b infiziert. Zu diesem Zweck wurden die Zellen für eine Stunde unter ständigem Schütteln mit einer Suspension, welche den RV1b enthielt, inkubiert und anschließend kultiviert. Hierbei orientierte man sich an Protokollen anderer Arbeitsgruppen (Papadopoulos et al., 2000; Papadopoulos et al., 2002). In einem weiteren Teil der Arbeit wurden im Zuge der PreDicta-Studie gesunde und an Asthma erkrankte Kinder untersucht. Asthma bronchiale ist bei Kindern die am häufigsten auftretende chronische Erkrankung, wobei sie bei den meisten Kindern schon vor dem 5. Lebensjahr ausbricht. Bei Kindern wird meist atopisches Asthma diagnostiziert, welches häufig aus dem sogenannten Etagenwechsel hervorgeht. Aber auch andere Umweltfaktoren, wie z. B. virale Infekte scheinen bei der Pathogenese in diesem Alter eine wichtige Rolle zu spielen. Es ist jedoch noch nicht eindeutig geklärt, wie sich gehäufte Virusinfektionen im Kindesalter auf die Entstehung und den Verlauf der Erkrankung auswirken. Es besteht die Annahme, dass zahlreiche virale Infekte gesunde Kinder davor schützen, in späteren Jahren an Asthma zu erkranken. Bei Kindern, die bereits an dieser entzündlichen Erkrankung leiden, tragen vermehrte Virusinfektionen eher zu einer Verschlimmerung und Chronifizierung des Asthmas bei. Im Zuge der PreDicta-Studie wurden Vorschulkinder über einen Zeitraum von zwei Jahren hinweg untersucht, um u. a. zu erforschen, wie sich Virusinfektionen auf den 158 Diskussion Verlauf der Erkrankung auswirken. Dazu wurde den Kindern zum einen Vollblut abgenommen, um daraus PBMCs zu isolieren und nachfolgend zu analysieren. Des Weiteren wurde bei den einzelnen Besuchen ein Nasenabstrich abgenommen, um diesen auf Viren hin zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden die aus der Analyse der PBMCs hervorgegangen Ergebnisse mit einer Rhinovirusinfektion der oberen Atemwege in Verbindung gesetzt, um so herauszufinden, wie sich eine virale Infektion auf molekularer Ebene auswirkt. 7.1 IL-17A beeinflusst den Phänotyp bei allergischem Asthma bronchiale In zahlreichen humanen und murinen Studien wurde bereits festgestellt, dass IL-17A bei der Entstehung und dem Verlauf der Asthmaerkrankung beteiligt ist. Allerdings lieferten die murinen Studien z. T. widersprüchliche Ergebnisse, ob diesem Zytokin nun eher protektive oder entzündungsförderende Eigenschaften zuzuschreiben sind. Gründe dafür könnten die unterschiedlichen verwendeten Protokolle oder Mausstämme sein. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Asthmamodell verwendet, welches vergleichbare Symptome hervorruft wie bei Menschen. Mithilfe dieses Modells sollte in IL-17A defizienten Mäusen der Phänotyp bei allergischen Asthma bronchiale näher untersucht werden. 7.1.1 IL-17A beeinflusst die Entstehung der AHR Ob und wie IL-17A die AHR beeinflusst war bereits Gegenstand zahlreicher Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen, ohne dabei ein eindeutiges Ergebnis zu erhalten. So beobachtete z. B. Nakae et al. in IL-17A defizienten Mäusen 24 h nach der letzten OVABehandlung normale Penh-Werte (Nakae et al., 2002). Das Verabreichen eines anti-IL-17 monoklonalen Antikörpers fördert bei Wildtyp-Mäusen dagegen widersprüchliche 159 Diskussion Erkenntnisse zu Tage. So wurde sowohl von einer reduzierten, einer gesteigerten als auch einer unveränderten AHR berichtet (Hellings et al., 2003; Schnyder-Candrian et al., 2006; He et al., 2007). Diese Beobachtungen scheinen zum einen vom jeweiligen Behandlungsprotokoll aber auch vom Zeitpunkt der Verabreichung des Antikörpers abzuhängen. Man geht davon aus, dass IL-17A zwar einerseits bei der Entstehung der AHR benötigt wird, bei etabliertem Asthma allerdings eher vor der AHR schützt (Schnyder-Candrian et al., 2006). Im vorliegenden Modell wurde mit Hilfe einer nicht-invasiven Methode eine erhöhte AHR in IL-17A(-/-) Mäusen beobachtet. Wendet man für die Analyse jedoch eine invasive Methode an, so kommt man zu dem Ergebnis, dass IL-17A defiziente Mäuse bei niedrigen Konzentrationen des Bronchokonstriktors Methacholin zunächst stärker reagieren als Wildtyp-Mäuse, erhöht man allerdings die Dosis, so weisen die asthmatischen Wildtyp-Mäuse eine gesteigerte Reaktion auf. Die beobachteten Unterschiede basieren möglicherweise auf den zwei unterschiedlichen Analysemethoden. Die nicht-invasive Plethysmographie berücksichtigt auch den Einfluss des Atemwegswiderstandes im oberen Respirationstrakt. Dort sind Änderungen der Glottis und der nasalen Passage zu verzeichnen, so dass das exakte Ausmaß und die Lokalisation der Bronchokonstriktion nicht genau nachvollziehbar sind. Da bei der invasiven Methode die oberen Atemwege umgangen werden, ist diese Methode daher sensitiver und spezifischer für die Erfassung pulmonaler Mechanismen (Glaab et al., 2007). IL-13, ein Th2-Zytokin, ist ebenfalls an der Entstehung der AHR beteiligt. Hier gibt es Hinweise, dass IL-17A dieses Interleukin beeinflusst (Kinyanjui et al., 2013). Da im vorliegenden Modell erhöhte IL-13 Konzentrationen in der BALF und eine große Anzahl IL-13+CD4+ T-Lymphozyten in der Lunge nachgewiesen werden konnten, ist es möglich, dass dieses Zytokin an der Ausbildung der AHR beteiligt war. Des Weiteren existieren Hinweise darauf, dass IL-17A-produzierende γδ-T-Zellen bei den Prozessen, welche zum Abklingen der AHR führen, beteiligt sind (Murdoch and Lloyd, 2010). Aufgrund der beobachteten Ergebnisse bezüglich der AHR besteht die Möglichkeit, dass dieser Zelltyp 160 Diskussion in IL-17A defizienten Mäusen beeinträchtigt ist. Diese Vermutung bedarf allerdings noch eingehender Untersuchungen. 7.1.2 IL-17A fördert neutrophile Granulozyten Man geht davon aus, dass IL-17A für die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten verantwortlich ist. Dies konnte bereits im Mausmodell demonstriert werden, indem WildtypMäuse mit monoklonalen Antikörpern gegen IL-17 behandelt wurden, was zu einer Reduktion der neutrophilen Granulozyten führte (Hellings et al., 2003; He et al., 2007). Auch im vorliegenden Modell allergischen Asthmas konnte in IL-17A defizienten Mäusen eine verringerte Anzahl an neutrophilen Granulozyten in der BALF im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nachgewiesen werden. Bezüglich der Beteiligung an der Aktivierung und Rekrutierung eosinophiler Granulozyten ist die Datenlage weniger eindeutig. So wurden zwar in IL-17A- und IL-17RA defizienten Mäusen weniger eosinophile Granulozyten in der BALF vorgefunden (Schnyder-Candrian et al., 2006; Yang et al., 2008a), behandelte man jedoch Wildtyp-Mäuse mit monoklonalen Antikörpern, welche gegen IL-17A gerichtet waren, so wurde zum einen ein Anstieg dieser Zellen verzeichnet (Schnyder-Candrian et al., 2006), aber auch gleichbleibende Level (Hellings et al., 2003; He et al., 2007; Pichavant et al., 2008). Dies veranlasst wieder zu der Schlussfolgerung, dass der jeweilige Effekt von dem Zeitpunkt der IL-17A Neutralisation und dem zugrundeliegenden Protokoll abhängt. In der vorliegenden Arbeit konnte nach Behandlung mit dem Allergen zwar ein signifikanter Anstieg der eosinophilen Granulozyten in asthmatischen IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu naiven IL-17A(-/-) Mäusen beobachtet werden, innerhalb der OVA-Gruppe waren jedoch keine weiteren Unterschiede zu verzeichnen. Diesbezüglich ist die derzeitige Datenlage wiederum nicht eindeutig. So konnte zum einen beobachtet werden, dass die Neutralisation des Zytokins IL-17A vor der Behandlung mit OVA zu einem enormen Anstieg 161 Diskussion der eosinophilen Granulozyten in den Atemwegen führt, allerdings konnte in IL-17A defizienten Mäusen auch gezeigt werden, dass es nach OVA-induziertem Asthma zu keiner außergewöhnlich gesteigerten Anzahl dieses Zelltyps kam (Hellings et al., 2003; Suzukawa et al., 2012). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass IL-17A v. a. bei der Differenzierung und Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten beteiligt ist. 7.1.3 IL-17A ist ein wichtiger Faktor für die Differenzierung und das Überleben von Mastzellen aus dem Knochenmark Mastzellen bilden die Schnittstelle zwischen der unspezifischen und der spezifischen Immunantwort und sind somit entscheidend für die Entstehung und den Verlauf der Asthmaerkrankung. Aus diesem Grund wurde im vorliegenden murinen Asthmamodell auch untersucht, ob dieser Zelltyp von IL-17A beeinflusst wird. An Asthma erkrankte IL-17A(-/-) Mäuse hatten tendenziell weniger pulmonale CD123+FcεRIα+ckit+ Mastzellen als Wildtyp-Mäuse, obwohl auf mRNA-Ebene eine erhöhte Expression des Wachstumsfaktors IL-9 nachgewiesen werden konnte. Wie zuvor bereits erwähnt produzierten diese Mäuse auch mehr IL-4, einen weiteren Wachstumsfaktor der Mastzellen. IL-3, ebenfalls ein Faktor, welcher für die Expansion von Mastzellen essentiell ist, war in naiven IL-17A(-/-) Mäusen marginal verringert. Differenzierte man nun Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen, so konnte man beobachten, dass aus den IL-17A defizienten Knochenmarkszellen über den gesamten Zeitraum hinweg weniger Mastzellen hervorgingen als aus dem Knochenmark der Wildtyp-Mäuse. Morphologisch betrachtet erschienen diese Zellen auch weniger vorgefertigte Botenstoffe in ihren Granula gespeichert zu haben, was sich auch in einer geringeren Konzentration an Histamin widerspiegelte. Dies stimmt mit vorherigen Untersuchungen überein, bei denen ebenfalls Mastzellen aus dem Knochenmark generiert und analysiert wurden. Auch hier wurde für IL-17A defiziente Zellen 162 Diskussion eine verminderte Freisetzung von Botenstoffen und eine geringere Anzahl an degranulierten Mastzellen beschrieben (Quan et al., 2012). Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass IL-17A maßgeblich an der Degranulation von Mastzellen beteiligt ist. Eine Erklärung für die beeinträchtigte Differenzierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von IL-17A defizienten Mäusen lieferte die Analyse der Zellkulturüberstände. Hier konnten zu jedem Zeitpunkt stark erhöhte Konzentrationen an TGF-β nachgewiesen werden. Für dieses Zytokin ist bereits beschrieben, dass es die IL-3 und IL-4 abhängige Proliferation von Mastzellen negativ beeinflusst (Broide et al., 1989; Toyota et al., 1995). Auf diese Blockade schienen die IL-17A(-/-) Zellen mit einer gesteigerten CD123 mRNA Expression zu reagieren. Zusätzlich scheint IL-17A das Überleben von Mastzellen zu sichern. Eine gesteigerte LDH-Aktivität in den Zellkulturüberständen von IL-17A defizienten Mastzellen lässt darauf schließen, dass IL-17A vor Apoptose bzw. Nekrose schützt. Diese Vermutung geht einher mit der Beobachtung, dass IL-17A T-Zellen vor der Apoptose bewahrt (Boggio et al., 2014). Zusammengefasst deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass IL-17A zum einen wichtig für die Differenzierung und das Überleben von Mastzellen ist und zum anderen auch an der Einlagerung und Freisetzung von Mediatoren wie z. B. Histamin beteiligt ist. 7.1.4 IL-17A hat keinen Einfluss auf die bronchiale Entzündung, aber auf die bronchiale Mukusproduktion Die Entzündung des Lungengewebes und die vermehrte Schleimproduktion sind charakteristisch für Asthma bronchiale. Beides trägt zur erschwerten Atmung und zu einem Engegefühl in der Brust bei. In der vorliegenden Arbeit sollte auch untersucht werden, ob das Zytokin IL-17A in diesem Zusammenhang eine Rolle spielt. Hierbei wurde beobachtet, dass dieses Interleukin keinen offensichtlichen Einfluss auf die bronchiale Entzündungsreaktion 163 Diskussion nimmt. Bisherige Untersuchungen konnten zeigen, dass IL-17A nur in Abwesenheit der für Th2-Zellen typischen Zyotikine IL-4 und IL-13 die Entzündungsreaktion fördert, was anhand IL-4/IL-13 DKO (double knock out) Mäusen demonstriert wurde. Inhibierte man in diesen Mäusen IL-17A mit Hilfe eines Antikörpers, so nahm der Entzündungsgrad ab (He et al., 2009). Im vorliegenden Modell wurde sowohl IL-4 als auch IL-13 von IL-17A defizienten Mäusen weiterhin gebildet. Man kann also davon ausgehen, dass die beobachtete Entzündungsreaktion sehr wahrscheinlich auf die Anwesenheit dieser beiden Zytokine zurückzuführen ist. Es ist bereits bekannt, dass IL-17A die Expression der Mucine MUC5B und MUC5AC induziert und somit zur Hypersekretion von Mukus beiträgt (Chen et al., 2003). Dies deckt sich mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, da im Lungengewebe asthmatischer IL-17A(-/-) Mäuse ein statistisch signifikanter Rückgang der schleimproduzierenden Zellen zu verzeichnen war. Weiterhin ist bekannt, dass Mastzellen über die Freisetzung von Histamin die Mucussekretion anregen (Urb and Sheppard, 2012). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass der IL-17A-Defekt zum einen zum Rückgang von Mastzellen führt und diese Mastzellen zudem weniger Histamin freisetzen. Im vorliegenden Modell scheint die verminderte Anzahl an schleimproduzierenden Zellen in Zusammenhang mit dem Mastzellendefekt zu stehen. 7.1.5 IL-17A ist nicht direkt am Immunglobulin-Klassenwechsel beteiligt In humanen B-Zellen konnte nachgewiesen werden, dass IL-17A die IgE Produktion fördert (Milovanovic et al., 2010). Dies würde darauf schließen lassen, dass in Abwesenheit dieses Zytokins der Klassenwechsel zu IgE beeinträchtigt ist. Nach Induktion allergischen Asthmas in IL-17A(-/-) Mäusen konnte jedoch im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kein Unterschied in der IgE-Produktion festgestellt werden. Dafür wurde jedoch gezeigt, dass sowohl der 164 Diskussion Transkriptionsfaktor Batf als auch IL-4 in diesen Mäusen vermehrt gebildet und freigesetzt wurden. Von beiden genannten Faktoren ist bekannt, dass sie eine entscheidende Rolle beim Immunglobulin-Klassenwechsel und somit der Bildung von IgE spielen. Für IL-4 ist hierbei beschrieben, dass es den Transkriptionsfaktor Nfil3 induziert, welcher direkten Einfluss auf die Bildung des Immunglobulins E hat (Kashiwada et al., 2010; Ise et al., 2011). Mittels Genearray konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass dieser Transkriptionsfaktor in Abwesenheit von IL-17A verstärkt exprimiert wird. Insgesamt lässt sich daraus schließen, dass der Einfluss von IL-17A auf die IgE-Bildung durch andere Komponenten kompensiert werden kann. Diese Annahme lässt sich dadurch bestärken, dass in vorherigen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass IL-17A B-Zellen zum Klassenwechsel und zur bevorzugten Bildung von IgG2a und IgG3 veranlassen kann (Mitsdoerffer et al., 2010). 7.1.6 IL-17A beeinflusst Th1- und Th2-Zytokine In einem gesunden Organismus liegt eine Th1/Th2 – Balance vor. Beim allergischen Asthma allerdings ist dieses Gleichgewicht in Richtung Th2–Immunantwort verschoben. In der vorliegenden Arbeit sollte auch untersucht werden, welche Rolle das Zytokin IL-17A bei diesem Gleichgewicht spielt. Es wurde bereits beschrieben, dass IL-17A im Stande ist, eine bestehende Th2–Antwort zu reduzieren (Bettelli et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass IL-17A im allergischen Asthma die Th2-Zytokine, insbesondere IL-4, negativ beeinflusst. Dem entgegen steht ein induzierender Effekt in Hinblick auf IFN-γ, welches typischerweise von Th1-Zellen gebildet wird. Ähnliches wurde bereits bei in vitro Versuchen beobachtet (Tang et al., 2014). Eine mögliche Erklärung für die verminderte IFN- Freisetzung in asthmatischen IL-17A(-/-) Mäusen liefern die Treg-Zellen und deren Zytokin IL-10, welche trotz Gendefekt weiterhin gebildet wurden. Demzufolge regulieren Treg-Zellen 165 Diskussion über IL-10 die Bildung des für Th1-Zellen typischen Zytokins IFN- (Sojka and Fowell, 2011). Des Weiteren fand man heraus, dass auch IL-4, welches im vorliegenden Asthmamodell in der Abwesenheit von IL-17A erhöht vorlag, die IFN--Produktion inhibiert (Wurtz et al., 2004). Es wurde für IFN- aber auch ein direkter negativer Feedback-Einfluss auf die IL-4 Expression beschrieben (Elser et al., 2002). Dies dürfte erklären, weshalb bei astmatischen IL-17A(-/-) Mäusen die IL-4 Produktion statistisch signifikant erhöht vorlag. Weiterhin bestätigt dieses Ergebnis vorherige Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe, die zeigen konnten, dass IL-17A in Abhängigkeit von Tyk-2 die Produktion von Th2-Zytokinen unterbinden kann (Übel et al., 2014). 7.1.7 IL-17A nimmt keinen Einfluss auf Treg-Zellen im murinen Asthmamodell Es wurde bisher beschrieben, dass Th17-Zellen und Treg-Zellen sich gegenseitig regulieren. So hat man herausgefunden, dass der für Th17-Zellen typische Transkriptionsfaktor RORt den für Treg-Zellen typischen Transkriptionsfaktor Foxp3 hemmt und umgekehrt (Zhou et al., 2008; Hwang, 2010). In dieser Arbeit wurde sowohl in den Lungen von gesunden als auch erkrankten IL-17A(-/-) Mäusen der Anteil an Treg-Zellen näher untersucht. So konnte beobachtet werden, dass nach Konfrontation mit dem Allergen zwar vermehrt regulatorische T-Zellen und auch deren Transkriptionsfaktor Foxp3 gebildet wurden, im Vergleich zu den jeweiligen Wildtyp-Mäusen konnten jedoch keine weiteren Unterschiede festgestellt werden. Zudem wurde nach der Behandlung mit OVA innerhalb der CD4+-Zellfraktion beider Genotypen vermehrt das anti-inflammatorische Zytokin IL-10 gebildet. Dies deckt sich mit der von uns bereits beschriebenen Beobachtung, dass die Gabe von IL-17A nur in Verbindung mit einer Tyk-2-Defizienz zu einem Rückgang der Treg-Zellen führte. Bei asthmatischen Wildtyp-Mäusen hingegen führte die Behandlung mit rIL-17A zu keiner veränderten Anzahl an regulatorischen T-Zellen (Übel et al., 2014). 166 Diskussion 7.2 IL-17A ist an der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt Bei gesunden Menschen führt die erste Konfrontation mit einem harmlosen Antigen zunächst zu einer kurzfristigen lokalen Immunantwort, gefolgt von einer langfristigen peripheren Toleranz. Bei Asthmatikern dagegen können solch harmlose Antigene eine ungewollte Th2-Sensibilisierung und somit eine Th2-vermittelte Immunantwort auslösen, welche charakteristisch für das allergische Asthma bronchiale ist. Das Hauptziel der Asthmaforschung besteht darin, einen Weg zu finden, wie man die überschießende Immunreaktion eindämmen bzw. unterdrücken kann. In diesem Zusammenhang spielt die Atemwegstoleranz eine wichtige Rolle, da sie einen möglichen Schutz vor Asthma bronchiale darstellt, da v. a. regulatorische T-Zellen aktiviert werden (Andreev et al., 2012). Da neben Th1- und Th2-Zellen auch Th17-Zellen beim Asthma bronchiale eine entscheidende Rolle spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob und wenn ja, welche Rolle das Zytokin IL-17A bei der Atemwegstoleranz spielt. 7.2.1 Die Atemwegstoleranz beeinflusst die Entstehung der AHR und die IgE-Spiegel negativ Die Hyperreaktivität der Atemwege zählt zu den Hauptsymptomen des Asthma bronchiale. Mit dem Einsatz von 2-Sympathomimetika, welche die Bronchien erweitern, versucht man dagegen vorzugehen (Mutschler et al., 2008). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten darauf hin, dass die Induktion einer Atemwegstoleranz ebenfalls einen Schutz vor der Ausbildung einer Atemwegshyperreaktivität darstellt. So wiesen sowohl Wildtyp- als auch IL-17A defiziente Mäuse im Toleranzmodell eine geringere AHR auf als Mäuse mit allergischem Asthma. Auch Tsitoura et al. konnten bereits zeigen, dass die Atemwegstoleranz zu einer allergenspezifischen T-Zell-Toleranz führt und somit die Entstehung der AHR negativ beeinflusst. Sie fanden auch heraus, dass dies unabhängig von IL-4 und IFN- 167 Diskussion geschah (Tsitoura et al., 2000). Im vorliegenden Modell konnte durch Induktion der Toleranz bei Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen zwar ein Rückgang der AHR im Vergleich zu asthmatischen Mäusen beobachtet werden, allerdings reagierten diese Mäuse immer noch stärker als unbehandelte Tiere. Dies könnte damit zusammenhängen, dass sowohl wt als auch IL-17A ko Mäuse im Toleranzmodell immer noch erhöhte IL-13 Proteinkonzentrationen in der BALF aufwiesen. Wie vorher bereits erwähnt (s. 7.1.1) ist auch dieses Zytokin maßgeblich an der Entstehung der AHR beteiligt. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass die intranasale Behandlung mit OVA vor der Sensibilisierungsphase die Bildung des antigenspezifischen Immunglobulins IgE unterdrückt. So waren bei tolerogenen Mäusen beider Genotypen die Konzentrationen an IgE im Serum vergleichbar zu denen im Serum von gesunden Mäusen. Auf diesen Effekt scheint IL-17A keinen Einfluss zu haben, da tolerogene Wildtyp- und IL-17A defiziente Mäuse ähnliche Konzentrationen an IgE aufwiesen. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen berichteten auch Tsitoura et al. von einer beeinträchtigten IgE Produktion im Toleranzmodell (Tsitoura et al., 2000). Die verminderten IgE Spiegel im Serum tolerogener Mäuse gehen einher mit einer geringeren IL-4 Proteinkonzentration in der BALF im Vergleich zu Mäusen mit Asthma. Dieses Zytokin ist dafür bekannt, an der Bildung des Immunglobulins E beteiligt zu sein (Kashiwada et al., 2010). Auch dieser Befund stimmt mit vorherigen Untersuchungen überein (Tsitoura et al., 2000). Weiterhin ist bekannt, dass IL-10 und auch TGF- die IgE Produktion zugunsten der Immunglobulinisotypen IgG4 und IgA unterbinden, welche keine entzündungsfördernden Eigenschaften besitzen (Asadullah et al., 2003; Taylor et al., 2006). Beide Zytokine wurden im vorliegenden Toleranzmodell v. a. in der Abwesenheit von IL-17A verstärkt gebildet. 168 Diskussion 7.2.2 IL-17A inhibiert IL-10 und TGF- im Toleranzmodell Regulatorische T-Zellen spielen bei den zugrundeliegenden Mechanismen der Immuntoleranz eine entscheidende Rolle, da sie z. B. Vermittler der Anergie sind und Teffektor-Zellen inhibieren. Man geht davon aus, dass Foxp3+CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen in diesem Zusammenhang eine wichtige Rolle spielen (Gershon and Kondo, 1971; Gershon et al., 1972; Corthay, 2009; Andreev et al., 2012). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein IL-17A Gendefekt im Toleranzmodell zu einer verringerten Anzahl an Foxp3+CD4+CD25+ Treg-Zellen führte. Dem entgegen steht eine verstärkte Tgf und Il-10 Genexpression im Lungengewebe von tolerogenen IL-17A defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen. Dies lässt vermuten, dass TGF- bzw. IL-10 in diesem Zusammenhang nicht an der Differenzierung von Foxp3+CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen beteiligt waren bzw. von diesen produziert wurden. So ist es möglich, dass in Abwesenheit von IL-17A im Toleranzmodell bevorzugt Tr1 Zellen (Type 1 regulatory T cells) entstehen, welche eine Untergruppe der induzierbaren regulatorischen T-Zellen darstellen. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie große Mengen an IL-10 und TGF- produzieren und freisetzen, jedoch den Transkriptionsfaktor Foxp3 gar nicht bzw. nicht kontinuierlich exprimieren. Auch Tr1 Zellen sind für die die Entstehung und die Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz von enormer Bedeutung (Pot et al., 2011b; Gregori et al., 2012). Die Differenzierung dieses Subtyps wird u. a. durch IL-27 gefördert, welches außerdem die Entstehung von IL-17-produzierenden Th17-Zellen unterdrückt (Pot et al., 2011a). Weiterhin geht man davon aus, dass Tr1 Zellen auch in der Lage sind, die Entstehung der AHR zu unterdrücken (Akbari et al., 2001; Umetsu et al., 2002). Dies könnte auch erklären, warum im vorliegenden Toleranzmodell der Unterschied bezüglich der AHR zwischen den asthmatischen und den tolerogenen Mäusen in Abwesenheit von IL-17A deutlicher hervortritt als zwischen asthmatischen und tolerogenen Wildtyp-Mäusen. Eine weitere Untergruppe der 169 Diskussion regulatorischen T-Zellen stellen die Th3 Zellen dar. Auch zu ihrer Differenzierung tragen IL-10 und TGF- bei. Die ausgereiften Th3 Zellen produzieren anschließend hauptsächlich TGF- aber auch IL-10 (Jonuleit and Schmitt, 2003). Es ist daher denkbar, dass in Abwesenheit von IL-17A besonders diese beiden Subtypen bevorzugt gebildet werden und die Immuntoleranz durch sie vermittelt wird. Es bedarf allerdings noch weiterer Untersuchungen, um diese Annahme zu bestätigen. 7.2.3 IL-17A inhibiert follikuläre T-Helferzellen im Toleranzmodell Follikuläre T-Helferzellen werden sowohl für die Bildung von Keimzentren als auch für den Immunglobulin-Klassenwechsel benötigt. Außerdem tragen sie zur Entstehung und Produktion von antigenspezifischen B-Gedächtniszellen und Plasmazellen bei (Kim et al., 2013). Somit sind Tfh-Zellen an der B-Zell vermittelten Toleranz beteiligt. Im vorliegenden Toleranzmodell konnte gezeigt werden, dass im Lungengewebe von tolerogenen IL-17A defizienten Mäusen besonders der für Tfh-Zellen typische Rezeptor Cxr5 im Vergleich zu tolerogenen Wildtyp-Mäusen vermehrt exprimiert wurde. Weiterhin fiel auf, dass sich die Asthmaerkrankung in beiden Mausstämmen negativ auf die Expression dieses Rezeptors auswirkte. IL-21 gilt als Schlüsselzytokin der Tfh-Zellen und trägt über einen autokrinen Effekt zur Proliferation und dem Überleben dieser Zellen bei (Ding et al., 2013). Es konnte gezeigt werden, dass verglichen mit den jeweiligen Wildtyp-Mäusen, sowohl asthmatische als auch besonders tolerogene IL-17A(-/-) Mäuse dieses Zytokin vermehrt exprimierten. Auch die für Tfh-Zellen typischen Oberflächenmarker Il-6r und Il-21r wurden im Toleranzmodell in Abwesenheit von IL-17A verstärkt exprimiert. Gleiches galt für den Transkriptionsfaktor Bcl6, welcher als einer der wichtigsten Transkriptionsfaktoren der Tfh-Zellen gilt. Bcl6 wird u. a. durch IL-21 induziert und fördert daraufhin die Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 (Ding et al., 2013). 170 Diskussion Tfh-Zellen sind, wie zuvor bereits beschrieben, an der Entstehung und Regulation der B-Zell-vermittelten Toleranz beteiligt. Dies bedeutet, dass B-Zellen z. B. nicht auf körpereigene Antigene reagieren. Allerdings kann eine anormale Anreicherung und Funktion von Tfh-Zellen eine Dysregulation von Keimzentren auslösen (Lee et al., 2012; Sweet et al., 2012). So korreliert eine gesteigerte Anzahl an follikulären T-Helferzellen mit der Schwere von Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Lupus erythematodes (Simpson et al., 2010; Feng et al., 2012; Ma et al., 2012). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten deuten darauf hin, dass IL-17A möglicherweise einen regulierenden Einfluss auf Tfh- und B-Zellen hat. Bisher geht man davon aus, dass IL-17A weder zur Entwicklung von follikulären T-Helferzellen beiträgt noch von diesen produziert wird. Allerdings exprimieren B-Zellen den IL-17RA und reagieren auch auf IL-17A-Stimulation. So können Th17-Zellen und somit auch deren Zytokin IL-17A B-Zellen zur Proliferation und zum Klassenwechsel veranlassen. Weiterhin sind sie an der Bildung von Keimzentren beteiligt (Yao et al., 1995a; Nurieva et al., 2008; Mitsdoerffer et al., 2010; Lüthje et al., 2012). Wie wichtig das IL-17/IL-17RA vermittelte Signal für die Regulation von Tfh- und B-Zellen ist, konnte Ding et al. zeigen. Sie fanden heraus, dass BXD2-IL-17RA(-/-) Mäuse zwar CXCR5+CD4+ Tfh-Zellen mit normalen Funktionen bilden konnten, sich diese aber außerhalb der Keimzentren befanden und somit nicht im direkten Kontakt mit den B-Zellen in den Keimzentren standen. Auch die Neutralisation des Zytokins IL-17A führte dazu, dass Tfh- und B-Zellen nicht direkt miteinander interagieren konnten und wirkte sich somit negativ auf die Bildung von Autoantikörper-produzierenden B-Zellen aus (Ding et al., 2013). Zusammengefasst deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass das Zytokin IL-17A bei der Entstehung der Atemwegstoleranz beteiligt ist. Dies äußert sich v. a. in einer reduzierten Anzahl an CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen und einer vermehrten Expression typischer Marker follikulärer T-Helferzellen in der Abwesenheit von IL-17A. 171 Diskussion 7.3 IL-17A ist an der antiviralen Immunantwort nach Infektionen mit Rhinoviren beteiligt Virale Infektionen stellen die Hauptursache von Asthma-Exazerbationen dar. Im Kindesalter stehen besonders Rhinoviren unter Verdacht, für das Ausbilden der Asthmaerkrankung mit verantwortlich zu sein (s. 3.1.2.3). An der durch Viren hervorgerufenen Immunantwort sind eine Vielzahl an Zellen und Zytokinen beteiligt. Man geht auch davon aus, dass IL-17A dabei eine Rolle spielt. 7.3.1 Beeinträchtigung antiviraler Gene in IL-17A defizienten Zellen im murinen Modell allergischen Asthmas In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, wie sich eine IL-17A Defizienz auf die antivirale Immunantwort bei bestehendem Asthma auswirkt. Ein Microarray lieferte erste Hinweise, dass die Abwesenheit von IL-17A in CD4+ T-Zellen der Lunge besonders bei Mitgliedern der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase-Familie (Oas1a, Oas1c und Oas1g) zu einem starken Rückgang der Genexpression führte. Diese Ergebnisse konnten im Lungengewebe, in den Lymphknoten, in CD11c+ Lungenzellen und auch in Mastzellen bestätigt werden. Es konnte auch gezeigt werden, dass dies in CD4+- und CD11c+- Lungenzellen mit einem Rückgang der Ifn mRNA Expression einherging. Ifnzählt zu den Typ I Interferonen und gilt als Initiator des antiviralen OAS1-RNaseL-Signalwegs. Der direkte Einfluss des Interleukins 17A auf die Genexpression der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase 1g konnte durch Hemmung der Il-17a Genexpression mittels siRNA bestätigt werden. Bei in vitro Studien mit einer den Hepatitis B-Virus produzierenden Zelllinie konnte bereits gezeigt werde, dass IL-17A die Replikation des DNA-Virus unterdrücken kann, indem antivirale Gene wie z. B. OAS1 vermehrt exprimiert wurden (Wang et al., 2013). Jedoch kann nicht automatisch davon ausgegangen werden, dass IL-17A als Reaktion auf jede beliebige Virenart antivirale 172 Diskussion Eigenschaften vermittelt. So konnte im murinen Modell gezeigt werden, dass eine primäre RSV Infektion zu einem Anstieg des IL-17A Proteins führt, jedoch die virale Clearance vermindert war (Mukherjee et al., 2011; Martinez et al., 2012). Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, wie sich eine IL-17A Defizienz bei einer Infektion mit dem Rhinovirus 1b auswirkt. Es konnte gezeigt werden, dass IL-17A(-/-) Mastzellen, welche aus dem Knochenmark generiert und mit dem RV1b infiziert wurden, nicht mehr in der Lage waren, die Virusreplikation zu unterbinden. Zudem war in diesen Zellen kaum Oas1g mRNA nachweisbar, obwohl kein Defekt der Ifn Genexpression vorlag. Somit erscheint eine IL-17A Defizienz gleich in mehrfacher Hinsicht die antivirale Effizienz von Mastzellen einzuschränken. So sind sie nicht mehr in der Lage, die virale Replikation zu unterdrücken. Unter Berücksichtigung vorangegangener Untersuchungen, die zeigten, dass bei latenten HIV Infektionen Mastzellen als Reservoir für den Virus dienen (Sundstrom et al., 2007), ist es möglich, dass in Abwesenheit von IL-17A den infizierten Mastzellen eine ähnliche Funktion zuzuschreiben ist. Dafür spricht auch, dass die virale Infektion bei IL-17A(-/-) Mastzellen zu keinem weiteren Anstieg der LDH-Aktivität führte. Des Weiteren tragen Mastzellen normalerweise zur antiviralen Immunantwort bei, indem sie Botenstoffe wie Histamin freisetzen, welche u. a. bewirken, dass vermehrt Sekret gebildet wird und so Pathogene besser ausgeschieden werden können (Urb and Sheppard, 2012). Im vorliegenden Modell produzierten und sezernierten IL-17A defiziente Mastzellen jedoch weniger Histamin und auch die Anzahl an PAS+ Zellen war reduziert, womit auch dieser Abwehrmechanismus eingeschränkt wäre. Zudem können Mastzellen als APCs fungieren und somit T-Lymphozyten aktivieren. Im Mausmodell konnte bereits gezeigt werden, dass Mastzellen nach viraler Aktivierung CD8+ T-Zellen an den Ort der Entzündung rekrutieren (Orinska et al., 2005). In der vorliegenden Arbeit wurde beobachtet, dass im Lungengewebe naiver IL-17A(-/-) Mäuse weniger Mastzellen vorliegen. Außerdem waren die CD8+ T-Zellen im Lungengewebe und in den Lymphknoten von gesunden IL-17A(-/-) Mäusen im Vergleich zu 173 Diskussion Wildtyp-Mäusen nur in geringer Anzahl nachzuweisen. Dies lässt darauf schließen, dass sich der Virus im Falle einer Infektion leichter ausbreiten kann. All diese Beobachtungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass im Falle der Mastzellen der RV1b IL-17A und somit auch Oas1g inhibiert, um sich so besser in den Mastzellen replizieren und diese möglicherweise sogar als Reservoir nutzen kann. Da Rhinoviren die Antigen-Präsentation umgehen können und so T-Zellen direkt infizieren und aktivieren können (Ilarraza et al., 2013), wurde in der vorliegenden Arbeit der Fragestellung nachgegangen, ob und wenn ja, wie der RV1b Th17-Zellen beeinflusst und wie sich eine bestehend Asthmaerkrankung dabei auswirkt. Dazu wurden CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe isoliert und mit dem RV1b infiziert. Es konnte beobachten werden, dass CD4+ T-Zellen aus dem Lungengewebe von asthmatischen Wildtyp-Mäusen nach der Infektion mit dem RV1b signifikant weniger IL-17A freisetzten als nicht infizierte Zellen. Konsequenterweise wiesen diese Zellen auch eine vergleichbare Viruslast wie IL-17A defiziente Zellen auf. In den Wildtyp-Zellen war zwar auch nach der viralen Infektion noch Oas1g mRNA nachweisbar, entgegen der Erwartungen unterschied sich die Expression jedoch nicht von der in nicht infizierten Wildtyp-Zellen. Es konnte aber auch gezeigt werden, dass die Allergenbehandlung die Genexpression von Ifnsowohl in Wildtyp- als auch in IL-17A (-/-) Mäusen stark verminderte. Somit kann man davon ausgehen, dass der antivirale OAS1-RNasL Signalweg bereits zu Beginn beeinträchtigt wurde. Typ I Interferone sind nicht nur entscheidend für die Abwehr unterschiedlichster Pathogene, ihre Transkription wird auch hauptsächlich durch PAMPs (pathogen associated molecular patterns, Pathogen-assoziierte molekulare Muster) aktiviert (Prinz and Knobeloch, 2012). Ein Bestandteil der durch PAMPs aktivierten Signalkaskade ist NF-κB, welcher in den Zellkern transloziert und so die Expression der Typ I Interferone mit induziert (Honda and Taniguchi, 2006). Wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben, ist NF-κB auch an der dem Zytokin IL-17A nachgeschalteten 174 Diskussion Signalweiterleitung beteiligt. Dies veranlasst zu der Vermutung, dass IL-17A möglicherweise die Genexpression der Typ I Interferone mit induziert. Diese Annahme wird dadurch bestärkt, dass man mithilfe von BXD2-Mäusen - ein Mausstamm der Lupus-ähnliche Symptome entwickelt - herausfand, dass IL-17A die Expression von Ifnfördert und somit auch die IFNvermittelte Antikörper Produktion (Wang et al., 2008; Wang and Mountz, 2008). Nach der Transkription akkumuliert OAS1 als inaktives Monomer im Zytoplasma und wird erst durch Binden viraler dsRNA aktiviert. Dies hat zur Folge, dass 2´-5´-Polyadenylat aus ATP synthetisiert wird, welches wiederum die inaktive RNaseL aktiviert. Dieses Enzym wiederum degradiert u. a. die virale RNA und ist somit entscheidend für die Viruselimination. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten zeigen, dass eine IL-17A Defizienz in asthmatischen Mäusen nicht nur zu einer verminderten Expression der Oas1-Familienmitglieder führte, sondern folglich auch zu einer reduzierten Genexpression der RNaseL in CD4+ Lungenzellen. Bisher ist nur bekannt, dass IL-17A zusammen mit IFN- die RNase 7 induziert, welche zur RNase A-Superfamilie zählt und v. a. in Keratinozyten zu finden ist. Diesem Enzym werden hauptsächlich antimikrobielle Eigenschaften zugeschrieben (Simanski et al., 2013). Wie die Ergebnisse des Microarrays zeigen konnten, kam es in Abwesenheit von IL-17A auch zu einer verminderten Genexpression von Cxcr3. Wie in diversen Modellen deutlich wurde, scheint dieser Chemokinrezeptor entscheidend für die Rekrutierung zytotoxischer T-Zellen und somit für die Viruselimination zu sein (Christensen et al., 2006; Stiles et al., 2006; Lindell et al., 2008). Des Weiteren wird Cxcr3 auch bevorzugt von pDCs (plasmazytoide DCs) exprimiert. Diese Zellen sind im Menschen u. a. durch CD4, CD86 und CD123 gekennzeichnet. In der Maus gelten Ly6C+B220+CD11cloCD4+ Zellen als Interferonproduzierende pDCs (Asselin-Paturel et al., 2001; Swiecki and Colonna, 2010). Diese Zellen stellen eine Schlüsselrolle bei der antiviralen Immunantwort dar, da sie über Typ I Interferone 175 Diskussion die Reifung von mDCs fördern und somit auch zur Aktivierung der T-Zell-vermittelten Immunantwort beitragen. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Migration der pDCs vom Ort der viralen Infektion hin zu den Lymphknoten von Cxcr3 abhängt (Yoneyama et al., 2005; Lindell et al., 2008). Neben Cxcr3 wurde noch ein weiteres Oberflächenmolekül identifiziert, welches von pDCs exprimiert wird. Dabei handelt es sich um PDC-Trem, einen Rezeptor, welcher bevorzugt nach Stimulation von TLRs (Toll-like-recpetors) von pDCs exprimiert wird und für die vermehrte Produktion von Typ I Interferonen durch pDCs verantwortlich ist (Watarai et al., 2008). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass PDC-Trem trotz eingeschränktem TLR-Signal induziert werden kann, danach jedoch keine Typ I Interferone produziert wurden (Watarai et al., 2008). Die Ergebnisse des Microarrays wiesen darauf hin, dass PDC-Trem in IL-17A defizienten CD4+ T-Zellen von asthmatischen Mäusen vermehrt exprimiert wurde. Im vorliegenden Modell konnte zudem beobachtet werden, dass die Allergenkonfrontation sowohl in Wildtyp- als auch in IL-17A(-/-) Mäusen zu einer verminderten Ifn mRNA Expression in CD4+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu stieg in CD11c+ Lungenzellen von asthmatischen Wildtyp-Mäusen die Ifn Genexpression an, wohingegen sie in IL-17A defizienten Zellen, unabhängig von der Behandlung, nur in verminderten Maßen nachgewiesen werden konnte. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass in Abwesenheit von IL-17A das TLR-abhängige Signal eingeschränkt ist und somit zwar PDC-Trem induziert, die Produktion der Typ I Interferone jedoch nicht aktiviert werden konnte. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit im murinen Modell gezeigt werden, dass IL-17A einen wichtigen Bestandteil der antiviralen Immunantwort darstellt, da es sowohl Zellen der angeborenen als auch der erworbenen Immunantwort beeinflusst. 176 Diskussion 7.3.2 Rhinoviren inhibieren IL-17A in den PBMCs von Kindern mit Asthma In der vorliegenden Arbeit wurden die im murinen Modell gewonnen Erkenntnisse auch im humanen Probenmaterial überprüft. Das zugrundeliegende Material entstammte der europaweiten Studie PreDicta. Im Zuge dieser Studie wurden gesunde Kinder und an Asthma erkrankte Kinder rekrutiert. Aus ihrem Vollblut wurde entweder direkt die RNA extrahiert oder PBMCs isoliert und weiter analysiert. Des Weiteren wurde ein Nasenabstrich durchgeführt und dieser auf Rhinoviren hin getestet. Die Ergebnisse wurden abschließend miteinander in Verbindung gebracht. So konnte in der vorliegen Arbeit gezeigt werden, dass eine Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen bei Kindern mit Asthma zu einem Rückgang der IL-17A Proteinkonzentration und der OAS1 Expression führte. Dennoch konnte in diesen Kindern ein Anstieg der IFNGenexpression verzeichnet werden. Bei in vitro Zellkulturen mit PBMCs von gesunden und an Asthma erkrankten Spendern konnten Khaitov et al. bzw. Sykes et al. ebenfalls einen Anstieg der IFN- Expression nach Infektion mit RV16 nachweisen (Khaitov et al., 2009; Sykes et al., 2012). Dementgegen stehen Berichte, dass Rhinoviren Typ I Interferone inhibieren, wobei dies zumeist keinen nennenswerten Einfluss auf die Expression oder Aktivierung von antiviralen Molekülen hatte, welche man mit Typ I Interferonen in Verbindung bringt. Hierbei ist jedoch zu berücksichtigen, dass es sich bei den untersuchten Zellen nicht um PBMCs sondern um bronchiale Epithelzellen bzw. Zellen der Bronchoalveolären Lavage von gesunden und asthmatischen Spendern handelte. Außerdem entstammten einige der Ergebnisse aus Versuchen mit der humanen Epithelzellline A549 (Kotla et al., 2008; Baraldo et al., 2012; Edwards et al., 2012; Sykes et al., 2012). So besteht die Möglichkeit, dass Epithelzellen, welche als erster Zelltyp mit dem Rhinovirus in Kontakt kommen, anders auf eine virale Infektion reagieren, als PBMCs aus dem Blut, welche erst später in die Immunantwort mit einbezogen werden. Außerdem ist zu berücksichtigen, dass 177 Diskussion bei den vorher aufgeführten Experimenten anderer Arbeitsgruppen die Zellen in vitro mit Rhinoviren infiziert und für unterschiedliche Zeitspannen kultiviert wurden. Im Gegensatz dazu wurden die PBMCs in der vorliegenden Arbeit nicht in vitro infiziert. Stattdessen wurde berücksichtigt, ob in den jeweils abgenommenen Nasopharynxabstrichen Rhinoviren nachweisbar waren, also eine Infektion in vivo vorlag. Weiterhin wurden die Zellen bei den zuvor erwähnten Experimenten immer nur mit einem bestimmten Rhinovirus (z. B. RV16, RV14) infiziert. Bei der Analyse des Nasenabstriches wurden jedoch ganz allgemein Rhinoviren der Gruppe A, B und C detektiert. Es wurde also nicht näher darauf eingegangen, welcher Serotyp genau vorlag. Iikura et al. haben ebenfalls PBMCs von Kindern mit Asthma (2 - 6 Jahre) analysiert. Sie fanden jedoch bezüglich der Typ I Interferone keinen Unterschied zwischen gesunden und erkrankten Kindern, wobei hier unterschieden wurde, ob die Kinder giemten oder nicht (Iikura et al., 2014). Auch hier wurden die Zellen erst ex vivo mit dem RV 14 infiziert. Die Tyrosinkinase Tyk-2, welche für die Weiterleitung des IFNSignals und somit für die Transkription der 2´-5´-Oligoadenylatsynthetase wichtig ist, wies in allen Kindern, egal ob gesund oder krank bzw. ob mit oder ohne positiven Testergebnis für Rhinoviren, eine unveränderte Expression auf. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der für Th1–Zellen typische Transkriptionsfaktor T-BET in den PBMCs von Kindern mit Asthma und einer Rhinovirusinfektion in den oberen Atemwegen erhöht vorlag. Diese Beobachtung könnte eine mögliche Erklärung für die IL-17A Inhibition sein. Wie unsere Arbeitsgruppe und andere bereits zeigen konnten, wirkt T-BET auf die IL-17A Produktion suppressiv (Reppert et al., 2011; Yeh et al., 2014). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei gesunden Kindern, welche positiv auf Rhinoviren getestet wurden, IL-6 und T-BET invers miteinander korrelieren. So gehen erhöhte IL-6 Expressionswerte mit einer erniedrigten T-BET mRNA Expression einher. Diese Tendenz war zwar bei Kindern mit Asthma auch zu erkennen, jedoch nicht so deutlich 178 Diskussion wie bei den Kontrollkindern. In vorherigen Arbeiten fand unsere Arbeitsgruppe bereits heraus, dass in den PBMCs von Kindern mit Asthma IL-6 und der Th1-Transkriptionsfaktor T-BET invers korrelieren, bei gesunden Kindern jedoch nicht (Koch et al., 2013). In diesem Zusammenhang erscheint diese inverse Korrelation also eher negativ, da Th1-Zellen bei Asthma als protektiv gelten, wohingegen IL-6 entzündungsfördernde Eigenschaften vermittelt. Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse ist jedoch im Hinblick auf eine Rhinovirusinfektion diese Korrelation eher positiv zu bewerten, da IL-6 an der Differenzierung von Th17-Zellen beteiligt ist, wohingegen T-BET Th17-Zellen negativ reguliert. Neben T-BET ist auch der Transkriptionsfaktor ETS1 als Inhibitor von IL-17A beschrieben (Moisan et al., 2007). Die Analyse der PBMCs ergab, dass auch dieser Faktor in Kindern mit Asthma, welche positiv auf Rhinoviren getestet wurden, tendenziell erhöht vorlag. 7.3.3 IL-17A induziert die antivirale Immunantwort in Epithelzellen In den Atemwegen kommen Rhinoviren zuerst mit Epithelzellen in Kontakt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher anhand der humanen Epithelzelllinie A549 untersucht, ob die antiviralen Eigenschaften des Zytokins IL-17A auch bei diesen Zellen von Bedeutung sind. So konnte gezeigt werden, dass die virale Replikation in Anwesenheit von 50 ng/ml rIL-17A erheblich eingeschränkt wurde, ohne sich dabei nennenswert auf die LDH-Aktivität auszuwirken. Ein signifikanter Anstieg der OAS1 mRNA Expression erfolgte dagegen schon bei einer Konzentration von 25 ng/ml rIL-17A. In HepG2.2.15 Zellen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass IL-17A in der Lage ist, die Replikation des Hepatitis-B-Virus zu unterdrücken, ohne dass dabei zytopathische Effekte auftraten (Wang et al., 2013). Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, gehen Wang et al. nicht davon aus, dass die IL-17A vermittelten Effekte von der Dosis abhängen, wobei anzumerken ist, dass in 179 Diskussion diesen Experimenten IL-17A nur im Konzentrationsbereich von 250 pg/ml und 4 ng/ml eingesetzt wurde (Wang et al., 2013). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass höhere Dosen notwendig sind, um Unterschiede zu erkennen. 7.3.4 Arzneimittel beeinflussen die antivirale Immunantwort Asthma bronchiale wird üblicherweise mit kurz- und langwirksamen 2-Sympathomimetika und Steroiden behandelt (s. 3.1.5). Um akuten Verschlimmerungen der Symptome, welche z. B. durch virale Infektionen hervorgerufen wurden, entgegenzuwirken, kann kurzfristig die Therapie umgestellt werden, indem die übliche Dosis des jeweiligen Medikamentes erhöht wird oder eine nicht-steroidale Therapie mit einem Glucocorticoid ergänzt wird. So kann zwar gegen die Entzündungsreaktion vorgegangen werden, ob sich dies aber auch positiv auf die antivirale Immunantwort auswirkt, bleibt fraglich. Anhand von PBMCs, welche mit RV16 infiziert wurden, konnte Davies et al. zeigen, dass Budesonid (Steroid) in Kombination mit Formoterol (2-Sympathomimetika) sowohl INF als auch OAS1 inhibiert (Davies et al., 2011). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen ebenfalls darauf hin, dass in den PBMCs von Kindern, welche mit Steroiden alleine bzw. in Kombination mit einem Nicht-Steroid behandelt wurden, die OAS1 Genexpression unterdrückt wurde. Bei Analysen des Gesamtblutes auf mRNA-Ebene zeigte sich auch, dass IL-17A ebenfalls negativ durch eine Kombination dieser Arzneimittel beeinflusst wurde. Diese Beobachtung wird dadurch bestärkt, dass in Biopsien des Bronchialgewebes von Patienten mit moderatem bis schwerem Asthma gezeigt werden konnte, dass die orale Applikation von Glucocorticoiden einen Rückgang der IL-17-produzierenden Zellen bewirkte (Chakir et al., 2003). Der Rückgang der IL-17-produzierenden Zellen mag auch mit dem Einfluss von Glucocorticoiden auf Dendritische Zellen zusammenhängen. Es konnte nämlich gezeigt werden, dass DCs, welche mit Steroiden behandelt wurden, nicht mehr so gut in der Lage sind, die T-Zellproliferation 180 Diskussion einzuleiten, da die Steroide die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 sowie die Freisetzung von Zyokinen wie beispielsweise IL-12 stark beeinträchtigen (Rozkova et al., 2006; Larangé et al., 2012). Weiterhin ergab sich, dass Steroide die durch den TLR7 vermittelte Maturation der DCs unterdrückten. Dieser Rezeptor ist in der Lage, ssRNA (single stranded RNA) zu erkennen und ist somit maßgeblich an der antiviralen Immunantwort beteiligt (Diebold et al., 2004; Larangé et al., 2012). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt bei pDCs zur Produktion von IFN,womit sie, wie vorher bereits beschrieben, an der antiviralen Immunantwort beteiligt sind(Gibson et al., 2002). Zusammengefasst mag es zwar zunächst als sinnvoll erscheinen, bei Verschlechterung der Asthmasymptomatik Glucocorticoide verstärkt einzusetzen, allerdings sollte hierbei berücksichtig werden, wodurch die Exazerbation ausgelöst wurde. Im Falle einer viralen Infektion scheint der Einsatz von Steroiden in Bezug auf die antivirale Immunantwort nicht unbedingt empfehlenswert zu sein. Weiterhin erscheint die Unterdrückung des Zytokins IL-17A im Verlauf des Asthma bronchiale einen sinnvollen Therapieansatz darzustellen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen jedoch auch darauf hin, dass im Falle einer viralinduzierten Asthma-Exazerbation die Neutralisation dieses Zyotkins gravierende Auswirkungen haben kann. So konnte Newcomb et al. im Mausmodell bereits zeigen, dass bei einer bestehenden allergischen Atemwegsentzündung IL-17A in der Lage ist, die durch eine virale Infektion hervorgerufene Atemwegshyperreaktivität zu unterdrücken (Newcomb et al., 2013). So ist auf diesem Gebiet immer noch weiterer Forschungsbedarf erfoderlich, um herauszufinden, ob und wann eine Neutralisation bzw. Inhibition des Zytokins IL-17A sinnvoll und angebracht ist. 181 Literaturverzeichnis 8 Literaturverzeichnis Afkarian, M., Sedy, J.R., Yang, J., Jacobson, N.G., Cereb, N., Yang, S.Y., Murphy, T.L. and Murphy, K.M., 2002, T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naïve CD4+ T cells. Nat Immunol 3, 549-57. Aggarwal, S. and Gurney, A.L., 2002, IL-17: prototype member of an emerging cytokine family. 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Abb. 5-3: Behandlungsprotokoll zur Induktion des allergischen Asthmas ______________ 79 Abb. 5-4: Behandlungsprotokoll zur Induktion der Atemwegstoleranz _________________ 79 Abb. 5-5: Diagramm zum Verlauf der Atmung ___________________________________ 80 Abb. 6-1: Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell ____________________________________________________________ 101 Abb. 6-2: „Gating“-Strategie zur Analyse eosinophiler und neutrophiler Granulozyten in der BAL ____________________________________________________________________ 102 Abb. 6-3: Analyse der eosinophilen und neutrophilen Granulozyten in der BAL von Wildtypund IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen Asthmamodell mit Hilfe der Durchlusszytometrie 103 Abb. 6-4: Analyse der Mastzellen in den Gesamtzellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ________________________________________________________ 105 Abb. 6-5: Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von naiven Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen__________________________________________________ 107 Abb. 6-6: TGF- Konzentration in den Kulturüberständen während der Generierung von Mastzellen aus dem Knochenmark von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen ______________ 108 Abb. 6-7: Bestimmung des Entzündungsgrades der Lunge von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas ________________________________ 109 Abb. 6-8: Detektion der PAS+-Zellen im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im allergischen Asthmamodell _______________________________________________ 110 Abb. 6-9: Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell __________________________________ 111 Abb. 6-10: Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell ___________________________________ 112 Abb. 6-11: Analyse des Interleukins 13 in CD4+ T-Lymphozyten der Lunge von Wildtypund IL-17A(-/-) Mäusen im murinen Asthmamodell _______________________________ 114 Abb. 6-12: IFN- in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas ________________________________________________ 115 Abb. 6-13: Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Modell allergischen Asthmas ________________________________________________ 116 Abb. 6-14: Analyse der anti-inflammatorischen Zytokine IL-10 und Tgf im murinen Asthmamodell ____________________________________________________________ 117 198 Abbildungsverzeichnis Abb. 6-15: Messung der AHR in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach Induktion der Atemwegstoleranz ______________________________________________________ 119 Abb. 6-16: Bestimmung der IgE Konzentration im Serum von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell ________________________________________ 120 Abb. 6-17: Analyse der Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13 in der BALF von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell ___________________________ 121 Abb. 6-18: Analyse der Treg-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Toleranzmodell ___________________________________________________________ 123 Abb. 6-19: Analyse der Il-6 und Il-21 mRNA Expression im Lungengewebe von Wildtypund IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell ______________________________ 125 Abb. 6-20: Analyse der Transkriptionsfaktoren Bcl6 und Batf im Lungengewebe von tolerogenen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ____________________________ 126 Abb. 6-21: Untersuchung der Oberflächenmarker Cxcr5, Il-6r und Il-21r im Lungengewebe von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im Toleranzmodell ___________________ 127 Abb. 6-22: Heat-map und graphische Darstellung der Microarry-Analyse _____________ 130 Abb. 6-23: Analyse der Oas1g und Oas1a mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Lunge von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen ___________________________________ 131 Abb. 6-24: Analyse der Oas1g mRNA Expression im Lungengewebe und in den Lymphknotenzellen von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell ________________________________________________________________________ 132 Abb. 6-25: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD11c+ Lungenzellen im murinen Asthmamodell und in ausdifferenzierten Mastzellen des Knochenmarks von Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen__________________________________________________ 132 Abb. 6-26: Analyse der Ifn mRNA Expression in Wildtyp- und IL-17A defizienten Zellen ________________________________________________________________________ 134 Abb. 6-27: Analyse der CD8+ T-Zellen in Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen im murinen Asthmamodell _____________________________________________________ 135 Abb. 6-28: Analyse der IL-17A Konzentration in den Zellkulturüberständen der CD4+ T-Zellen der Milz nach Transfektion mit Il-17a siRNA ___________________________ 137 Abb. 6-29: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz nach Kultur und Transfektion mit Il-17a siRNA ___________________________________________ 138 Abb. 6-30: Analyse der Oas1g mRNA Expression in CD4+ T-Zellen der Milz von asthmatischen Wildtyp Mäusen nach in vitro Transfektion mit Il-17a siRNA___________ 139 Abb. 6-31: Analyse der Viruslast in Mastzellen nach Infektion mit dem RV1b _________ 140 Abb. 6-32: Analyse der LDH Aktivität in den Zellkulturüberständen generierter Mastzellen vor bzw. nach Infektion mit dem RV1b ________________________________________ 141 Abb. 6-33 Analyse der Ifn und Oas1g mRNA Expression in infizierten, generierten Mastzellen _______________________________________________________________ 142 Abb. 6-34: Analyse virusinfizierter CD4+ T-Zellen im murinen Asthmamodell _________ 143 Abb. 6-35: Ifn und Oas1g Genexpressions-Analyse in CD4+ Lungenzellen von naiven und asthmatischen Wildtyp- und IL-17A defizienten Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b ___________________________________________________________________ 145 Abb. 6-36: Analyse der IL-17A Freisetzung allergenspezifischer CD4+ T-Zellen aus der Lunge von Wildtyp Mäusen nach in vitro Infektion mit dem RV1b __________________ 145 199 Abbildungsverzeichnis Abb. 6-37: Analyse der IL-17A Proteinkonzentration und OAS1 mRNA Expression in PBMCs von Vorschulkindern ________________________________________________ 148 Abb. 6-38: Analyse der IFNund TYK2 Genexpression in PBMCs von Vorschulkindern _ 149 Abb. 6-39: Analyse der T-BET und ETS1 Genexpression in gesunden und an Asthma erkrankten Vorschulkindern _________________________________________________ 150 Abb. 6-40: Korrelation der IL-6 und T-BET mRNA Expression in den PBMCs von Kontrollund Asthmakindern mit positiven Rhinovirusnachweis im Nasenabstrich ______________ 151 Abb. 6-41: Analyse humaner A549 Zellen nach Infektion mit dem RV1b und Zellkultur mit unterschiedlichen Konzentrationen rIL-17A _____________________________________ 152 Abb. 6-42: Analyse der IL-17A und OAS1 Genexpression unter Berücksichtigung der Arzneimitteltherapie _______________________________________________________ 154 200 Tabellenverzeichnis 10 Tabellenverzeichnis Tabelle 3-1: Schweregrad – Einteilung des stabilen Asthma bronchiale bei Erwachsenen __ 23 Tabelle 3-2: Grad der Asthmakontrolle bei Erwachsenen ___________________________ 25 Tabelle 5-1: Laborgeräte ____________________________________________________ 57 Tabelle 5-2: Verbrauchsmaterialien ____________________________________________ 58 Tabelle 5-3: Chemikalien und Reagenzien _______________________________________ 60 Tabelle 5-4: ELISA-Kits ____________________________________________________ 60 Tabelle 5-5: Antikörper und Zytokine __________________________________________ 61 Tabelle 5-6: Antikörper für Durchflusszytometrische Analysen ______________________ 61 Tabelle 5-7: Beads zur magnetischen Zellseparation _______________________________ 61 Tabelle 5-8: Sequenzen der Genotypisierungs-Primer für IL-17A(-/-) PCR ______________ 62 Tabelle 5-9: Sequenzen der Primer für die Rhinovirus PCR _________________________ 62 Tabelle 5-10: Sequenzen der qPCR Oligonukleotide _______________________________ 63 Tabelle 5-11: Übersicht der an der PreDicta-Studie beteiligten Kinder _________________ 66 Tabelle 5-12: Übersicht über verwendete Flourochrome und deren Detektoren __________ 94 Tabelle 6-1: Ergebnisse des Microarrays _______________________________________ 129 201 Formelverzeichnis 11 Formelverzeichnis Formel 5-1: Berechnung der Penh _____________________________________________ 81 Formel 5-2: ∆∆Ct Methode zur Berechnung der relativen Quantifizierung _____________ 93 Formel 5-3: Berechnung der LDH Aktivität _____________________________________ 98 202 Abkürzungsverzeichnis 12 Abkürzungsverzeichnis 2-5 A 2´-5´-Polyadenylat Ak Antikörper Alum Aluminiumkaliumsulfat Act1 Actin related gene 1 AHR Atemgwegshyperreaktivität AlK(SO4)2 Aluminiumkaliumdisulfat Aqua dest. Aqua destillata APCs Antigenpräsentierende Zellen APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adeonosin-Triphosphat BAL bronchoalveoläre Lavage BALF bronchoalveoläre Lavage Flüssigkeit BATF basic leucine zipper transcription factor, ATF like Bcl6 B cell lymphoma 6 BCR B cell receptor bp Basenpaare BSA Bovines Serum Albumin (Kälberserum) ca. circa CBAD C/EPF activation domain CD cluster of differntiation CD62L CD62 Ligand (= L-Selektin) cDNA complementary DNA C/EP1 CCAAT/enhancer binding protein CO2 Kohlenstoffdioxid Ct threshold cycle CTL cytotoxic T lymphocyte CTLA cytotocix T lymphocyte-associated antigen CTLD C-type lectin-like domain CXCR CXC-Motiv-Chemokinrezeptor DC Dendritische Zelle DKO double knock out DNA desoxyribonucleic aci DMSO Dimethylsulfoxid 203 Abkürzungsverzeichnis dNTPs Desoxy-Nukleosid Triphosphat dsRNA doppelstränige RNA EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay et al et alii (und andere) EtOH Ethanol ETS1 v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog -1 Fab Antigen-bindendes Fragmente FACS Fluorescence Activated Cell Sorting FCS Fetal Calf Serum (Fetales Kälberserum) Foxp3 Foxhead box P3 FSC Forward Scatter Fwd forward g Gramm g Zentrifugalbeschleunigung (x g) GATA-3 GATA-binding protein-3 GFP green fluorescent protein (grün fluoreszierendes Protein) GITR glucocorticoid-induced tumor-necrosis factor receptor-related protein GM-CSF Granulocyte macrophage conoly-stimulating factor h Stunde H2O2 Wasserstoffperoxid H2SO4 Schwefelsäure HCl Salzsäure HE Haematoxylin-Eosin HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase HRP horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) HIV Humanes Immundefizienz Virus HLA human leukocyte antigen ICAM intercellular adhesion molecule ICS inhalative Corticosteroide IFN Interferon IFNAR Interferonalpha Rezeptor IFNGR Interferon gamma Rezeptor IFNLR1 Interferon lambda Rezeptor 1 Ig Immunglobulin 204 Abkürzungsverzeichnis Ighg Immunoglobulin heavy chain, gamma polypeptide IL Interleukin IL-17A(-/-) IL-17A Defizienz i.n. intranasal i.p. intraperitoneal IRF interferon regulation factor ISGF3 IFN-stimulated gene factor 3 ISRE IFN-stimulated response element iTreg induzierbare Treg JAK1 Januskinase 1 kb Kilo-Basenpaare KCl Kaliumchlorid kd Kilodalton KHCO3 Kaliumhydrogencarbonat KOH Kaliumhydroxid ko knockout LAG3 lymphocyte activation gene 3 LDH Lactat-Dehydrogenase LDL low density lipoprotein LPS Lipopolysaccarid LTRA Leukotrienantagonisten MACS Magnetic Activated Cell Sorting MAPK mitogen-activated protein kinase MCh Methacholin mg Milligramm MgCl2 Magnesiumchlorid MHC Haupthistokompatibilitätskomplex min Minute ml Milliliter MMP Metalloproteinase mRNA messenger RNA MUC mucin Na Natrium NaCl Natriumchlorid Na2CO3 Dinatriumcarbonat 205 Abkürzungsverzeichnis NH4Cl Ammoniumchlorid NAD Nicotinamidadenindinukleotid Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NaH2PO4 Natriumhydrogenphosphat NaHCO3 Natriumhydrogencarbonat NaN3 Natriumazid NaOH Natriumhydroxid NFAT nuclear factor of activated T cells Nfil3 nuclear factor, IL 3 regulated ng Nanogramm NF-κB Nuclear factor ´kappa-light-chain-enhancer´of activated B-cells NK-Zellen Natürliche Killer Zellen NKT-Zellen Natürliche Killer T-Zellen nm Nanometer nM nanomolar nTreg natürliche Treg OAS1 2´ 5´ Oligoadenylatsynthetase 1 OVA Ovalbumin p Irrtumswahrscheinlichkeit PAMP pathogen associated molecular patterns PAS Periodic Acid Schiff reaction PDC plasmacytic dendritic cell pg Pikogramm PBS phosphate buffered saline PBMCs peripheral blood mononuclear cells PCR Polymerasekettenreaktion PEF peak expiratory flow Penh Pause enhanced PIF Peak inspiratory flow PMA Phorbol-12-myristate 13-acetate PreDicta Post infectious immune-reprogramming and its association with persistance and chronicity of respiratory allergic disease PPRs Pattern-Recognition-Receptors PU.1 Spi-1 proto-oncogene qPCR quantitative Real-Time Polymerasekettenreaktion 206 Abkürzungsverzeichnis r rekombinant RABA kurzwirksame 2-Agonisten rev reverse RISC RNA-induced silencing complex RNA Ribonukleinsäure RNaseL latente Ribonuclease RORt Retinoic acid-related orphan recptor t rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium Rrs Respiratory systeme resistance RSV Respiratorischer Synzytial-Virus RT Raumtemperatur RV Rhinovirus sec Sekunde SCF stem cell factor SDS Natriumdodecylsulfat SEM standard error of the mean (Standardfehler) siRNA small interfering RNA SOCS suppressor of cytokine signaling SSC Side scatter STAT signal transducer and activator of transcription TAE Tris-Acetat-EDTA T-bet T-box expressed in T cells Tc Cytotoxic T-lymphocyte TCRs T cell Receptors Te Expirationszeit TEMED N,N´,N,N´-Tetramethylethylendiamin Tfh-Zellen follikuläre T-Helferzellen TGF- Transforming growth factor beta Th-Zellen T-Helferzellen TILL TIR/Toll/IL-1R TLR Toll like receptor TMB 3, 3´, 5,5´-Tetramethylbenzidin TNF Tumor necrosis factor TNFR tumor necrosis factor receptor 207 Abkürzungsverzeichnis Tr1 regulatorische T-Zellen vom Typ 1 TRAF6 TNFR-associated factor 6 Treg-Zellen regulatorische T-Zelle TREM triggering receptor expressed on myeloid cells TSLP thymic stromal lymphopoietin TYK2 Tyrosinkinase 2 U Units u.a. unter anderem unst. unstimuliert wt Wildtyp z. B. zum Beispiel α anti μg Mikrogramm μl Mikroliter 208 Publikationen 13 Publikationen Übel, C., Koch, S., Meier, A., Sopel, N., Graser, A., Mousset, S. und Finotto, S., 2012. Local immunotherapy in experimental murine lung inflammation. Protocol Exchange, doi: 10.1038/protex.2012.035. Andreev, K., Graser, A., Maier, A., Mousset, S. und Susetta, F., 2012. Therapeutical measures to control airwaytolerance in asthma and lung cancer. Front Immunol. doi: 10.3389/fimmu.2012.00216 Graser, A., Zhivkova, N. und Finotto, S., 2012. Role of IL-17A in airway tolerance in a murine model of asthma. J Immunol. Volume 188 (Meeting Abstract) Koch, S., Mousset, S., Graser, A., Reppert, S., Übel, C., Reinhardt C., Zimmermann, T., Rieker, RJ., Lehr, H. A. und Finotto, S., 2013. IL-6 activated integrated BATF/IRF4 functions in lymphocytes are T-bet-independent and reversed by subcutaneous immunotherapy. Sci. Rep. doi: 10.1038/srep01754. Roumpedaki, E., Xepapadaki, P., Doudoulakakis, A., Lebessi, E., Passioti, M., Skevaki, C., Taprantzi, P., Tsakanikos, M., Tsolia, M., Dutre, T., Bachert, C., Lindholm, L., Lukkarinen, H., Jartti, T., Albert, F., Graser, A., Geissdorfer, W., Bogdan, C., Zimmermann, T., Finotto, S., Sobanska, A., Kowalski, ML. und Papadopoulos, N.G, 2013. Nasopharyngeal bacterial colonization in asthmatic children and healthy controls. ALLERGY, Volume: 68 (Meeting Abstract) Zimmermann, T. Graser, A., Koch, S., und Finotto, S., 2013. Gender specific regulation of GATA-3 in allergic asthma. Pediatric Respiratory Reviews, Volume 14, Supplement 2, doi: 10.1016/S1526-0542(13).70069-1 (Meeting Abstract) 209 Publikationen Übel, C., Sopel, N., Graser,A., Hildner, K., Reinhardt, C., Zimmermann, T., Rieker, R.J, Maier, A., Neurath, M.F., Murphy, KM. und Finotto, S. 2014. The activating protein 1 transcription factor basic leucine zipper transcription factor, ATF-like (BATF), regulates lymphocyte- and mast cell-driven immune responses in the setting of allergic asthma. J Allergy Clin Immunol. doi: 10.1016/j.jaci.2013.09.049. Übel, C.*, Graser, A.*, Koch, S., Rieker, R.J., Lehr, A., Müller, M. und Finotto, S., 2014. Role of Tyk-2 in Th9 and Th17 cells in allergic asthma. Sci. Rep. doi: 10.1038/srep05865 (*These authors contributed equally to this work) Roumpedaki, E., Xepapadaki, P., Taprantzi, P., Tineke, D., Bachert, C ., Lukkarinen, H., Jartti, T., Graser, A., Zimmermann, T., Finotto, S., Sobanska, A., Kowalski, M.L. und Papadopoulos, N.G., 2014. Atopy, rhinitis, lung function and inflammation in asthmatic preschoolers and healthy controls. ALLERGY, Volume: 69 (Meeting Abstract) Graser, A., Zimmermann, T., Papadopoulos, N. G., Vuorinen, T. und Finotto, S., 2014. IL-17A and its anti-viral properties in allergic asthma. ALLERGY, Volume: 69 (Meeting Abstract) Sopel, N., Übel, C., Graser, A., Hildner, K., Reinhardt, C., Zimmermann, T., Rieker, R.J., Neurath, M. F. Murphy, K.M. und Finotto, S.,2014. The transcription factor BATF is involved in the regulation of immune responses in allergic asthma. ALLERGY, Volume: 69 (Meeting Abstract) 210 Publikationen Vorträge und Poster 04. 05– 08.05.2012 Immunology 2012™, 99th annual meeting, Boston; Posterpräsentation und Vortrag: “Role of IL-17A in airway tolerance in a murine model of allergic asthma” 29.06 – 01.07.2013 12th International Congress of Pediatric Pulmonology, Valencia Posterpräsentation: “Gender specific regulation of GATA-3 in allergic asthma” 07.06 – 11.06.2014 European Academy and Clinical Immunology Congress 2014, Kopenhagen Posterpräsentation: “IL-17A and its anti-viral properties in allergic asthma” 211 Danksagung 14 Danksagung Ich möchte mich an dieser Stelle herzlichst bei allen Personen bedanken, die mich während der Entstehung dieser Arbeit unterstützt haben. Besonders bedanken möchte ich mich bei: Frau Prof. Dr. Dr. Susetta Finotto für die Bereitstellung des interessanten und vielfältigen Promotionsthemas und ihre Betreuung, Förderung und Unterstützung bei der Erstellung meiner Doktorarbeit. Herrn Prof. Dr. Falk Nimmerjahn für die Übernahme der Betreuung und des Erstgutachtens. Herrn Prof. Dr. Martin Herrmann für die Übernahme des Zweitgutachtens. Dem gesamten Team der PreDicta-Studie, besonders den Mitarbeitern der Kinder- und Jugendklinik in Erlangen. Der gesamten AG Finotto für das gute Arbeitsklima und die unermüdliche Hilfe und Unterstützung, vor allem an den Versuchstagen. Herrn Prof. Dr. Markus F. Neurath, Dr. Sonja Koch, Dr. Sarah Reppert und Nina Sopel für das Korrekturlesen meiner Arbeit. Meiner Familie, die mich während meiner Promotionszeit immer unterstützt hat. Maximilian, für seine Hilfe, Unterstützung und Geduld während der vergangen Jahre. 212