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Universitätsklinikum Hamburg - Eppendorf Onkologisches Zentrum Direktor: Prof. Dr. med. Carsten Bokemeyer
Erfassung von PRAME - und SOX - 2 - spezifischen Antikörpern bei Patienten mit Multiplem Myelom
Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg
vorgelegt von Sinje Albers geb. Tams aus Bremen
Hamburg 2015
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Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 3 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................... 5 Tabellenverzeichnis .................................................................................................... 5 1
Einleitung und Fragestellung .......................................................................... 6
1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5
Überblick Krankheitsbild Multiples Myelom ......................................................... 6 Epidemiologie des Multiplen Myeloms ................................................................ 7 Ätiologie und Pathogenese ................................................................................. 8 Klinik und Diagnostik ........................................................................................ 11 Therapie und neue Therapieverfahren ............................................................. 13 Prognose .......................................................................................................... 15
1.2 Tumorimmunologie und Immuntherapie ........................................................... 15 1.2.1 Tumorassoziierte Antigene ............................................................................... 17 2
Material und Methode..................................................................................... 20
2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.1.7 2.1.8 2.1.9
Material ............................................................................................................ 20 Patientenmaterial ............................................................................................. 20 Proben gesunder Spender ............................................................................... 20 Proteine ............................................................................................................ 20 Studiendesign .................................................................................................. 21 ELISA – Materialien .......................................................................................... 21 Zellseparation ................................................................................................... 22 RNA – Isolation und cDNA Gewinnung ............................................................ 22 Real – Time PCR Materialien ........................................................................... 23 sonstiges Labormaterial und Geräte ................................................................. 24
2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6
Methoden ......................................................................................................... 24 ELISA ............................................................................................................... 24 Titerbestimmung............................................................................................... 25 Bewertung der ELISA Ergebnisse .................................................................... 25 Zellseparation ................................................................................................... 26 RNA – Isolation und cDNA Gewinnung ............................................................ 26 Real-Time PCR ................................................................................................ 26
2.3
Statistische Auswertung ................................................................................... 27
3
Ergebnisse ...................................................................................................... 28
3.1 Patientenkollektiv und Spender ........................................................................ 28 3.1.1 Eigenschaften des Patientenkollektivs .............................................................. 28 3.1.2 Eigenschaften der Kontrollgruppe .................................................................... 29 3.2
Immunantworten auf CT-Antigene im Patientenkollektiv ................................... 30 3
3.2.1 SOX-2 und PRAME spezifische Antikörperantworten ....................................... 30 3.3 Titer der Myelompatienten gegen CT – Antigene.............................................. 35 3.3.1 SOX – 2 und PRAME spezifische Titer im Probenkollektiv ............................... 35 3.3.2 SOX – 2 und PRAME spezifischer Titerverlauf ................................................. 37 3.4
Expression der CT – Antigene .......................................................................... 44
4
Diskussion ...................................................................................................... 45
4.1 SOX – 2 und PRAME spezifische Autoantikörper ............................................. 46 4.1.1 PRAME ............................................................................................................ 46 4.1.2 SOX – 2 ........................................................................................................... 47 Zusammenhang zwischen Kranheitsverlauf, Therapie und CT – Antigen – Titern ................................................................................................................ 48 4.2.1 Autoantikörpertiter gegen PRAME .................................................................... 49 4.2.2 Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 ................................................................... 50 4.2
Die Bedeutung von CT – Antigen - Titern als diagnotische Parameter für den Krankheitsverlauf und potentieller Nutzen in der Immuntherapie ............... 54 4.3.1 Diagnose und Verlaufsparameter ..................................................................... 54 4.3.2 Immuntherapie ................................................................................................. 55 4.3
4.4
Ausblick ............................................................................................................ 58
5
Zusammenfassung ......................................................................................... 60
6
Anhang ............................................................................................................ 62
7
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................. 67
8
Literaturverzeichnis ....................................................................................... 69
9
Danksagung .................................................................................................. 79
10
Curriculum vitae ......................................................................................... 80
11
Eidesstattliche Erklärung............................................................................... 81
4
Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Antikörperantworten in Patienten- und Kontrollgruppe ............................ 30 Abbildung 2: Subtypen und Bildung von SOX - 2 Autoantikörpern .............................. 31 Abbildung 3: Subtypen und Bildung von PRAME Autoantikörpern............................... 62 Abbildung 4: Therapie und SOX - 2 Autoantikörper ..................................................... 33 Abbildung 5: Therapie und PRAME Autoantikörper ..................................................... 33 Abbildung 6: Serokonversion nach Allo– SCT für SOX - 2 und PRAME ...................... 34 Abbildung 7: SOX – 2 Titer und LDH ......................................................................... 36 Abbildung 8: SOX – 2 Titer und Paraproteine ............................................................ 36 Abbildung 9 Keine Therapie, stabiler Krankheitsverlauf (Gruppe 1 )............................ 38 Abbildung 10: Therapie, stabiler Verlauf oder Verbesserung (Gruppe 2) .............. 39 - 42 Abbildung 11: Erkrankung fortschreitend (Gruppe 3) ............................................. 42- 43
Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Stadieneinteilung des Multiplen Myeloms ................................................... 13 Tabelle 2: Klinische und laborchemische Patientencharakteristika .............................. 28 Tabelle 3: Patientencharakteristika und Bildung von Antiköpern gegen CTAntigene ...................................................................................................... 62 Tabelle 4: Probencharakteristika und Bildung von Antiköpern gegen CT-Antigene ..... 63 Tabelle 5: Probenparameter und SOX – 2 Titer........................................................... 64 Tabelle 6: Probenparameter und PRAME Titer ........................................................... 65 Tabelle 7: Probenparameter und Expression von SOX – 2 und Prame ....................... 66
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Einleitung und Fragestellung
Das Multiple Myelom gehört mit weltweit circa 1% zu den selteneren Krebserkrankungen. Unter den malignen hämatologischen Erkrankungen ist das Multiple Myelom für circa 10% der Fälle verantwortlich. Nach alleiniger Chemotherapie beträgt die mittlere Überlebenszeit 3 Jahre nach Diagnosestellung (Harousseau and Moreau 2009). Die Einführung neuer Therapieoptionen innerhalb der letzten 10 Jahre, wie zum Beispiel die Behandlung mit Bortezomib, verbesserte deutlich die Remissionsraten und die Überlebenszeit (Raab et al. 2009). Nach wie vor gilt die Erkrankung jedoch als nicht heilbar. Die im Rahmen allogener Stammzelltransplantationen stattfindenden Immunreaktionen, unter anderem die Graft – versus – Myeloma Reaktion, scheinen zu einer weiteren Verbesserung der Prognose zu führen (Ringdén et al. 2009). Die Nutzung der positiven Effekte einer Autoimmunreaktion, die Suche nach geeigneten Tumorantigenen, die als molekulare Zielstrukturen für eine gezielte Immuntherapie fungieren sollen und gleichzeitige Vermeidung von schweren Nebenwirkungen einer allogenen Stammzelltransplantation ist Ziel der Tumorimmunologie. Die Gruppe der Cancer – Testis – Antigene (unter anderem PRAME und SOX – 2) gelten als vielversprechende Targets der Immuntherapie, da sie bei Gesunden ausschließlich auf Hoden- bzw. Plazentagewebe vorkommen, jedoch von einer Vielzahl von Tumoren exprimiert werden. Darüber hinaus scheint das Auftreten bestimmter CT – Antigene bei Multiplem Myelom als prognostisch negativer Faktor zu werten sein (Atanackovic et al. 2009; Pabst et al. 2010). Bei einigen Cancer-Testis-Antigenen ist jedoch auch eine gezielte Aktivierung einer gegen den Tumor gerichteten Antikörpervermittelten Immunantwort nachgewiesen worden (Atanackovic et al. 2007). Im Rahmen dieser Dissertation soll das Vorkommen von Antikörpern gegen die Tumorantigene PRAME und SOX - 2 bei Patienten mit Multiplem Myelom im Krankheitsverlauf analysiert werden. Als Kontrolle dient das Serum gesunder Blutspender. Gleichzeitig wird die Expression des Tumorantigens, das eine betreffende Immunantwort auslöst, in den malignen Plasmazellen des betreffenden Patienten untersucht werden.
1.1
Überblick Krankheitsbild Multiples Myelom
Das Multiple Myelom ist ein Non – Hodgkin - Lymphom der B - Lymphozyten und charakterisiert durch die Folgen der Akkumulation eines maligne transformierten Plasmazellklons. Dieser breitet sich, meist mit destruktiven Folgen, im Knochenmark des Betroffenen aus. Die transformierten Plasmazellen bilden ein monoklonales Immunglobulin der Klasse G, A, M, D oder E (Goldschmidt et al. 2004).
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Entsprechend der sezernierten Immunglobulinschwerkette wird die Erkrankung in Untergruppen eingeteilt. Mit 52% aller Fälle wird am häufigsten der Ig - Schwerkettentyp IgG gebildet, an zweiter Stelle steht mit 21% die Sekretion des Typs IgA. IgM -, IgE und IgD - produzierende Myelomzellen kommen, wie auch das nichtsekretorische Myelom nur selten vor. Ein „Bence – Jones - Plasmozytom“, welches ausschließlich Ig - Leichtketten des Typs Kappa oder Lambda sezerniert, liegt in 16% aller Fälle vor (Kyle et al. 2003; Kyle and Rajkumar 2008). Im deutschsprachigen Raum werden die Begriffe Plasmozytom und Multiples Myelom zumeist synonym gehandhabt, obwohl es sich bei dem Plasmozytom definitionsgemäß um einen solitären Tumor aus Plasmazellen handelt, während das Multiplen Myelom durch disseminierte Plasmazellkonglomerate im Knochenmark charakterisiert ist (Goldschmidt et al. 2004). Die häufigsten Lokalisationen des extramedullären Plasmozytoms sind neben dem Nasopharynx, die Nasennebenhöhlen und der Larynx (Sucker and Stockschläder 2002). Als ein prämaligner Zustand gilt die monoklonale Gammopathie unbestimmter Signifikanz (MGUS). Bei der MGUS handelt es sich um eine Erhöhung eines monoklonalen Antikörpers (< 3 g/dl), jedoch kommt es zu keinen zusätzlichen Symptomen und die Plasmazellinfiltration im Knochenmark liegt unter < 10% (Kyle and Rajkumar 2008). Weiterhin abzugrenzen von einem manifesten Multiplen Myelom ist das smouldering Myeloma oder indolente Myelom, welches sich durch einen langsamen, sowie weitgehend symptomfreien Verlauf kennzeichnet. Es geht mit einem monoklonalem Proteinanstieg > 3g/dl oder einer Plasmazellinfiltration im Knochenmark von > 10% einher, jedoch ohne eine Schädigung der typischerweise betroffenen Organe (The International Myeloma Working Group 2003).
1.1.1 Epidemiologie des Multiplen Myeloms Unter den malignen Neoplasien des Knochenmarks ist das Multiple Myelom mit einer Inzidenz von 5,72 / 100.000 in Europa das häufigste primär im Knochen lokalisierte Tumorleiden (Goldschmidt 2006). Weltweit beträgt der Anteil des Multiplen Myeloms an allen Krebsdiagnosen etwa 1% (Parkin et al. 2005). Deutschlandweit sind gegenwärtig annäherungsweise 12.000 Menschen betroffen, jährlich erkranken etwa 3.500 Patienten neu. Die Inizdenzrate steigt ab dem 40. Lebensjahr stark an, zwischen dem 60. und 70. Lebensjahr findet sich das Hauptmanifestationsalter, wobei Männer häufiger als Frauen betroffen sind (Goldschmidt et al. 2004; Raab et al. 2009). Die Inzidenzraten asiatischer Länder fallen niedriger aus als die Raten europäischer oder kaukasischer Populationen (Dominik et al. 2007). Menschen afroamerikanischer Abstammung sind etwa doppelt so häufig betroffen wie weiße US-Amerikaner (Ries et al. 2008). Die altersstandardisierte Erkrankungsrate stieg von 1975 bis Anfang 1990 leicht an, danach blieb sie beständig (Ries et al. 2008).
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Dieser Anstieg ist jedoch vermutlich auf die steigende Lebenserwartung der westlichen Bevölkerung zurückzuführen (Sirohi and Powles 2006). Die Fünf-JahresÜberlebensrate für Patienten mit einem Multiplen Myelom beträgt lediglich 15 – 20% (Parkin et al. 2005).
1.1.2 Ätiologie und Pathogenese 1.1.2.1
Ätiologie
Die Ätiologie des Multiplen Myeloms bleibt nach wie vor unklar (Kyle and Rajkumar 2008). Als fundierte Risikofaktoren für die Entstehung der Erkrankung gelten neben dem männlichen Geschlecht und dem Alter die afroamerikanische Abstammung sowie eine positive Familienanamnese für MGUS (Dominik et al. 2007). Eine multifaktorielle Genese der malignen Entartung der Plasmazellen gilt als gesichert, wobei die Ergebnisse vieler Studien zur Ätiologie der Erkrankung inkonsistent sind. Um die mitwirkenden Faktoren zur Entstehung des Multiplen Myeloms ausführlicher beurteilen zu können, wurde von der International Myeloma Foundation (IMF) eine Datenbank angelegt, die Patientendaten ihrer Mitglieder sammelt und auf diese Weise weitere Hinweise liefern soll. Lebensführung In einigen epidemiologischen Studien wurde Übergewicht, definiert durch den BMI, als ein Faktor der Lebensführung mit einem erhöhten relativen Risiko der Erkrankung in Verbindung (Calle et al. 2003; Blair et al. 2005) gebracht. Ein Kausalzusammenhang zwischen Nikotinkonsum und der Entstehung eines Multiplen Myeloms konnte nicht hergestellt werden. Gleichermaßen unwahrscheinlich scheint ein Zusammenhang mit Alkoholkonsum (Dominik et al. 2007). Berufstätigkeit und Umweltaspekte Weiterhin diskutiert werden die Effekte von Pestiziden und Lösungsmitteln, da gehäufte Erkrankungsraten bei Waldarbeitern und Beschäftigten in Chemiewerken, sowie in der Zellstoff- und Papierverarbeitung beschrieben wurden (Dominik et al. 2007). Darüber hinaus wurden positive Zusammenhänge zwischen chronischen Entzündungen sowie viralen Infektionen und der Entstehung des Multiplen Myeloms dargestellt (Durie 2001). Strahlung Ionisierende Strahlung wird als einer der Gründe für die beim Multiplen Myelom häufig beobachteten chromosomalen Veränderungen angeführt. Diese Annahme lässt sich auf Studien zurückführen, die eine Häufung der Erkrankung bei Überlebenden der Atombombenabwürfe von Nagasaki und Hiroshima beobachteten (Ichimaru et al. 1982; Shimizu et al. 1991). Eine statistisch gesicherte Häufung der Erkrankung bestand ebenfalls bei mäßig stark strahlenexponierten Personen, 8
wie Radiologen (Shimizu et al. 1991). Die durch moderne Radiodiagnostik zugefügte Strahlenbelastung scheint jedoch auf die Inzidenz des Multiplen Myeloms keinen Einfluss zu nehmen (Kyle and Rajkumar 2007). Immunsystem und medizinische Vorgeschichte Eine zuvor bestehende monoklonale Gammopathie unklarerer Signifikanz, sowie die Erkrankung an einem smoldering myeloma gilt als gesicherter Risikofaktor für die Entstehung des Vollbilds Multiples Myelom (Rajkumar 2005; Kyle et al. 2007). Weiterhin scheinen bestimmte virale Vorerkrankungen zur Entstehung der Erkrankung beizutragen. Eine australische Kohortenstudie konnte für AIDS-Patienten ein signifikant höheres Risiko an einem Multiplen Myelom zu erkranken nachweisen (Grulich et al. 1999)., in einer schwedischen Kohortenstudie war die Inzidenz auch unter Hepatitis-CPatienten deutlich erhöht (Duberg et al. 2005).
1.1.2.2
Pathogenese
Die molekulare Pathogenese des Multiplen Myeloms ist als ein mehrstufiger Prozess zu bewerten. Dabei tragen sowohl die komplexen genetischen Veränderungen der Myelomzellen als auch die Eigenschaften der Knochenmarkstromazellen und Proteine der extrazellulären Matrix zum Fortschreiten der Erkrankung bei (Raab et al. 2009). Die zytogenetischen Veränderungen sind komplex und bisher konnte keine einzelne, krankheitsverursachende molekulare Läsion nachgewiesen werden. Jedoch ist davon auszugehen, dass insbesondere die 14q-Translokationen ein primäres Ereignis in der Pathogenese der Erkrankung darstellen (Harousseau and Moreau 2009), da sie häufig bereits bei Patienten mit monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (MGUS) und smoldering myeloma (SMM) zu beobachten sind (Sirohi and Powles 2006). Zusätzliche chromosomale Ereignisse, wie zum Beispiel die Deletion von 13q tragen zur Tranformation und Entwicklung eines Multiplen Myeloms bei (Drach 2004). Chromosomale Abberationen Bei circa 50% aller Myelompatienten sind Translokationen des Gens der Immunglobulinschwerketten (IgH) mit dem Genlocus 14q32 beteiligt, wodurch Onkogene der Translokationspartner-Region dysreguliert werden (Fonseca et al. 2004; Rajkumar 2005). Die Überexpression dieser Partner-Loci, wie 11q13, 4p16, 6p21, 16q23 und 20q11 gilt als wesentliche Ursache für die Anbahnung und das Aufrechterhalten der klonalen Proliferation der Myelomzellen (Rajkumar 2005). Ein Zusammenhang dieser Abberationen mit einer Störung der Immunabwehr oder Entzündungen als auslösender Faktor für somatische Hypermutationen oder ImmunglobulinschwerkettenKlassenwechsel wird angenommen (Fonseca et al. 2004; Rajkumar 2005; Stein et al. 2007). Die Translokation t(11;14) verursachte in den betroffenen Zelllinien eine Überexpression von Cyclin D1 (Drach 2004).
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Die übermäßige Expression von Cyclin D1 wurde mit einer besseren Prognose und einem verlängerten Überleben nach autologer Stammzelltransplantation in Zusammenhang gebracht (Soverini et al. 2003; Chiu and Chadburn 2006). Hyperploidien werden ebenso eher mit einer guten Prognose assoziiert (Harousseau and Moreau 2009). Als Folge der häufig vorhandenen Translokation t(4;14) kommt es zur Dysregulation von verschiedenen Genen. Zum Beispiel führt diese chromosomale Veränderung zur Überexpression des fgfr3-Transkripts mit der Folge einer unkontrollierten Zellproliferation sowie Inhibition der Apoptose, welche zur Progression der Erkrankung beitragen könnten (Chesi et al. 2001).Mit einer besonders ungünstigen Prognose ist die Deletion 13q assoziiert. Davon sind auch Patienten nach autologer und allogener Stammzelltransplantation betroffen (Fonseca et al. 2004; Kröger et al. 2004). Die Dysregulation anderer bedeutender Onkogene, wie c-myc, ras oder p53 sind nur selten beschrieben und scheinen mit aggressiveren Verlaufsformen und spätem Krankheitsstadium assoziiert zu sein (Dominik et al. 2007). Epigenetische Veränderungen Eine abnorme Methylierung im Bereich von Tumorsupressorgenen wurde mehrfach beschrieben. Die damit einhergehende Inaktivierung der Genexpression ist bereits beim MGUS festzustellen, so dass diese Modifikation als ein frühes Geschehnis in der Pathogenese der Erkrankung gesehen werden kann. (Galm et al. 2003; Seidl et al. 2004) Eine erhebliche Rolle als Wachstumsfaktor für Myelomzellen spielt die Produktion von Interleukin - 6 durch die Stromazellen des Knochenmarks. Interleukin - 6 aktiviert in den Myelomzellen Signaltransduktionswege, die die Proliferation der Zellen fördern und die Apoptose verhindern (Dankbar et al. 2000; Dominik et al. 2007). Die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen (CD44, CD54 = ICAM-1, VLA-4, insbesondere CD56) durch den Tumornekrosefaktor - α fördert die Interaktion zwischen Tumorzellen und Stroma und stimuliert wiederum die Sekretion von Interleukin-6 durch die Stromazellen (Drach 2004). Die Knochenmarksangiogenese und das Wachstum der Myelomzellen wird zusätzlich durch den vascular endothelial growth factor (VEGF) aktiviert (Raab et al. 2009). Interleukin-6 und VEGF scheinen die beiden Hauptfaktoren zum Schutz der Myelomzellen vor medikamenteninduzierter Apoptose zu sein (Dankbar et al. 2000). Pathologie der Knochenläsionen Eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Osteoklastenaktivität spielt unter anderem das RANKL (NFκB) – Osteoprotegerin (OPG) – System. Knochenmarksstromazellen und Osteoblasten sezernieren RANKL und dieses stimuliert durch Bindung an den OPG - Rezeptor, welcher auf Osteoklasten exprimiert wird, deren Aktivität. Myleomzellen nehmen auf das RANKL – OPG - Gleichgewicht Einfluss, wobei jedoch noch nicht endgültig darüber Einigkeit erlangt wurde, ob Myelomzellen selber in der Lage sind RANKL zu produzieren (Drach 2004).
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1.1.3 Klinik und Diagnostik Die Erkrankung manifestiert sich meist mit uncharakteristischen Symptomen. Häufig leiden die Patienten an Rückenschmerzen und unspezifischer Abgeschlagenheit. Diese klinischen Erscheinungsbilder sind Folge der bereits fortgeschrittenen Invasion der Myleomzellen im Knochenmark. Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung klagen 70% der Patienten über Knochenschmerzen, die infolge der osteolytisch wirksamen Sekretionsprodukte der Myelomzellen entstehen (Gassel 2002; Goldschmidt 2006). Die in 40% der Fälle bestehende Anämie führt zu Müdigkeit und einem Leistungsabfall (Goldschmidt et al. 2004). Neben der Markverdrängung durch die Myelomzellen beeinflussen sezernierte Zytokine und zytotoxische T-Lymphozyten die Erythropoese (Gassel 2002). Aufgrund auffälliger Laborbefunde im Rahmen anderer Indikationen, insbesondere einer erhöhten Blutsenkungsgeschwindigkeit und einer mittelgradigen Anämie, werden 20% der Patienten zufällig diagnostiziert (Goldschmidt 2006). Bei einem Fünftel aller Patienten besteht initial eine Niereninsuffizienz, die von einer reversiblen Erhöhung des Kreatinins bis hin zum irreversiblen Nierenversagen reichen kann. Die Genese der Nierenschädigung ist multifaktoriell, neben der Proteinurie spielt hierbei unter anderem auch die Hyperkalziämie eine Rolle. Im Verlauf der Erkrankung steigt der Anteil der Betroffenen auf 50% an (Gassel 2002). Als ein Kennzeichen der fortgeschrittenen Myelomerkrankung wird zudem ein erhöhter Serumkalziumspiegel angeführt (Goldschmidt 2006). Die Resorption der Knochenmatrix, welche durch die Sekretion des Osteoklasten aktivierenden Faktors durch die Myelomzellen verursacht wird, induziert ebendiese Hyperkalziämie und Hyperkalziurie (Gassel 2002). Als Folge einer Granulozytopenie und eines Antikörpermangelsyndroms leiden die Patienten häufig unter rezidivierenden bakteriellen Infekten. Neurologische Symptome aufgrund eines Hyperviskositätssyndroms, sowie eine periphere sensomotorische Neuropathie, können bei einem Teil der Patienten auftreten (Gassel 2002). Labor Die laborchemische Diagnostik umfasst neben einem Differentialblutbild und der Bestimmung verschiedener laborchemischer und renaler Parameter eine umfassende Proteindiagnostik (Kyle and Rajkumar 2008). Die Produktion eines monoklonalen Immunglobulins durch die malignen Plasmazellen stellt ein leicht zu identifizierendes tumorspezifisches Protein dar. In der Serum - oder Urineiweiß -Elektrophorese sind die von den Myelomzellen gebildeten monoklonalen Antikörper als Paraproteine oder M Gradient im Gammabereich nachweisbar. Mit Hilfe einer Immunfixationselektrophorese oder Immunelektrophosere lässt sich der einheitliche Schwer- und Leichtkettentyp bestimmten. Mittels einer Nephelometrie oder Turbidimetrie kann eine quantitative Bestimmung der Immunglobuline durchgeführt werden (Gassel 2002). Zur annäherungsweisen Einschätzung der Tumormasse kann die Konzentration des ß2 - Mikroglobulins bestimmt werden. Hohe Konzentrationen dieses als Leichtkette des HLA1 - Antigens auf jeder Zelle exprimierten Tumormarkers, gehen mit schlechten Überlebensprognosen einher (Gassel 2002). 11
Knochenmarkdiagnostik Die Gewinnung von Knochenmark durch eine Beckenkammpunktion ist zur Bestimmung der Knochenmarkzytologie und –histologie unerlässlich. Neben Informationen zur Hämatopoese kann die Infiltration des Knochenmarks mit den Myelomzellen bestimmt und anhand molekular - zytogenetischer Untersuchungen durch FISH Chromosomenaberrationen nachgewiesen werden. Die erfassten Werte lassen eine Prognoseabschätzung zu (Goldschmidt 2006). Bildgebende Verfahren Die Knochenbeteiligung kann mittels Computertomographie, PET – CT oder auch MRT erfasst werden, im Rahmen der konventionellen Röntgendiagnostik wird die Knochenbeteiligung anhand des Pariser Schemas beurteilt. Circa 80% der Patienten weisen bei Diagnosestellung röntgenologisch Osteolysen oder eine diffuse Osteoporose auf. Stadieneinteilung und Klassifikation Zur Diagnosesicherung eines Multiplen Myeloms wurden verschiedene Systeme verwandt. Das System nach Durie-Salmon wurde vor über 30 Jahren entwickelt und wird weiterhin vielerorts verwendet. Das Vorhandensein mindestens eines Major - und Minorkriteriums sichert die Diagnose des Multiplen Myeloms. Als Majorkriterien gelten der Nachweis eines Plasmazelltumors, einer Knochenmarkplasmozytose (> 30%) oder einer gewissen Konzentration monoklonaler Antiköper. Die Minorkriterien umfassen zusätzlich das Vorhandensein lytischer Knochenläsionen und die Suppression der polyklonalen Immunglobuline (Durie and Salmon 1975; Goldschmidt et al. 2004). Nach der Definition der Guidelines der International Myeloma Working Group gilt die Diagnose als gesichert, wenn folgende Kriterien erfüllt werden: –
Nachweis eines monoklonalen Proteins im Serum und / oder Urin
–
Nachweis von > 10% teilweise „atypischen“ Plasmazellen
–
Nachweis einer Organschädigung (The International Myeloma Working Group 2003)
In die Stadieneinteilung nach Durie und Salmon gehen Hämoglobin, Serumkalzium, Paraproteinkonzentration und das Ausmaß der Osteolysen mit ein. Zusätzlich wird eine Unterteilung in die Stadien A und B je hinsichtlich der Nierenfunktion vorgenommen. (Goldschmidt 2006; Kyle and Rajkumar 2008). In die Stadieneinteilung der International Myeloma Working Group, dem International Staging System (ISS) als gegenwärtig verwendetes System, gehen alleinig die Parameter β2-Mikroglobulin und Albumin ein (siehe Tab. 1) (Kyle and Rajkumar 2008).
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Tabelle 1: Stadieneinteilung des Multiplen Myeloms
Das ermittelte Krankheitsstadium bildet die Grundlage für therapeutische Optionen und ein Ermessen der Prognose.
1.1.4 Therapie und neue Therapieverfahren Patienten im Stadium I, mit einem MGUS oder einem smouldering myeloma werden zunächst nach dem Schema „wait and observe“ regelmäßig kontrolliert, jedoch keiner Zytostatikatherapie zugeführt. Zur Therapie der osteolysebedingten Schmerzsymptomatik können die Patienten eine lokale Bestrahlung der befallenen Knochenstrukturen erhalten. Im Gegensatz dazu besteht bei Patienten in fortgeschrittenen Stadien eindeutig eine Therapieindikation, um die Progression der Erkrankung aufzuhalten und Komplikationen zu verhindern (Gassel 2002; Goldschmidt 2006). Konventionelle Chemotherapie Das Alexanian-Schema (Melphalan und Prednison) zur zytostatischen Behandlung des Multiplen Myeloms wurde bereits 1969 durch Alexianan et al. eingeführt und galt für Patienten, die einer Hochdosischemotherapie nicht zugeführt werden konnten, als Goldstandard (Gassel 2002; Sirohi and Powles 2006; Engelhardt et al. 2014). Aktuell wird die Behandlung mit Melphalan und Velcade bevorzugt, da durch diese Therapie sowohl die Überlebenswahrscheinlichkeit erhöht, als auch die progressionsfreie Zeit verlängert wurde (Palumbo and Gay 2009; Engelhardt et al. 2014). Als Induktionstherapie vor einer geplanten Hochdosischemotherapie mit nachfolgender autologer Stammzelltransplantation wird eine Dreifachtherapie mit Velcade, Dexamethason und zum Beispiel Doxorubicin bevorzugt (Engelhardt et al. 2014).
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Hochdosistherapie Es konnte gezeigt werden, dass durch eine Konditionierung mit hochdosiertem Melphalan eine höhere Rate an Remissionen als mit konventioneller Chemotherapie erzielt werden kann (McElwain and Powles 1983). Eine nachfolgende autologe Stammzelltransplantation sichert dabei die raschere Wiederherstellung der Hämatopoese und verlängert die durchschnittliche Überlebenszeit um weitere 12 Monate. (Attal et al. 1996; Einsele and Straka 2004). Dementsprechend ist die Hochdosischemotherapie mit Melphalan und nachfolgender autologer Stammzelltransplantation, bei Patienten bis zu einem Alter von 70 Jahren, zurzeit die Therapie der Wahl bei Multiplem Myelom. Diese wird meist als Hochdosistherapie anhand von Melphalan und nachfolgender autologer Stammzelltransplantation praktiziert (Vesole et al. 1994; Kröger 2005). Als Langzeitbehandlung nach Hochdosistherapie werden Bisphosphonate empfohlen (Einsele and Straka 2004), die Empfehlungen zu einer Erhaltungstherapie mit Interferon-α sind aufgrund unterschiedlicher Studienergebnisse nicht einheitlich. Neue Therapieansätze Der Einsatz neuer immunmodulatorischer und antiangiogenetischer Medikamente führte zu entscheidenden Fortschritten in der Behandlung des Multiplen Myeloms. Die Hemmung der Angiogenese durch Thalidomid und seine Derivate (z.B. Revlimid) in Kombination mit der Applikation von Dexamethason verlängert das progressionsfreie Intervall und gilt als Therapiealternative bei therapierefraktären Verläufen (Hideshima et al. 2008). Der Proteaseinhibitor Bortezomib (Velcade®) induziert durch eine Inaktivierung des Transkriptionsfaktors nuclearfactor- κB (NF- κB) eine Hemmung des Zellwachstums und induziert die Apoptose in Myelomzellen (Hideshima et al. 2001). Als Proteasom – Inhibitor der neueren Generation bietet Carfilzomib (Kyprolis©) ein verbessertes Nebenwirkungsprofil. Monoklonale Antikörper gegen CD20 – positive Zellen (Rituximab) oder gegen das auf der Oberfläche der Myelomzellen nachweisbare MUC1-Protein (Breva-Rex©) initiieren zytotoxische Abbauprozesse. Das Medikament Rituximab ist ein Antikörper, der an das Oberflächenmolekül CD 20 der B - Lymphozyten bindet und durch eine Clusterbildung Apoptose auslöst. Auch gegen Interleukin-6, einen entscheidenden Wachstumsfaktor der malignen Zellen, steht ein rekombinanter Antikörper zur Verfügung (de Hon et al. 1994; Gassel 2002). Allogene Stammzelltransplantation In Gegensatz zu allen vorangehend genannten Therapien bietet eine allogene Stammzelltransplantation die Chance einer kompletten Langzeitremission. Die hohe behandlungsassoziierte Morbidität und Mortalität begrenzt allerdings die dafür in Frage kommende Patientenzahl erheblich. Neben der hohen Komplikationsrate durch schwerwiegende Infektionen stellt vor allem die Graft – versus – Host – Erkrankung (GvHD) ein langfristiges Problem nach einer allogenen Stammzelltransplantation dar (Kröger 2007). 14
Dabei handelt es sich um eine von T - und NK - Zellen des Spenders ausgehende destruierende Aktivität gegen Zellen des Empfängers. Da sich ein Teil dieser immunologischen Reaktion als Graft – versus - Leukemia, bzw. Graft – versus - Myeloma – Effekt, auch gegen die malignen Plasmazellen richtet, ist diese Aktivität zumindest teilweise durchaus erwünscht. Zur Reduktion der GvHD-assoziierten Morbidität und Mortalität wird eine T - Zell - Depletion des Transplantats vorgenommen. Verschiedenen Studien zufolge vermindert sich nach dieser Strategie die Inzidenz der GvHD deutlich, jedoch zeigte sich dafür eine Assoziation mit einem erhöhten Rezidivrisiko (Majolino 1998; Maloney and Molina et al. 2003; Pérez-Simón 2005). Die Infusion von Spenderlymphozyten (DLI) kann bei Patienten mit progredientem Myelom nach allogener Stammzelltransplantation eine partielle oder komplette Remission induzieren und die Überlebensprognose günstig beeinflussen (Einsele and Straka 2004; Kröger 2007).
1.1.5 Prognose Trotz der vielfältigen Therapieoptionen bleibt das Multiple Myelom bis dato eine unheilbare Erkrankung. Die Überlebenszeit nach Erstdiagnose schwankt zwischen Monaten und mehreren Jahren. Die mediane Überlebenszeit nach einer Behandlung mit dem Alexanian-Schema beträgt 24 – 30 Monate. Durch den Einsatz der autologen Stammzelltransplantation konnte die Überlebenszeit im Median auf bis zu 68 Monate gesteigert werden (Sirohi et al. 2005). Als prognostisch günstig gilt das Fehlen einer Deletion im Bereich des Chromosoms 13 (Einsele and Straka 2004). Der Nachweis eines Multiplen Myeloms vom Leichtkettentyp scheint im Gegensatz zu anderen Formen ein ungünstiger prognostischer Faktor zu sein (Goldschmidt et al. 2004). Wie auch bei anderen Tumorerkrankungen beschrieben, korreliert eine erhöhte LDH - Konzentration im Serum mit einer schlechteren Prognose. Der CRP-Wert spiegelt direkt die IL - 6 Produktion im Knochenmark wieder, erhöhte Werte gehen mit einer ungünstigen Prognose einher. Ein erhöhter Kreatininwert gilt ebenfalls als Hinweise auf eine schlechte Prognose (Goldschmidt et al. 2004). Zufolge dem aus einer Auswertung der International Myeloma Working Group entstandenen International Prognostic Index gelten erhöhte β2 – Mikroglobulin, sowie erniedrigte Albuminwerte als Prognosefaktoren mit dem höchsten prädiktivem Wert und bilden die Grundlage des International Staging System (Greipp et al. 2005).
1.2
Tumorimmunologie und Immuntherapie
Bereits 1957 wurde von Burnet die Möglichkeit des Immunsystems zur Elimination von Tumorzellen angenommen (Burnet 1957). Die potentiellen Möglichkeiten des Immunsystems zur Tumorkontrolle - und Elimination sind der Gegenstand des Interesses tumorimmunologischer Forschungsgruppen. Die Zusammenhänge zwischen der Funktion des Immunsystems und einem sich entwickelnden Tumor sind komplex.
15
Sowohl das Microenvironment des Tumors, als auch des umgebenden Gewebes scheinen zur Modifizierung und Prägung der Effektorzellen des Immunsystems beizutragen. Tumorzellen können auf unterschiedlichen Wegen der Immunabwehr entgehen. So kann eine Tumorzelle unter Umständen die zur Costimulation benötigten Moleküle vermindert oder auch keine MHC-I-Moleküle exprimieren und so der Immunabwehr entgehen. Häufig werden vom Tumorgewebe zusätzlich immunmodulatorische Faktoren, wie zum Beispiel TGF - β und IL - 10, sezerniert, die direkt T-Lymphozyten hemmen können und somit eine Abwehrreaktion des Körpers verhindern. Die Tumorimmunologie bedient sich verschiedener Ansätze, um die Antitumor - Aktivität des Immunsystems möglichst effektiv nutzen und modulieren zu können. Ziel der Therapien ist, eine Aktivierung des Immunsystems gegen die malignen Zellen zu erreichen. So werden zum Beipsiel immunmodulatorischen Effekte verschiedener Zytokine, so des IFN - α oder des Interleukin - 2 werden in der Therapie von Leukämien, Melanomen und Nierenkarzinomen genutzt (Liao et al. 2013). Der Einfluss des Immunsystems, insbesondere der T – Zell Immunität, auf den Verlauf von malignen hämatologischen Erkrankungen wurde mehrfach beschrieben (Ansell et al. 2001; Xu et al. 2001; Koebel et al. 2007; Ringdén et al. 2009). Mehrfach konnte ein Vorkommen von Effektorzellen des Immunsystems, wie T-Lymphozyten, NK-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen in Tumorinfiltraten nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle in der Vermittlung der Tumorimmunität gegen tumorassoziierte Antigene spielen (Finn 2012). Die Bildung von Autoantikörpern gegen CT – Antigene bei Myelompatienten konnte nachgewiesen werden (Kobold et al. 2011). Im Sinne einer Immuntherapie wird auch die allogene Stammzelltransplantation angewandt. Hierbei scheint insbesondere der Graft – versus – Myeloma oder Graft – versus – Leukemia Effekt eine zentrale Rolle zu spielen. Allogene Stammzelltransplantationen und Donor Lymphotzyten Infusionen (DLI) führten weitaus häufiger zur Induktion einer Remission als autologe Stammzelltransplanationen (Martinelli et al. 2000; Kolb 2008). Eine der vielversprechendsten Strategien zur Nutzung der antitumor - Aktivität des Immunsystems scheint die Entwicklung von geeigneten Impfstoffen im Sinne einer Vakzinierungsstrategie zu sein und ist Gegenstand aktueller Forschung. Tumorassoziierte Antigene, die von T - Zellen erkannt werden, bieten sich als spezifische Targets in Form von Proteinen oder Peptidsequenzen an. Bisher konnte eine klinische Wirksamkeit der Verfahren allerdings noch nicht endgültig nachgewiesen werden. In vitro lassen sich antigenspezifische cytotoxische T - Lymphozyten herstellen. Diese Zellen können die antigen tragenden Tumorzellen erkennen und abtöten. Die Reaktion entspricht einer Graft – versus - Host, beziehungsweise Graft – versus - Leukemia Reaktion nach einer allogenen Knochenmarkstransplantation, bei der die Lymphozyten des Spenders auf Körper- und Tumorzellen des Patienten reagieren.
16
Die Applikation von Konjugaten dendritischer Zellen und Tumorlysaten induziert in vitro und in vivo CTL - basierte antitumor - Immunantworten (Mayordomo et al. 1995; Nestle et al. 1998). Da aufgrund der geringen Immunogenität der Tumorzellen die Ergebnisse der bisherig angewandten Verfahren in vivo jedoch nicht den gewünschten Erfolg erzielten, werden nunmehr verschiedene andere Methoden der Vakzinierung erprobt. Zum einen werden die Tumorzellen mit costimulatorisch wirksamen Molekülen oder Tumorantigenen transfiziert, anhand dieser Methode soll es zur Ausbildung einer Tumorantigen - spezifischen T - Zellpopulation kommen. Zum anderen werden ex vivo behandelte dendritische Zellen, die als Antigenitätsverstärker im Rahmen ihrer Aufgabe der Präsentation gegenüber T-Zellen wirken sollen, eingesetzt. Dendritische Zellen als eine der potentesten Antigen - präsentierenden Zellpopulationen stimulieren sowohl CD4+ T - Helfer-Zellen (THC), als auch CD8+Cytotoxische T - Lymphozyten (CTL) (Banchereau et al. 2000). Auch diese Strategie zielt somit auf eine Induktion stärkerer CTL - basierter Immunantworten ab. Weiterhin wird versucht, durch die Applikation immunmodulatorischer Zytokine eine Optimierung der Immunantwort zu erreichen. So trägt insbesondere das Interleukin – 4 zur Stimulation der Differenzierung und Maturation dendritischer Zellen und folglich der CTL - abhängigen antitumor - Aktivität in entscheidendem Maße bei (Cayeux et al. 1997; Lutz et al. 2000). Es wird angenommen, dass bei Multiplem Myelom nach erfolgter Therapie eine kleine Residualpopulation maligner Zellen mit besonderen Eigenschaften zur Resistenz gegenüber konventioneller Therapeutika verbleibt und als Myelomstammzellenpopulation für die Rezidiverkrankungen verantwortlich sein könnte (Matsui et al. 2008). Diese Zellreihe und deren spezifisch Eigenschaften könnten ein wichtiges Target der Immuntherapie zur Vermeidung von Rezidiverkrankungen sein.
1.2.1 Tumorassoziierte Antigene Die Identifikation spezifischer Antigene als Voraussetzung der Entwicklung einer Vakzinierungsstrategie zur Induzierung einer aktiven Immunantwort gegen maligne Zellen scheint aktuell ein verheißungsvoller Ansatzpunkt zu sein. Unter tumorassoziierten Antigenen versteht man Antigene, die ausschließlich oder überwiegend im Tumorgewebe exprimiert werden. Diese Antigene werden den T - Zellen als Peptide von Tumorzellproteinen über die MHC - Moleküle präsentiert und eignen sich somit prinzipiell für die Induktion einer Immunantwort (Zippelius et al. 2006). Zur besseren Übersichtlichkeit wurden die tumorassoziierten Antigene aufgrund ihres Expressionsmusters in verschiedene Gruppen unterteilt, von denen hier die wichtigsten vorgestellt werden sollen. Antigene Epitope mutierter Gene Punktmutationen oder Translokationen als Folge der genetischen Instabilität der Tumorzellen führen häufig zur Bildung immunogener Antigene, wie zum Beispiel des CDK4 oder ß - Catenin bei malignem Melanom. 17
Die Produkte sind tumorspezifisch, eignen sich jedoch aufgrund ihres individuellen Vorkommens nicht zur globalen Anwendung in der Vakzinierung (Zippelius et al. 2006). Überexprimierte Antigene Einige, von nicht mutierten Genen abstammende Antigene, werden in Tumorzellen übermäßig exprimiert. Obwohl diese tumorassoziierten Antigene nicht als spezifisch bezeichnet werden können, bieten sie sich zur Therapie der malignen Erkrankung an. Als Beispiel gilt das HER-2/neu – Protoonkogen, welches in epithelialen Tumoren exprimiert und bereits erfolgreich als Target bei bestimmten Subtypen des Mamma Carcinoms genutzt wird (Arteaga et al. 2011). Onkofetale Antigene Onkofetale Antigene, wie zum Beispiel das α – 1 - Fetoprotein oder das karzinoembryonale Antigen (CEA) werden von fetalem und malignem Gewebe stark exprimiert, beim adulten, gesunden Gewebe jedoch nur noch in einem geringen Ausmaß. Dadurch eignen sie sich als Verlaufsindikator bei verschiedenen Tumorerkrankungen. Onkovirale Antigene Die Assoziation des humanen Papillomavirus HPV - 16 und dessen onkogener Produkten E6 und E7 mit der Entwicklung des Zervixkarzinoms ist mehrfach beschrieben worden und wird seit 2007 als Target einer Vakzinierung im Rahmen der Empfehlung der STIKO genutzt (Markowitz et al. 2012). Cancer – Testis - Antigene Diese Untergruppe der Tumorantigene wird in unterschiedlichen Häufigkeiten von Tumoren verschiedenen Ursprungs, jedoch nicht in den meisten normalen, adulten Geweben, exprimiert. Als erstes Tumorantigen überhaupt wurde 1991 MAGE - 1 (Melanoma associated Antigen 1) identifiziert (van der Bruggen et al. 1991). Eine Expression von Antigenen der MAGE - Familie konnte inzwischen bei vielen malignen Erkrankungen, unter anderem bei malignem Melanom, Multiplem Myelom und verschiedenen Karzinomen der Lunge, des Gastrointestinal - Trakts, der Prostata und der Mamma bewiesen werden (Van den Eynde and van der Bruggen 1997). Die meisten Subtypen dieser Untergruppe werden in gesundem Hodengewebe exprimiert und dementsprechend auch als Cancer – Testis - Antigene bezeichnet. Da die Zellen des Hodengewebes weder MHC I noch MHCII – Moleküle exprimieren, werden die Cancer – Testis - Antigene normalerweise dem Immunsystem nicht präsentiert und gelten somit als tumorspezifisch. Die Expression von CT – Antigenen bei Multiplem Myelom nimmt mit fortschreitender Erkrankung zu (van Baren et al. 1999) und es wurde bei zunehmender Expression über einen Zusammenhang mit einer schlechten Prognose berichtet (van Rhee et al. 2005). Aufgrund ihrer immunogenen Eigenschaften und ihrer nahezu auf das Tumorgewebe beschränkten Expression wird diesen Tumorantigenen eine zentrale Rolle als Target in der Immuntherapie maligner Erkrankungen zuge18
schrieben. In dieser Arbeit wird die Bildung von Autoantikörpern gegen die CT – Antigene SOX - 2 und PRAME bei Myelompatienten untersucht werden. SRY - related HMG box (SOX) ist eine Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die eine Rolle in embryonaler Entwicklung und in der Stammzellfunktion spielen. SOX - 2 wird dementsprechend in embryonalen Stammzellen exprimiert (Vasso 2005). Gleichzeitig wurde SOX - 2 als Onkogen in epithelialen Tumoren identifiziert (Bass et al. 2009). Das Auftreten von SOX - 2 spezifischen Autoantikörpern bei MGUS Patienten ist assoziiert mit einem verminderten Risiko der Progression zu Multiplem Myelom und es wird auch bei Patienten mit Multiplem Myelom exprimiert (Dhodapkar et al. 2007). Die Bedeutung des Auftretens von Immunantworten gegen SOX - 2 für die Prognose maligner Erkrankungen ist unklar. Es wurden sowohl Hinweise auf einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf, als auch Hinweise auf einen negativen Einfluss auf die Prognose gefunden, in einigen Studien wurde kein Einfluss festgestellt (Dhodapkar et al. 2007; Titulaer et al. 2009; Lengerke et al. 2011). Das CT-Antigen PRAME (Preferentially Expressed Antigen of Melanoma) wurde zuerst in der Melanom - Zelllinie entdeckt (Ikeda et al. 1997). Weiterhin findet sich häufig eine Expression in Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms, Sarkoms, Nierenzellkarzinoms und bei malignen hämatologischen Erkrankungen, unter anderem dem Multiplem Myelom (Matsushita et al. 2003). Die Funktion des Antigens ist noch unklar. Matsushita et al. postulierten 2001 den Nutzen von PRAME zur Detektion von einer Minimal Residual Disease bei Leukämiepatienten (Matsushita et al. 2001). Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium bei Multiplem Myelom wird PRAME in 23% der Fälle exprimiert (Andrade 2008). Die Beeinflussung des Immunsystems durch eine allogene Stammzelltransplantation und das Durchbrechen der Toleranz gegenüber tumorassoziierten Antigenen im Sinne einer Graft – versus - Myeloma Reaktion nach allogener Stammzelltransplantation wird vermutet (Bellucci et al. 2005). Die allogene Stammzelltransplantation bietet somit eine potentiell kurative Option in der Therapie des Multiplen Myeloms. Dabei könnte die Bildung von Autoantikörpern gegen tumorassoziierte Antigene eine entscheidende Rolle spielen. Der Einfluss einer allogenen Stammzelltransplantation auf die Entwicklung spezifischer Autoantikörper gegen die CT - Antigene SOX - 2 und PRAME soll im Folgenden analysiert werden.
19
2
Material und Methode
2.1
Material
2.1.1 Patientenmaterial Für die vorliegende Arbeit wurden 1023 Serumproben von insgesamt 150 Patienten mit Multiplem Myelom anhand von ELISA auf das Vorliegen von SOX – 2 und PRAME spezifischer Autoantikörper untersucht. Anschließend wurde die Expression von SOX – 2 und PRAME in den Plasmazellen der als positiv beurteilten Patienten bestimmt, dazu wurden 42 Knochenmarksproben von 19 Patienten herangezogen. Alle Proben wurden während eines Zeitraums von Dezember 2004 bis März 2008 im Rahmen von Behandlungen, diagnostischen Prozessen oder Spendevorgängen am Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf gewonnen. Die untersuchten Sera und Knochenmarksproben wurden ausnahmslos Patienten mit einem Multiplem Myelom entnommen. Von 131 Patienten waren mindestens 2 Sera (Median 4, Range 2 – 46 Proben pro Patient) vorhanden. Der Beobachtungszeitraum betrug im Mittel 14,3 Monate bei einer maximalen Zeitspanne von 38 Monaten.
2.1.2 Proben gesunder Spender Zur Bestimmung des Cut – off - Wertes für die jeweiligen CT - Antigene wurde das Serum 100 gesunder Blutspender verwendet. Die Proben wurden gesunden Kontrollpersonen im Rahmen einer Blutspende entnommen. Die Kriterien zur Eignung als Blutspender entsprechen den Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie) gemäß §§ 12a und 18 des Transfusionsgesetzes. Es lässt sich somit davon ausgehen, dass alle Spender der 100 Kontrollsera den gesetzlich vorgegebenen Kriterien genügten und als gesund bezeichnet werden können. Da alle Spenderdaten anonymisiert wurden, kann keine nähere Aussage zu gruppenspezifischen Kenngrößen getroffen werden.
2.1.3 Proteine Die Proteine SOX - 2 und PRAME wurden, ebenso wie das Kontrollprotein Glutathione S - Transferase (GST), in einem Weizenkeim – System exprimiert und über Abnova, Taiwan, bezogen. Die Studie wurde durch die Ethikkommission Hamburg gebilligt (OB – 038/06) und die schriftlichen Einverständniserklärungen der Spender zur Entnahme und wissenschaftlichen Nutzung der Proben liegen vor.
20
2.1.4 Studiendesign Die Untersuchung wurde als Fall – Kontroll – Studie angelegt. Im Rahmen von Routineuntersuchungen und Eingriffen, oder im Falle der gesunden Spender im Rahmen von Blut - und Knochenmarkspenden, wurden Sera und Knochenmarkproben gewonnen. Anhand der Sera gesunder Spender wurden Cut – off Werte der OD für SOX - 2 und PRAME bestimmt und die Patientensera auf das Vorhandensein SOX - 2 und PRAME – spezifischer Antikörper gescreent. Positive Proben wurden titriert und anhand einer Regressionsanalyse wurden SOX - 2 und PRAME spezifische Antikörpertiter ermittelt. Die klinischen Daten zum Krankheitsverlauf wurden anhand der Patientenakten recherchiert und mögliche Korrelationen zwischen Krankheitsverlauf, Auftreten und Titerverlauf von SOX - 2 und PRAME - spezifischen Antikörpern untersucht.
2.1.5 ELISA – Materialien Material
Hersteller
3M NaOH
Merck KG, Darmstadt
Goat Anti-Human IgG – AP
Southern Biotech, Birmingham, USA
Glutathion S - Transferase Protein (GST)
Abnova, Taipei City, Taiwan
Phosphate Buffered Saline 1x (PBS)
Invitrogen, Karlsruhe
PRAME Protein
Abnova, Taipei City, Taiwan
Recombinant Influenza A protein (NP)
Imgenex Corp., San Diego, USA
SOX - 2 Protein
Abnova, Taipei City, Taiwan
Tetanus Toxoid (TT)
Dr. Niklas Schier Produktion Vakzine Marburg Novartis Behring, Marburg
PBS - T Puffer PBS 1x + 0,2 % TWEEN® 20
Sigma-Aldrich, Steinheim
Blockpuffer PBS 1x + 5 % Magermilchpulver
Spinnrad, Norderstedt
Substratpuffer + PNPP 400 ml Aqua dest. 24,5 mg MgCl2 – 6H2O
Sigma-Aldrich, Steinheim 21
48 ml Diethanolamin
Sigma-Aldrich, Steinheim
mit HCl 5 mol/L auf pH 9.8 titrieren
Merck KG, Darmstadt
mit Aqua dest. auf 500 ml auffüllen P-Nitrophenyl-Phosphate (PNPP) 5mg
Southern Biotech, Birmingham, USA
2.1.6 Zellseparation Material
Hersteller
2-β-Mercaptoethanol
Carl Roth GmbH, Karlsruhe
FicollPaque
Biochrom AG, Berlin
Megafuge 1.0R
Heraeus, Hanau
MikrosokopTelaval 31
Zeiss, Jena
PBS-Puffer
Gibcoll, Paisley, Großbritannien
RLT-Puffer
Qiagen, Hilden
Trypan blue solution 0,4%
Sigma-Aldrich, St.Louis, USA
2.1.7 RNA – Isolation und cDNA Gewinnung Material
Hersteller
10x Puffer
Promega, Mannheim
70% Ethanol
J.T. Baker, Deventer, Niederlande
AMV- reverse transkriptase
Promega, Mannheim
DEPC
Sigma-Aldrich, St.Louis, USA
dNTP (dATP,dGTP,dUTP,dCTP)
Invitrogen, Karlsruhe
Master cycler gradient
Eppendorf, Hamburg
MgCl2
Promega, Mannheim
Microcentrifuge Tubes
Eppendorf, Hamburg
QIAshredder
Qiagen, Hilden
Random-Primer
Invitrogen, Karlsruhe
RNAse und DNAse freies Wasser
Sigma-Aldrich, Steinheim
RNeasy Mini Kit
Qiagen, Hilden
RNAsin
Promega, Mannheim
22
2.1.8 Real – Time PCR Materialien Material
Hersteller
Lightcycler II
Roche, Mannheim
Lightcylcer Kapillaren
Roche, Mannheim
Mastermix 2 µl 10x Puffer
Perkin-Elmer Waltham, MA, USA
3,2 µl 25 mM MgCl2
Perkin-Elmer Waltham, MA, USA
2 µl DMF 10%
Merck KGaA, Darmstadt
2 µl BSA 2,5mg/ml
Sigma-Aldrich, Steinheim
1µl Cyber green 1:1000
Sigma-Aldrich, Steinheim
1,6 µl dNTP(dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
Invitrogen, Karlsruhe
0,2 µl Taq DNA Polymerase
Roche, Mannheim
4 µl Primer Mix
Qiagen, Hilden
4 µl cDNA
s.o.
Primermix 4 µl Vorwärtsprimer
Qiagen, Hilden
4 µl Rückwärtsprimer
Qiagen, Hilden
92 µl Aqua dest. Primersequenzen SOX - 2 Vorwärtsprimer
5`- GCA CAT GAA CGG CTG GAG CAA CG – 3`
SOX - 2 Rückwärtsprimer
5´- TGC TGC GAG TAG GAC ATG CTG TAG – 3`
PRAME Vorwärtsprimer
5`- TCT TCC TAC ATT TCC CCG GA – 3`
PRAME Rückwärtsprimer
5`- GCA CTG CAG ACT GAG GAA CTG A – 3’
GAPDH Vorwärtsprimer
5’- TGA TGA CAT CAA GAA GGT GG -3’
GAPDH Rückwärtsprimer
5’- TTT CTT ACT CCT TGG AGG CC - 3’
PCR Zyklen SOX - 2
95° C 15 sec. 40 Zyklen, 60°C 5 sec.; 72°C 26 sec. Schmelzkurve 55 – 95°C 23
PRAME
94° C 15 sec. 40 Zyklen, 58°C 30 sec.; 72°C 30 sec. Schmelzkurve 55 – 95°C
GAPDH
95° C 15 sec. 40 Zyklen, 60°C 5 sec.; 72°C 26 sec. Schmelzkurve 55 – 95°C
2.1.9 sonstiges Labormaterial und Geräte Material
Hersteller
Pipetten 1-10 μl, 10-100 μl, 100-1000 μl
Eppendorf, Hamburg
VWR® Lab Dancer Mini Vortexer
VWR International GmbH, Darmstadt
VXR basic IKA-Vibrax® Schüttler
IKA® Werke GmbH & Co. KG, Staufen
2.2
Methoden
2.2.1 ELISA Der ELISA weist mittels einer enzymatischen Farbreaktion eine Antigen - Antikörper Wechselwirkung nach. Im Zuge des Screenings der Patientenproben, sowie der Proben der Kontrollgruppe wurde stets der anitbody capture assay angewendet. Hierbei wird das betreffende Antigen an eine Mikrotiterplatte gebunden, die zu untersuchende Probe aufgetragen und anhand der stattfindenden Farbreaktion auf das Vorhandensein anitgenspezifischer Antikörper im Serum der Patienten geschlossen. Zunächst wurde eine Mikrotiterplatte mit dem in PBS verdünnten Antigen (Endkonzentration: 1μg/ml) beschichtet. Folgende Antigene wurden verwendet:
Testprotein SOX - 2 oder PRAME
GST (Glutathion – S – Transferase)
NP (Nucleoprotein des Influenza A - Virus)
TT (Tetanus Toxoid)
Die Platte wurde mit einer Folie und Parafilm abgedeckt und über Nacht bei 4° C inkubiert. Am folgenden Tag konnte die Platte mit PBS - T und PBS - Lösung gewaschen werden und für 2 Stunden mit Blockpuffer bei Raumtemperatur geblockt werden. Währenddessen erfolgte die Herstellung der Blutserum - Lösungen (3 μl Serum + 297 μl Blockpuffer), sowie der Positivkontrolllösung (je 1μl Serum der Spender 9 – 13 + 495μl Blockpuffer). Die Platte wurde erneut mit PBS - T und PBS - Lösung gespült. In insgesamt 4 wells, welche jeweils vorher mit GST und dem Antigen beschichtet worden 24
sind, wurde die Blutserum - Lösung eines bestimmten Patienten, bzw. der Positivkontrolllösung pipettiert. Die Platte wurde wiederum abgedeckt und über Nacht bei 4° C inkubiert. Am anschließenden Tag konnte die Platte abermals mit PBS - T und mit PBS - Lösung gewaschen werden. Im Folgenden wurde der sekundäre Antikörper (goat anti-human IgG - AP conjugated) in einer Konzentration von 1:3000 mit Blockpuffer verdünnt, pipettiert und die Platte wiederum 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Währenddessen wurde das PNPP in Substratpuffer lichtgeschützt auf dem Schüttler gelöst. Im Anschluss daran wurde die IgG - Lösung durch erneutes waschen mit PBS - T und PBS - Lösung entfernt. Danach wurde jeweils 100 μl/well der Substratlösung pipettiert und 30 min im Dunkeln inkubiert, wobei die positiven Proben eine gelbe Farbreaktion entwickelten. Hiernach wurde die Farbreaktion durch Zugabe von 3M NaOH unterbrochen und die Platte im ELISA-Reader bei 405 nm ausgewertet. Das Ergebnis der Extinktionsmessung wurde hiernach als OD – Wert ausgegeben und ausgewertet.
2.2.2 Titerbestimmung Zur Titerbestimmung wurde das Serum der als positiv bewerteten Patienten in einer festgelegten Verdünnungsreihe mit PBS – Lösung verdünnt. Weitere Abläufe entsprachen der bereits dargestellten Vorgehensweise. Verdünnungsreihe Antiserum 1:100
2 μl Antiserum
+ 198 μl
1:400
50 μl Antiserum 1:100
+ 150 μl
1:1600
50 μl Antiserum 1:400
+ 150 μl
1:6400
50 μl Antiserum 1:1600
+ 150 μl
1:25000
50 μl Antiserum 1:6400
+ 150 μl
1:100000
50 μl Antiserum 1:25000 + 150 μl
2.2.3 Bewertung der ELISA Ergebnisse Zur Bewertung wurde anhand der Ergebnisse des Materials aus 100 Proben der gesunden Spender der Mittelwert der OD bestimmt, zusätzlich die 3fache Standardabweichung addiert und somit ein Cut – off Wert bestimmt. Die Probe eines Patienten wurde als positiv gewertet, sobald der Cut- off Wert überschritten war und zusätzlich die OD des CT – Antigens mindestens 50% über den Hintergrundwerten der zugehörigen GST Probe war. Zur Bestimmung der Titer wurden Serumverdünnungen der positiven Proben nach dem oben angegebenen Prinzip angefertigt. Gleichzeitig wurden die entsprechenden Verdünnungen mit GST zur Messung des Hintergrundsignals vorgenommen. Eine schrittweise Titration der Sera ergibt einen sigmoidalen Abfall der gemessenen OD-Werte. 25
Ein Bereich der Kurve beinhaltet drei bis fünf nahezu linear verlaufende Punkte. Durch diese Punkte lässt sich per Regressionsanalyse eine optimale Gerade berechnen. Anhand der gemessenen Ergebnisse erfolgte also eine Regressionsanalyse des linearen Segments der Extinktionskurve sowohl für die Patientenproben, als auch für einen Pool aus fünf gesunden Spendern. Als Titer wurde diejenige Verdünnungsreihe bestimmt, bei der es zu einer Kreuzung beider Regressionslinien kam.
2.2.4 Zellseparation In der Zellseparation wird eine Auftrennung der Zellen des Knochenmarks anhand ihrer Dichte vorgenommen. Die Knochenmarkprobe wurde dazu im Verhältnis 1:1 mit FicollPaque verdünnt. Am Boden des Röhrchens sammeln sich Zellen mit hohem spezifischen Gewicht, mononukleäre Zellen bleiben in der Interphase bestehen. Nach Zentrifugation konnten die Zellen der Interphase abpipettiert und mit PBS gewaschen werden. Mit Hilfe des Erythrozyten – Lysis – Puffer wurden die letzten Erythrozyten des Zellaggregats entfernt, die verbleibende Lösung erneut mit PBS gewaschen und im Folgenden mit Trypanbluesolution angefärbt. Abschließend wurde zur Lyse der mononukleären Zellen RLT-Puffer zugegeben und die Lösung bei -80°C konserviert.
2.2.5 RNA – Isolation und cDNA Gewinnung Die Zellen wurden mittels des QIAshredder und durch zufügen von 70%igem Ethanol zerstört. Das RNeasy Mini Kit wurde zur RNA – Isolation genutzt. Die Lösung wurde auf eine Silicamembran aufgetragen und zur Entfernung von verbleibenden Partikeln mehrfach gewaschen. Anhand RNAse-freien Wassers wurde die RNA gelöst und nach Zentrifugation abpipettiert. Die isolierte RNA wurde im Folgenden zum Erhalten einer besseren Stabilität gegenüber Abbauprozessen in doppelsträngige DNA umgewandelt. 2 µg der RNA wurden in 10fach Puffer, MgCl2, Random-Primer, dNTP, RNAsin und AMV - reverse transkriptase gelöst. Die Reaktion fand für 45 Minuten bei 42 °C im Eppendorf Masercyclergradient statt, nachfolgend wurden die Enzyme bei 95 °C für 5 Minuten inaktiviert.
2.2.6 Real-Time PCR Mit Hilfe des Lightcycler wurde nun die Real – Time PCR durchgeführt. Hierzu wurde SYBR green genutzt, das fluoreszierende Produkt bindet an doppelsträngige DNA. Ein Mastermix aus Primermix, MgCl2, dNTP, DMF 10%, BSA 2,5mg/ml, SYBR green 1:1000 und TaqPolymerase wurde angefertigt. Initial wurde eine Denaturierung der DNA bei 95° für 10 Minuten vorgenommen, danach wurden 40 PCR Zyklen durchgeführt. Nach jeder Elongationsphase wurde die Fluoreszenz gemessen. Zur Quantifizierung wurde die Anzahl der Copies nach Beendigung des Prozesses mit der Anzahl der Copies GAPDH RNA verglichen. Im Anschluss wurde eine Schmelzpunktanalyse zur Spezifizierung des DNA – Produktes durchgeführt. Hierzu wird die Reaktionstemperatur schrittweise erhöht, dabei nimmt die Fluoreszenz langsam ab. 26
Die resultierende Schmelzpunktanalyse ergibt für jedes DNA – Produkt ein charakteristisches Ergebnis, auf eine zusätzliche Analyse mittels Gelelektrophorese konnte somit verzichtet werden.
2.3
Statistische Auswertung
Die statistischen Berechnungen wurden mittels SPSS 11.5 durchgeführt. Anhand des Pearson´sΧ2 Test wurden Korrelationen zwischen laborchemischen Parametern und dem generellen Auftreten von SOX - 2 und PRAME spezifischen Autoantikörpern, sowie der Expression von SOX - 2 und PRAME untersucht. Korrelationen zwischen den laborchemischen und klinischen Parametern und den Titern der Autoantikörper gegen SOX - 2 und PRAME wurden, ebenso wie der Zusammenhang zwischen Autoantikörpertitern und vorherig verabreichter Therapie, mittels der Kovarianzanalyse untersucht. Ein Ergebnis wird als signifikant angesehen bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 0.05 und hochsignifikant bei p < 0.001.
27
3
Ergebnisse
3.1
Patientenkollektiv und Spender
Es werden die Ergebnisse der Analyse bezüglich der Charakteristika der Proben von Myelompatienten und der Kontrollgruppe dargestellt.
3.1.1 Eigenschaften des Patientenkollektivs Im untersuchten Kollektiv von 150 Patienten war bei der Mehrzahl der Betroffenen ein IgG - Myelom vorhanden. Dabei war die Produktion einer Kappa - Leichtkette am häufigsten vertreten. Das Alter der Patienten betrug im Mittel 56 Jahre, mit 60% lagen insgesamt mehr Proben von männlichen Patienten vor. Überwiegend befanden sich die Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung (Salmon/Durie Stadium III) und hatten größtenteils bei Einschluss in die Studie bereits eine Therapie erhalten. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme hatten 21% der Patienten eine Chemotherapie erhalten. Eine Auto - SCT wurde bereits bei 22% der Patienten durchgeführt und mit 38% hatten die meisten Patienten im Vorfeld eine Allo - SCT erhalten. Eine DLI wurde insgesamt bei 13 Patienten (9%) des Kollektivs verabreicht. Nach Durie und Salmon, sowie des ISS, werden zur Klassifikation des Erkrankungsstadiums unter anderem neben der Produktion der Immunglobuline der Hämoglobinwert, der Calcium - und Kreatininwert, die Konzentration des ß2 - Mikroglobulins und des Albumins im Serum bestimmt. Diese wesentlichen laborchemischen Parameter wurden ebenfalls im Patientenkollektiv untersucht (siehe Tab. 2).
Tabelle 2: Klinische und laborchemische Patientencharakteristika
Charakteristika
Patienten (n=150)
Charakteristika
Alter
56 (28–80 Jahre)
Hb g/dl (n=1023)
12 (6,3 – 19,2)
Albumin g/l (n=1023)
43 (12,2 – 99)
LDH U/l (n=1023)
175 (77 – 960)
Geschlecht Weiblich Männlich
Beobachtungszeit
60 (40%)
2+
Patienten
Ca mmol/l (n=1023)
2,32 (1,43 – 3,75)
Kreatinin mg/dl (n=1023)
1(0,4 – 7,1)
IgG g/l (n=1023)
9,95 (0,5 – 115,45)
90 (60%)
10 (1–38 Monate)
28
Isotypen (n=150) IgG Lambda
35 (23%)
IgG Kappa
73 (48%)
IgA Lamdba
20(13%)
IgA Kappa
18 (12%)
IgD
1 (0,7%)
Asekretorisch
4 (3%)
IgA g/l (n=1023)
0,94 (0,19 – 94,85)
IgM g/l (n=1023)
0,43 (0,14 – 9,88)
IgKappa g/l (n=1023)
2,29 (0,26 – 30,87)
IgLambda g/l (n=1023)
1,22 (0,29 – 38,45)
ß2-Mikroglobulin (mg/l)
2,5 (0,87 – 14,99)
(n=165) Stadium Salmon/Durie I (A/B)
25 (25/0)
II (A/B)
43 (39/4)
III (A/B)
82 (64/18)
PZ im KM (%) (n=273)
4,5 (0 – 100%)
Immunfixation positiv
219 (72%)
(n=303) Karyotyp komplex
30 (13%)
(n=227) Vorbehandlung bei
Del 13q14 positiv
Einschluss
79 (35%)
(n=223)
Keine
29 (19%)
Chemotherapie
31 (21%)
Auto
33 (22%)
Allo
57 (38%)
GvHD (n=111)
52 (47%)
DLI (n=150)
13 (9%)
17p13 positiv (n=227)
9 (4%)
T(4.14) (n=223)
23 (10%)
Werte sind als Mediane angegeben (Bandbreite)
3.1.2 Eigenschaften der Kontrollgruppe Als Kontrollgruppe dienten die Sera von 100 gesunden Spendern. Hier konnten in 2% der Proben (2/100) Antikörperreaktionen auf SOX - 2 nachgewiesen werden. In den Proben der Myelompatienten konnte der Nachweis von Autoantikörpern gegen SOX - 2 in 6,5% der Sera deutlich häufiger erfolgen als in der Kontrollgruppe (p < 0,05). Spezifische Autoantikörper gegen PRAME wurden in den Serumproben der Kontrollgruppe nicht nachgewiesen.
29
3.2
Immunantworten auf CT-Antigene im Patientenkollektiv
Die Immunantworten auf die CT- Antigene PRAME und SOX-2 der vorliegenden Patientengruppe werden bezüglich klinischer und laborchemischer Parameter dargestellt. Allgemeine Faktoren, wie Alter und Geschlecht, krankheitsspezifische Parameter wie Erkrankungsstadium, Plasmazellinfiltration des Knochenmarks, Schwer – und Leichtkettentyp der Immunglobuline, ebenso wie laborchemische Werte werden in Bezug auf das Vorhandensein einer Immunantwort in Form spezifischer Antikörper gegen die CT Antigene PRAME und SOX -2 untersucht (siehe Tab. 3 und 4).
3.2.1 SOX-2 und PRAME spezifische Antikörperantworten Insgesamt wurden 1023 Sera von Patienten mit Multiplem Myelom (N = 150) untersucht. Gleichzeitig wurden 100 Sera gesunder Probanden auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper gegen SOX - 2 und PRAME untersucht. Hierbei zeigte sich, dass 10% (N = 15) der Patienten des Patientenkollektivs während des Beobachtungszeitraumes SOX - 2 Autoantikörper bildeten. Insgesamt waren 6,5% der untersuchten Proben positiv für SOX - 2. Im gesunden Kollektiv fand sich lediglich eine Antikörperantwort bei 2% der untersuchten Proben für SOX - 2. In weitaus geringerem Ausmaß konnten im Patientenkollektiv auch positive Reaktionen auf PRAME nachgewiesen werden. So bildeten nur 4 Patienten (2,7%) Autoantikörper gegen PRAME. Insgesamt reagierten 0,6 % der untersuchten Myelom - Sera positiv, im Kollektiv der gesunden Spender jedoch keins (siehe Abb. 1).
Abbildung 1: Antikörperantworten in Patienten- und Kontrollgruppe
Um einen möglichen Zusammenhang zwischen Krankheitsfaktoren bei Multiplem Myelom und der Bildung SOX-2 und PRAME spezifischer Autoantikörper darzustellen, wurden laborchemische und klinische Parameter auf ihren Einfluss auf die Bildung ebendieser Immunantwort untersucht. Für Geschlecht, Alter und Stadium der Erkran30
kung konnten keine signifikanten Korrelationen nachgewiesen werden. Auch für die Plasmazellinfiltration im Knochenmark der Patienten konnte kein Zusammenhang bewiesen werden. Alle untersuchten laborchemischen Parameter korrelierten ebenfalls nicht mit der Bildung von Autoantikörpern gegen SOX - 2 oder PRAME (siehe Tab. 3 und 4). Unterteilt nach den hauptsächlich gebildeten Schwerketten des Paraproteins, wies die Mehrzahl der Patienten ein IgG–Myelom auf, von diesen bildeten 14 Patienten SOX-2 spezifische Antikörper. Ein Patient mit sekretorischem Multiplem Myelom bildete ebenfalls SOX – 2 Autoantikörper. Insgesamt 25% der Patienten litten an einem IgA Myelom. Hiervon bildeten keine Patienten Autoantikörper gegen SOX - 2. Der Zusammenhang zwischen Schwerkette des Paraproteins und der Bildung von SOX – 2 Autoantikörpern war nicht signifikant. Für die Produktion PRAME - spezifischer Autoantikörper konnte ein Zusammenhang ebenfalls nicht gefunden werden. Die Isotypen der produzierten Leichtketten übten ebenfalls keinen Einfluss auf die Produktion der untersuchten Autoantikörper aus (Abb. 2 und 3, Tabelle 3 und 4).
Abbildung 2: Subtypen und Bildung von SOX - 2 Autoantikörpern
31
Abbildung 3: Subtypen und Bildung von PRAME Autoantikörpern
Die Therapieschemata zur Behandlung des Multiplen Myeloms zielen in erster Linie zur Reduktion der Tumormasse auf eine Modulation des Immunsystems ab. Dieses gilt insbesondere für die verschiedenen Schemata der Stammzelltransplantation. Die Mehrzahl der Patienten (38%) hatte zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits eine Allo SCT erhalten. In dieser Patientenkohorte zeigte sich eine deutlich vermehrte Bereitschaft zur Bildung der untersuchten Autoantikörper (SOX – 2: p = 0,02) (PRAME: p = 0,04). Interessanterweise wurden 86% der SOX - 2 positiven Sera nachdem der Patient eine Allo - SCT erhalten hatte, entnommen. Im Gegensatz dazu stammten nur 10% (8/78) und 0,8% (1/130) der SOX - 2 positiven Proben von Patienten, die bisher nur eine Chemotherapie oder eine autologe Stammzelltransplantation erhielten. Dementsprechend hatten 80% der SOX - 2 positiven Patienten (12/15) eine allogene Stammzelltransplantation erhalten. Nur drei der insgesamt 15 positiven Patienten hatten lediglich eine Chemotherapie (2/15) oder eine Auto - SCT (1/15) erhalten (Tabelle 3 und 4). Dieser Effekt lässt sich nicht für die Gesamtheit der auf PRAME - Autoantikörper positiv getesteten Proben nachweisen (p = 0,2). Hier wurden 50% (3/6) der Proben entnommen, nachdem der entsprechende Patient bereits eine Allo - SCT erhalten hatte. Ebenfalls 50% (3/6) der Proben wurden nach Auto - SCT entnommen. Jedoch zeigte sich bei der Untersuchung der patientenspezifischen Auswertung wiederum ein anderes Bild, es hatten 75 % (3/4) der Patienten, welche Antikörperreaktionen auf PRAME zeigten, eine Allo - SCT erhalten. Keine der positiv getesteten Proben stammte von Patienten, welche zu diesem Zeitpunkt lediglich eine Chemotherapie erhalten hatten oder gänzlich unbehandelt waren (Abb.4 und 5).
32
Abbildung 4: Therapie und SOX - 2 Autoantikörper
Abbildung 5: Therapie und PRAME Autoantikörper
Somit übte eine Vortherapie in Form der allogenen Stammzelltransplantation als einziger patientenbezogener Parameter einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Bildung SOX - 2 und PRAME spezifischer Autoantikörper aus (p = 0,02 bzw. p = 0,04). Die Analyse der einzelnen Proben bezüglich der Vortherapie zeigte ebenfalls einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen einer Allo - SCT vor Probenentnahme und der Bildung SOX - 2 spezifischer Autoantikörper (p = 0,007). Für die positiv getesteten Proben für PRAME Autoantikörper konnte dieses nicht bestätigt werden (p = 0,2; N = 6). Bei Patienten, welche während des Beobachtungszeitraumes lediglich 33
eine Chemotherapie oder Auto - SCT erhielten, konnte kein Effekt nachgewiesen werden. In den Proben des bis dahin unbehandelten Patientenkollektivs wurden gar keine Autoantikörper nachgewiesen (0/56). Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Applikation einer Allo - SCT und der Bildung SOX - 2 und PRAME spezifischer Antikörper zu untersuchen wurden zusätzlich Sera der positiven Patienten vor Allo - SCT rekrutiert und untersucht. Insgesamt waren 11 prä – Allo - SCT Sera von SOX - 2 Antikörper bildenden Patienten vorhanden. Hiervon waren 10 Sera vor Allo - SCT negativ für SOX - 2 Autoantikörper. Innerhalb eines Zeitraumes von 1 bis 50 Monaten (Median 32 Monate) nach der allogenen Stammzelltransplantation fand eine Serokonversion bei 91 % der Patienten statt (Abb. 6). Ein Patient bildete bereits vor der Therapie SOX - 2 spezifische Autoantikörper und 3 Patienten erhielten während des Beobachtungszeitraumes keine Therapie in Form einer Allo - SCT. Zwei der positiven Patienten für PRAME bildeten vor allo - SCT keine PRAME spezifischen Antikörper. Nach Allo - SCT fand bei beiden Patienten nach 2 – 28 Monaten (Median 15 Monate) eine Serokonversion statt und es wurden Autoantikörper gegen PRAME gebildet. Ein Patient erhielt während des Beobachtungszeitraumes keine Allo - SCT und ein Patient war bereits vor Allo - SCT positiv auf PRAME Autoantikörper getestet worden (Abb. 6). Ein Einfluss der Therapie in Form einer allogenen Stammzelltransplantation auf die immunologische Erkennung von CT - Antigenen in Form von PRAME und SOX - 2 scheint in Zusammenschau der erhobenen Ergebnisse wahrscheinlich.
Abbildung 6: Serokonversion nach Allo– SCT für SOX - 2 und PRAME
Weiterhin wurde der Remissionsstatus der Patienten mit Bildung von Autoantikörpern gegen SOX - 2 oder PRAME untersucht. Zum Zeitpunkt der Probenentnahme waren 7% der Patienten in Remission positiv für SOX – 2 und 0,9 % positiv für PRAME Autoantikörper. In der Gruppe der Patienten mit „active disease“ bildeten 5% Antikörper gegen SOX – 2 und 0% gegen PRAME. 34
Damit ergibt sich kein statistischer Zusammenhang zwischen aktuellem Remissionstatus der Erkrankung und der Bildung von Autoantikörpern gegen SOX - 2 oder PRAME (p = 0,29; p = 0,09).
3.3
Titer der Myelompatienten gegen CT – Antigene
Für die Proben der Patienten, die einmalig oder mehrfach nach den angegebenen Kriterien für die Bildung CT – Antigen spezifischer Antikörper als positiv bewertet wurden, wurden nun Titer bestimmt. Im Folgenden wird der Zusammenhang der Höhe der bestimmten Titer mit klinischen und laborchemischen Parametern zum jeweiligen Probenzeitpunkt dargestellt. Weiterhin wurden die jeweiligen individuellen Titerverläufe der Patienten untersucht und Wechselbeziehungen zu ausgewählten laborchemischen Parametern gezeigt.
3.3.1 SOX – 2 und PRAME spezifische Titer im Probenkollektiv Insgesamt wurden 19 Myelompatienten für die Bildung SOX – 2 und PRAME spezischer Autoantikörper als positiv eingeordnet. Alle erhältlichen Proben der als positiv eingestuften Patienten, insgesamt 252, wurden titriert. Dabei waren klinische und laborchemische Daten zu insgesamt 70 % der Proben vorhanden und konnten untersucht werden. Es konnten Titer von minimal 0 bis maximal 11.719 bestimmt werden. In der Gruppe der PRAME - Autoantikörper bildenden Patienten konnte kein Einfluss zwischen den Titerwerten und laborchemischen und klinischen Parametern festgestellt werden. Auch die vor Probenentnahme stattgefundene Therapie hat keinen Einfluss auf die Höhe der Titer in der Patientengruppe (Tab. 6). Es zeigten sich allerdings bei den SOX – 2 - Autoantikörper bildenden Patienten hinsichtlich der Titer im Gruppenvergleich signifikante Unterschiede bezüglich der gemessenen LDH – Werte. Es konnten signifikante Unterschiede in der Höhe der gemessenen Titer nachgewiesen werden (p = 0,01). Es besteht für diese Variable eine geringe negative Korrelation (r = - 0,196) (Abb. 7). Ebenso scheint die Menge der Paraproteine im Serum einen Einfluss auf die Höhe des gemessenen Titers zu haben (p = 0,03). Die vermehrte Bildung von Paraproteinen scheint mit der Bildung höherer Titer einher zu gehen (r = 0,172) (Abb. 8). Für sämtliche verbliebenen laborchemischen und klinischen Parameter wurde kein signifikanter Unterscheid festgestellt (Tab.5).
35
Abbildung 7: SOX – 2 Titer und LDH
Abbildung 8: SOX – 2 Titer und Paraproteine 36
3.3.2 SOX – 2 und PRAME spezifischer Titerverlauf Um mögliche Zusammenhänge zwischen Krankheitsverlauf, Therapien und den ermittelten CT - Antigen spezifischen Titern darzustellen, wurde eine Beurteilung der individuellen Titerverläufe vorgenommen. Als Einschlusskriterium galt das Vorhandensein von mindestens drei Proben im Zeitraum eines Jahres. Longitudinale Beobachtungen konnten somit bei 13 SOX – 2 positiven und 4 PRAME positiven Patienten beurteilt werden. Die Patienten wurden nach ihrem individuellen Krankheitsverlauf während des Beobachtungszeitraumes in drei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe zeigte während der Beobachtung einen stabilen Krankheitsverlauf. Sie befanden sich ausnahmslos in Remission nach Allo – SCT. Alle Patienten bildeten SOX – 2 spezifische Antikörper. In dieser Patientengruppe fanden sich normwertige laborchemische Parameter, lediglich bei einem Patienten ließen sich konstant leichtgradig erhöhte Paraproteine nachweisen. Die SOX – 2 spezifischen Titer befanden sich insgesamt im mittleren Bereich. Bei zwei der Patienten zeigte sich gegen Ende der Beobachtungsphase ein diskreter Anstieg der Titer, ohne dass es zu einer Änderung der klinischen und laborchemischen Parameter kam.
37
Abbildung 9: Keine Therapie, stabiler Krankheitsverlauf (Gruppe 1)
Die Patienten der zweiten Gruppe (N = 9; SOX – 2 = 5, PRAME = 4) erhielten während des Beobachtungszeitraumes eine Therapie in Form von Chemotherapie, Auto – SCT, Allo – SCT oder DLI. Im weiteren Verlauf war der Krankheitsverlauf dieser Patienten insgesamt stabil oder es kam zu einer Verbesserung.
38
Nach Chemotherapie kam es parallel zu rückläufigen Paraproteinen zu einem diskreten Abfall des Titers für SOX – 2. Nach Auto – SCT wurde im Gegensatz dazu trotz rückläufiger Paraproteinwerte in zwei Fällen ein Anstieg des Titers für SOX – 2 und PRAME beobachtet. In einem Fall kam es allerdings nach Auto – SCT auch zu einer deutlichen Reduktion des Titers für PRAME. Nach Allo – SCT war parallel zu abnehmenden Paraproteinwerten ebenfalls eine deutliche Reduktion der Titer für SOX – 2 und PRAME zu sehen. Zu einem späten Anstieg des Titers für PRAME nach Allo – SCT kam es in einem Fall. Gleichzeitig waren steigende Paraprotein – Level nachweisbar, so dass zunehmende Titer unter Umständen als Vorzeichen eines Progress der Erkrankung gewertet werden könnten. Im letzten Fall waren zu Beginn der Beobachtung nach Allo – SCT bereits steigende Paraproteinlevel nachweisbar. Es wurde eine DLI verabreicht, danach kam es zu einem kurzfristigen Absinken der Paraproteine. Im weiteren Verlauf nahmen diese jedoch wieder zu, gleichzeitig stieg allmählich der Titer für SOX – 2 an.
39
40
41
Abbildung 10: Therapie, stabiler Verlauf oder Verbesserung (Gruppe 2)
Insgesamt wurden 5 Patienten der dritten Gruppe zugeordnet, alle bildeten Autoantikörper gegen SOX – 2. Im Verlauf kam es bei diesen Patienten zu einem Fortschreiten der Erkrankung mit ansteigenden Paraproteinen. Gemeinsam mit dem Anstieg der laborchemischen Parameter kam es zu steigenden Titern, in zwei Fällen noch bevor die Paraproteine zunahmen. Bei längerer Beobachtungszeit waren die Titer nach initialem Anstieg langsam rückläufig. Ein Patient erhielt während des Zeitraumes Bortezomib. Im Rahmen des vorherigen Progresses der Krankheit waren mittelwertige Titer messbar, nach Beginn der Medikation sanken die Titer stetig ab und waren im Verlauf negativ. Nach Beendigung der Therapie mit Bortezomib kam es erneut zu einem sprunghaften Anstieg der Titer gegen SOX – 2.
42
Abbildung 11: Erkrankung fortschreitend (Gruppe 3)
43
3.4
Expression der CT – Antigene
Die Expression der CT – Antigene in den vorhandenen Plasmazellproben der Myelompatienten wurde nun untersucht. Für PRAME waren 6 Proben von 3 Patienten vorhanden, in 33% (2/6) wurde PRAME detektiert, die Expression war jedoch nur schwach. Es waren 36 Proben von 12 Patienten für SOX – 2 vorhanden, ein Nachweis von SOX – 2 konnte in 100% der Fälle (36/36) erfolgen. Die Expressionsstärke wurde mittels einer Ratio Copies / GAPDH bestimmt. Die Expressionsstärke von PRAME zeigte keinen Zusammenhang zur Höhe der Titer oder anderen laborchemischen Parametern. Eine Auswertung war aufgrund der geringen Anzahl der verfügbaren Proben nicht vollständig möglich. Die Expressionsstärke des CT – Antigens SOX – 2 und laborchemische Parameter zeigten ebenfalls keine signifikanten Zusammenhänge (p > 0,05). Auch hierbei war eine vollständige Auswertung in Teilbereichen aufgrund der geringen Probenanzahl nicht durchzuführen.
44
4
Diskussion
Das Multiple Myelom zählt zu den häufigen malignen Neoplasien des Knochenmarks, trotz der vielfältigen Entwicklung neuer Therapien bleibt die Prognose der Erkrankung nach wie vor ungünstig. Die autologe Stammzelltransplantation konnte, ebenso wie die Einführung wirksamer Medikamente, wie Bortezomib und Revlimid, einen Anstieg der Überlebenszeit bewirken. Gleichwohl kommt es überwiegend innerhalb von kurzer Zeit zum Rezidiv und die Überlebenszeit nach Diagnose der Erkrankung ist nach wie vor deutlich begrenzt (Raab et al. 2009). Es wird angenommen, dass durch die allogene Stammzelltransplantation eine Heilung der Erkrankung im Rahmen einer Graft – versus – Myeloma Reaktion erzielt werden kann, dabei müssen gegenwärtig jedoch noch schwere Nebenwirkungen im Sinne der Graft – versus – Host Disease in Kauf genommen werden (Cook et al. 2008; Ringdén et al. 2009) Die Identifizierung geeigneter molekularer Zielstrukturen und Nutzung dieser für die positiven Effekte der Immunreaktion im Rahmen einer Immuntherapie des Multiplen Myeloms würden eine wirksamere und gleichzeitig nebenwirkungsärmere Therapie ermöglichen. Cancer – Testis – Antigene kommen als Targets der Immuntherapie in Frage, da sie unter anderem in Myelomzellen exprimiert werden (Atanackovic et al. 2007; Atanackovic et al. 2009). Für diese Gruppe der Antigene ist darüber hinaus bereits eine gezielte Immunantwort mittels Antikörpern gegen Tumoren nachgewiesen worden (Atanackovic et al. 2007). Eine Aktivierung der humoralen Immunantwort durch B – Zellen konnte durch den Nachweis hoher Immunglobulin- Titer gegen CT – Antigene bei malignen Erkrankungen außerdem in weiteren Studien bewiesen werden (Guinn et al. 2005; van Rhee et al. 2005). SOX - 2 wird in embryonalen Stammzellen exprimiert und wurde als Onkogen in epithelialen Tumoren identizifiert (Bass et al. 2009). Das Auftreten von SOX - 2 – spezischen Autoantikörpern bei MGUS Patienten wurde mit einem verminderten Risiko der Progression zu Multiplem Myelom verbunden (Dhodapkar et al. 2007). Insgesamt ist die Bedeutung des Auftretens von Immunantworten gegen SOX - 2 für die Prognose maligner Erkrankungen jedoch unklar, sowohl positive als auch negative Auswirkungen wurden in der Vergangenheit postuliert (Dhodapkar et al. 2007; Titulaer et al. 2009; Lengerke et al. 2011). Eine Expression des CT – Antigens PRAME konnte bei verschiedenen malignen Erkrankungen, unter anderem dem malignem Melanom nachgewiesen werden und scheint als Indikator einer minimal residual disease dienen zu können (Matsushita et al. 2003). Darüber hinaus scheint die Expression von PRAME im Rahmen einer malignen Erkrankung mit einer schlechteren Prognose einher zu gehen (Oberthuer et al. 2004).
45
4.1
SOX – 2 und PRAME spezifische Autoantikörper
Es wurden insgesamt 1023 Serumproben eines Patientenkollektivs von 150 Myelompatienten auf eine Immunantwort gegen die CT – Antigene SOX – 2 und PRAME untersucht. Gleichzeitig wurden 100 Sera gesunder Probanden auf ebendiese Reaktion getestet.
4.1.1 PRAME Die Expression von PRAME wurde in zahlreichen Tumorgeweben nachgewiesen, nahezu alle Melanomzellen, jedoch auch das kleinzellige Lungenkarzinom und Sarkome exprimieren PRAME. Für Leukämiepatienten wird eine Expression in 33 % der Fälle angenommen (Ikeda et al. 1997). In gesundem Hodengewebe wird ebenfalls eine hohe Expressionsrate beschrieben, darüber hinaus konnte PRAME in gesundem Endometrium, Hirn - und Nebennierengewebe nachgewiesen werden (Güre et al. 2000). In geringem Umfang wurde sogar eine Expression von PRAME in Blutzellen gesunder Spender detektiert (Matsushita et al. 2003). Es handelt sich somit nicht um ein ausschließlich tumorspezifisches Antigen. Veröffentlichungen zu Untersuchungen von Autoantikörpern gegen PRAME bei Tumorpatienten oder gesunden Probanden liegen aktuell nicht vor. Der Nachweis von Autoantikörpern gegen PRAME konnte bei gesunden Probanden in dieser Untersuchung nicht erbracht werden. Die Immunogenität von PRAME scheint, bei niedriger Expression in gesundem Gewebe, nicht relevant zu sein. Pellat-Deceunynck beschrieb 2000 einen durchaus häufigen Nachweis von PRAME Expression in mehr als 50% der Myelomzellen. Im Kollektiv der hier untersuchten Myelompatienten bildeten lediglich 2,7 % (4/150) Autoantikörper gegen PRAME. Der Nachweis einer Immunreaktion im Sinne der Bildung von PRAME – Autoantikörpern deckt sich unter Umständen mit der bisherigen Beschreibung der Expression von PRAME bei Mutliplem Myelom. Trotz des häufigen Nachweises bei Myleompatienten wird über eine insgesamt schwache Expression berichtet (PellatDeceunynck et al. 2000). Somit scheint bei Myelompatienten PRAME nur eine geringe Immunogenität, eventuell abhängig von der Höhe der Expression, aufzuweisen. Gleichzeitig war hier eine Expression trotz positiven Autoantikörpernachweises in einigen Fällen nicht nachweisbar. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre die Eradikation vormals PRAME – positiver Zellen durch die humorale Immunantwort in Form der PRAME positiven Autoantikörper. In vorherigen Untersuchungen zur Expression von PRAME wurden signifikante Einflüsse von Tumorstadium und Patientenalter auf die Expression von PRAME diskutiert, wobei der Nachweis von PRAME häufig im fortgeschrittenen Tumorstadium und bei höherem Patientenalter auftraten und mit einer negativen Prognose behaftet war (Oberthuer et al. 2004). Im Gegensatz dazu wurde die Expression von PRAME im Rahmen einer anderen Studie mit einem besseren klinischen Outcome und besserer Prognose von AML – Patienten in Zusammenhang gebracht (Greiner et al. 2008).
46
In der vorliegenden Untersuchung konnte kein signifikanter Zusammenhang zwischen laborchemischen oder klinischen Parametern der Myelompatienten und dem Nachweis von PRAME – Autoantikörpern gefunden werden. Da gleichzeitig nur in wenigen Fällen überhaupt der Nachweis von PRAME Autoantikörpern erfolgen konnte, ist in diesem Fall bei Multiplem Myelom momentan eher nicht von einem potentiellen diagnostisch oder therapeutisch relevantem Target auszugehen.
4.1.2 SOX – 2 Das Auftreten von Autoantikörpern gegen SOX – 2 wurde bereits im Rahmen des kleinzelligen Lungenkarzinoms untersucht, hierbei wurde kein Einfluss auf die Prognose der Patienten und kein Einfluss klinischer Parameter auf die Bildung von Autoantikörpern festgestellt (Titulaer et al. 2009; Maddison et al. 2010) In der vorliegenden Untersuchung fanden sich bei 10% (15/150) der Myelompatienten Autoantikörper gegen SOX – 2. Darüber hinaus bildeten im Kollektiv der gesunden Probanden 2 % (2/100) SOX – 2 Autoantikörper. Myelompatienten bildeten somit signifikant mehr Autoantikörper gegen SOX – 2 als gesunde Probanden (p < 0,05). Eine vermutete Assoziation von klinischen und laborchemischen Parametern mit dem Auftreten SOX – 2 spezifischer Autoantikörper konnte nicht bestätigt werden. Auch patientenbezogene Faktoren, wie Alter, Geschlecht und Krankheitsstadium übten keinen Einfluss aus. Im Zusammenhang dieser Arbeit fanden wir jedoch einen signifikanten Zusammenhang (p = 0,02) zwischen der vorherigen Applikation einer allogenen Stammzelltransplantation und dem Auftreten von SOX – 2 Autoantikörpern. Insgesamt hatten 80% (12/15) der für SOX – 2 Autoantikörper positiv gescreenten Patienten eine allogene Stammzelltransplantation erhalten. Dagegen waren lediglich 3 der positiv gescreenten Patienten in Form einer Chemotherapie oder autologen Stammzelltransplantation vorbehandelt. Keiner der SOX – 2 Autoantikörper bildenden Patienten litt nach allogener Stammzelltransplantation an einer GvHD, die Bildung von SOX – 2 Autoantikörpern im Rahmen einer unspezifischen Graft – versus – Host Reaktion ist somit unwahrscheinlich (Kobold et al. 2011). Einen günstigen Einfluss des Auftretens von SOX – 2 Autoantikörpern auf das Fortschreiten einer MGUS Erkrankung postulierten Spisek et al 2007. In der Studie wurden in 23% aller Fälle von MGUS Patienten positiv auf das Vorkommen von SOX – 2 Autoantikörpern getestet. Im Gegensatz zu den hier vorliegenden Ergebnissen konnte allerdings in keinem der untersuchten Fälle von Myleompatienten ein Nachweis von SOX – 2 Autoantikörpern erfolgen (Dhodapkar et al. 2007), wobei das Patientenkollektiv jedoch mit N = 49 deutlich kleiner war und sich betreffend der Vorbehandlung deutlich von dem hier untersuchten unterschied. Keiner der untersuchten Myelompatienten hatte eine allogene Stammzelltransplantation erhalten. Die Expression von SOX – 2 konnte in dieser Untersuchung bei allen positiv gescreenten Patienten nachgewiesen werden, eine Zusammenhang zwischen der Expression von SOX – 2 und laborchemi-
47
schen oder klinischen Parametern, insbesondere der Plasmazellanzahl im Knochenmark als Indikator der Tumormasse, wurde allerdings nicht festgestellt. Die in dieser Untersuchung verwendeten Proben wurden im Rahmen einer weiterführenden Studie auf Antikörper gegen Influenza und Tetanus untersucht. Hierbei zeigte sich, dass zwischen den Sera der Myelompatienten und den Proben gesunder Spender kein Unterscheid hinsichtlich der Bildung von Antikörpern bestand (Kobold S., Tams S. et al. 2011). Eine Beeinflussung der Testergebnisse bezüglich des Auftretens von SOX – 2 und PRAME Autoantikörpern durch einen Immunglobulinmangel oder eine Hyporeaktivität der B-Zellen im Rahmen der Grunderkrankung scheint somit ausgeschlossen zu sein (Kobold et al. 2011). Bis vor kurzer Zeit wurde davon ausgegangen, dass SOX – 2 lediglich von bestimmtem Gewebe, in erster Linie von Tumorzellen, exprimiert, beziehungsweise übermäßig exprimiert wird. Im Rahmen der hier vorgestellten Untersuchung konnten jedoch darüber hinaus ein Vorhandensein von Autoantikörpern gegen SOX – 2 im Serum gesunder Probanden nachgewiesen werden. Drüber hinaus wurden ebenso Antikörperantworten gegen SOX – 2 im Serum von Patienten mit Multiplem Myelom detektiert. Dies steht in Einklang mit den 2011 veröffentlichten Ergebnissen im Rahmen einer weiterführenden Studie, hier konnte eine SOX – 2 Expression in verschiedensten Geweben, unter anderem neben Myelomzellen auch in gesundem Gewebe, nachgewiesen werden (Kobold et al. 2011). Somit scheint, ebenso wie bei PRAME, die Expression von SOX – 2 nicht ausschließlich in Tumorgewebe stattzufinden. Von der gleichen Vermutung gingen auch Meklat, Li et al. 2007 aus. Trotz der vorherigen Annahme, dass CT – Antigene ausschließlich in Hoden- und Tumorgewebe exprimiert werden, konnten schwache Expressionen vieler dieser Antigene auch in anderen gesunden Geweben nachgewiesen werden, wenn auch auf einem bedeutend niedrigerem Level (Meklat et al. 2007). Insgesamt scheint also die Expression verschiedener CT – Antigene nicht tumorspezifisch zu sein, jedoch bildeten Myelompatienten, höchstwahrscheinlich aufgrund der deutlich stärkeren Expression von CT – Antigenen, signifikant häufiger Autoantikörper gegen SOX – 2 als gesunde Probanden.
4.2
Zusammenhang zwischen Kranheitsverlauf, Therapie und CT – Antigen – Titern
Insgesamt gibt es bisher nur wenige Studien, die Titer von Autoantikörpern gegen Tumorantigene untersuchten und sich zur Immunogenität der CT – Antigene, sowie zum Zusammenhang zwischen Krankheitsverlauf, Therapie und Autoantikörpertitern äußerten. Dhodapkar et. al berichteten 2007 über die Bestimmung von hohen Autoantikörper – Titern gegen SOX – 2 bei Patienten mit MGUS und untersuchten über 2 Jahre den Verlauf der Titer. Hierbei zeigte sich, dass sowohl der klinische Verlauf, also auch die Höhe der Autoantikörpertiter bei den untersuchten Patienten stabil verlief 48
(Dhodapkar et al. 2007). In anderen Zusammenhängen wurde im Gegensatz dazu über Autoantikörpertiter in einem niedrigeren Bereich berichtet und von einer unspezifischen B-Zell-Stimulation nach Tumorlyse ausgegangen, wobei eine wirkungsvolle Immunantwort gegen Tumorgewebe eher nicht angenommen wurde (Jäger et al. 1999; Atanackovic et al. 2007). Eingehender wurde die Expressionshäufigkeit von CT – Antigenen, besonders in Zusammenhang mit Krankheitsverlauf und verabreichter Therapie, untersucht (Dhodapkar et al. 2003; Oberthuer et al. 2004; Jungbluth et al. 2005; Pabst et al. 2010). Je fortgeschrittener der Krankheitsverlauf war, desto mehr CT – Antigene wurden von Myelompatienten exprimiert (Atanackovic et al. 2009), im Gegensatz dazu waren CT – Antigene bei neu diagnostizierten Patienten seltener nachweisbar. Der Krankheitsfortschritt scheint somit auf die Expression der CT – Antigene Einfluss zu nehmen. Gleichzeitig führt die Vorbehandlung in Form einer allogenen Stammzelltransplantation zur vermehrten Bildung von Autoantikörpern gegen NY-ESO 1 und SOX – 2 (Atanackovic et al. 2007). Wie bereits vorangehend geschildert, nahm auch in der hier untersuchten Patientengruppe die Vortherapie anhand einer allogenen Stammzelltransplantation im untersuchten Kollektiv als einziger Parameter Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit einer Bildung von Auoantikörpern gegen SOX – 2 und PRAME. Im untersuchten Patientenkollektiv bildeten insgesamt 19 Patienten Autoantikörper gegen SOX – 2 oder PRAME. Aus allen vorhandenen Sera dieser Patienten (N = 252) wurden Titer gegen die oben genannten CT – Antigene bestimmt, um den individuellen Titerverlauf darzustellen und gegebenenfalls Zusammenhänge zwischen klinischen oder laborchemischen Parametern und der Bildung von Autoantikörpern gegen SOX – 2 und PRAME zu identifizieren. Die Titerhöhen zeigten hohe inter- und intraindividuelle Unterschiede. Es waren sowohl negative Sera mit einem Titer von 0 vorhanden, als auch Titer in sehr hohen Bereichen bis 11.719 bestimmt.
4.2.1 Autoantikörpertiter gegen PRAME In bisherigen Studien wurde für verschiedene CT – Antigene der Einfluss des Krankheitsverlaufs auf die Expressionsstärke und - häufigkeit geschildert und bereits über Zusammenhänge zwischen der Form der Therapie und der Bildung von Autoantikörpern gegen CT – Antigene berichtet (s.o.). Sämtliche laborchemische und klinische Parameter nahmen in der vorliegenden Untersuchung keinen Einfluss auf die Höhe der Autoantikörpertiter gegen PRAME. Der zuvor vermutete Zusammenhang zwischen dem Krankheitsstadium, dem Plasmazellanteil im Knochenmark oder den verabreichten Therapien in Form von Chemotherapie, autologer oder allogener Stammzelltransplantation konnte nicht bestätigt werden. Die Expression von PRAME in Myelomzellen war in vorausgehenden Studien in mehr als 50% nachweisbar, scheint jedoch insgesamt recht schwach zu sein (PellatDeceunynck et al. 2000). Dieses bestätigte sich in der hier vorliegenden Untersuchung. Es war nur in einem geringen Anteil überhaupt eine, auch nur sehr schwache, Expres49
sion von PRAME nachweisbar. Nur ein geringer Anteil der Patienten (N = 4) bildete in meiner Untersuchung überhaupt Autoantikörper gegen PRAME. Es handelt sich einerseits somit nur um eine kleine Gruppe und eine zuverlässige Aussage bezüglich des Zusammenhangs zwischen der Bildung von PRAME – Autoantikörpern und klinischer, sowie therapeutischer Parameter im individuellen Krankheitsverlauf scheint fraglich zu sein. Andererseits mag die schwache Expression von PRAME und die hier festgestellten nicht relevanten Einflüsse von Therapie, Krankheitsverlauf und laborchemischen Parametern einen Hinweis darauf liefern, dass tatsächlich bezüglich PRAME keine prognostische und therapeutische Relevanz bei Patienten mit Multiplem Myelom gegeben ist. Um die möglichen Einflüsse von Therapien auf den individuellen Titerverlauf der einzelnen Patienten zu untersuchen, wurde eine Einteilung der Patienten in Kohorten vorgenommen. Alle Patienten, bei denen eine Autoimmunantwort gegen PRAME nachweisbar war, zeigten einen stabilen Krankheitsverlauf oder es kam zu einer Verbesserung des klinischen Zustands. Während des Beobachtungszeitraums wurden die insgesamt 4 Patienten allesamt einer Therapie in Form von Auto – SCT oder Allo – SCT zugeführt. Da bezüglich der Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 Signifikanzen gegenüber der Höhe der LDH und der Paraproteine im Serum bestanden, erfolgten auch bei den für PRAME Autoantikörper untersuchten Proben im Krankheitsverlauf eine gleichzeitige Darstellung der Werte für LDH und Paraproteine. In einem der Fälle kam es nach Verabreichung einer autologen Stammzelltransplantation zu einem Anstieg der Autoantikörpertiter gegen PRAME. Die LDH und das untersuchte Paraprotein blieben hierbei unverändert. Ebenfalls im beobachteten Krankheitsverlauf unverändert blieben Paraprotein und LDH auch in einem anderen Falle, wobei hier jedoch nach Verabreichung einer autologen Stammzelltransplantation die Höhe der Autoantikörpertiter abnahm. Eine allogene Stammzelltransplantation erhielten zwei Patienten der PRAME – Autoantikörper bildenden Gruppe. Hiernach war in einem der Fälle ein Rückgang von LDH, Paraproteinen und Autoantikörpertiter nachweisbar. Andererseits kam es in dem zweiten Fall auch nach allogener Stammzelltransplantation zu einem kontinuierlichen Anstieg der Paraproteine, begleitet von mehrfach erhöhten Werten der LDH und zuletzt einem sprunghaften Anstieg der Autoantikörpertiter, so dass dieser Fall eventuell im Rahmen eines Krankheitsprogresses zu sehen ist, wobei über den folgenden Krankheitsverlauf leider keine Daten vorhanden sind. Zusammenfassend lässt sich anhand der Ergebnisse keine abschließende Aussage zur Bedeutung von Therapie, Krankheitsverlauf und der Höhe von Autoantikörpertitern gegen PRAME machen. Signifikante Zusammenhänge ließen sich nicht darstellen.
4.2.2 Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 Die Bildung von Autoantikörpern gegen SOX – 2 bei MGUS wurde 2007 von Dhodapkar et al. untersucht. Es wurden, im Gegensatz zu den hier erhobenen Ergebnissen, bei Myelompatienten keine Autoantikörperantworten gegen SOX – 2 detektiert. Sehr wohl wurden jedoch SOX – 2 Autoantikörper bei MGUS Patienten nachgewiesen. Die Probandengruppe beinhaltete in der damaligen Untersuchung 49 50
Myelompatienten, davon 14 Patienten mit asymptomatischem Multiplem Myelom. Die untersuchte Gruppe war somit zahlenmäßig deutlich geringer als das in dieser Studie untersuchte Patientenkollektiv (N = 150). Darüber hinaus wurden die hier untersuchten Proben von Patienten der Klinik für Hämatologie, Onkologie und Stammzelltransplantation entnommen, ein Großteil der Patienten befand sich bereits in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium und viele Patienten hatten bereits eine Therapie in Form einer autologen oder allogenen Stammzelltransplantation erhalten. Es ist davon auszugehen, dass sich das in dieser Studie untersuchte Kollektiv deutlich von der 2007 untersuchten Patientengruppe von Dhodapkar et al. unterscheidet und somit eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse nur eingeschränkt möglich ist. In der hier untersuchten Studiengruppe bildeten 10% (N=15) der Myelompatienten Autoantikörper gegen SOX – 2. Für alle vorhandenen Proben dieser Patienten wurden, wie zuvor bei PRAME – positiven Patienten, spezifische Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 durch Messungen von Verdünnungsreihen ermittelt. Es wurden in der Folge Zusammenhänge zwischen Höhe der Titer und klinischen, sowie laborchemischen Parametern untersucht. Es bestanden signifikante Unterschiede in Höhe der Titer und Höhe der zum jeweiligen Zeitpunkt bestimmten LDH (p = 0,01). Dabei war eine negative Korrelation festzustellen. Hohe Werte für LDH gehen, den vorliegenden Ergebnissen nach, somit mit tendenziell niedrigeren Titern für Autoantikörper gegen SOX – 2 einher. Dieses könnte ein Hinweis auf einen Einfluss von aktuellem Krankheitsstadium des Patienten auf die Autoimmunantwort gegen CT – Antigene sein, wobei eine erhöhte LDH als Parameter einer erhöhten Tumoraktivität mit niedrigerer Immunantwort auf das Tumorantigen SOX – 2 einhergehen würde. Unklar bleibt hierbei, ob niedrigere Titer gegen Tumorantigene einen Fortschritt der Erkrankung mit erhöhter LDH zur Folge haben, oder eine erhöhte Krankheitsaktivität Einfluss auf die Autoantikörpertiter nimmt. Insgesamt muss jedoch einschränkend ergänzt werden, dass die LDH als laborchemischer Parameter multiplen Einflüssen unterliegt und die Korrelation zur Höhe der Titer nicht außerordentlich hoch ist, so dass die vorangehenden Aussagen sicherlich nur als tendenzielle Richtung aufzufassen sind. Darüber hinaus waren höhere Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 mit höheren Paraproteinspiegeln assoziiert, auch in diesem Fall bestand eine geringe Korrelation. Zudem sprechen höhere Paraproteinlevel für eine vermehrte Tumoraktivität, in diesem Fall gingen sie jedoch mit ebenfalls höheren Autoantikörpertitern einher. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit der bisher geäußerten Ansicht, dass bei Patienten in fortgeschritteneren Krankheitsstadien höhere CT – Antigen Expressionslevel nachweisbar sind (Atanackovic et al. 2009). Bei einem erhöhten Expressionslevel im Falle eines fortgeschrittenen Krankheitsstadiums, in diesem Fall durch erhöhte Paraproteinspiegel messbar, scheint die Bildung ebenfalls höherer Autoantikörpertiter gegen CT – Antigene damit einherzugehen. Gleichfalls nahmen Hämoglobin, Albumin und Plasmazellanteil im Knochenmark laut (Atanackovic et al. 2009) Einfluss auf die Höhe der Expression von CT – Antigenen. Diese Einflüsse von laborchemischen und klinischen Parametern auf die Höhe der gebildeten Autoantikörpertiter gegen CT - Antigene waren wiederum in dieser Studie nicht nachweisbar. 51
Ebenso konnte kein Zusammenhang zwischen Expressionsstärke und Höhe der Autoantikörpertiter, sowie den erfassten laborchemischen Parametern festgestellt werden. Hierbei muss allerdings ergänzt werden, dass insgesamt nur ein kleines Teilkollektiv der Patienten untersucht werden konnte und die Beurteilbarkeit sicherlich eingeschränkt ist. Um die möglichen Einflüsse von Therapien auf den individuellen Titerverlauf der einzelnen Patienten zu untersuchen, wurde auch hier eine Einteilung der Patienten in Kohorten vorgenommen. Insgesamt konnte eine longitudinale Beobachtung der Titer von 13 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsverläufen vorgenommen werden. Da vorangehend Zusammenhänge zwischen SOX – 2 Autoantikörpertitern und der Höhe der LDH, bzw. der Paraproteine im Serum bestanden, wurden die Verläufe dieser Werte ebenfalls mit in die Darstellung aufgenommen. Insgesamt zwei Patienten hatten während des Beobachtungszeitraumes einen stabilen Krankheitsverlauf und erhielten keine weitere Stammzelltherapie, beide Patienten hatten jedoch in der Vorgeschichte eine allogene Stammzelltransplantation erhalten. In einem Fall kam es im Verlauf zunächst zu einem Abfall des Autoantikörpertiters gegen SOX – 2, daraufhin wieder zu einem Anstieg. Dabei waren keine relevanten Änderungen von LDH oder Paraprotein im Serum zu beobachten, die Ursache dieser Veränderung bleibt unklar. Im anderen Fall waren sämtlich Werte für Titer, LDH und Paraprotein im Serum während des Beobachtungszeitraumes stabil. In der Patientengruppe, die während des Beobachtungszeitraumes eine Therapie in Form einer Chemotherapie, Stammzelltransplantation oder DLI erhielt und einen stabilen Krankheitsverlauf, oder sogar eine Besserung erlebten, zeigten sich unterschiedliche Titerverläufe. Ein Patient erhielt während des Beobachtunsgzeitraumes eine Chemotherapie, die mit einem minimalen Rückgang aller dargestellten Parameter einherging (LDH, Paraprotein, SOX – 2 Titer). Nach autologer Stammzelltransplantation kam es in einem Fall zur Serokonversion, der vormals für SOX – 2 Autoantikörper negative Patient bildete nun, wenn auch in geringem Maße, Autoantikörper gegen SOX – 2. Dabei blieben LDH- und Paraproteinlevel stabil. Ebenfalls nach autologer Stammzelltransplantation konnte beobachtet werden, dass ein deutlicher Titeranstieg erfolgte, im Rahmen dieses Anstiegs der Autoantikörper gegen SOX – 2 nahm das Paraproteinlevel leicht ab. Zwei Patienten erlebten nach allogener Stammzelltransplantation eine Serokonversion und es waren zunächst höhere, im Verlauf denn niedrigere Autoantikörpertiter gegen SOX – 2 messbar. Gleichzeitig fiel der Paraproteinspiegel in einem der Fälle deutlich ab, wobei dieses natürlich auch im Rahmen der Immunsuppression nach einer allogenen Stammzelltransplantation interpretiert werden muss. Nach Verabreichung einer DLI kam es in einem beobachteten Fall zu einem nachfolgenden Absinken der Paraproteine, nach kurzer Zeit jedoch wieder zu einem leichten Anstieg. Gleichzeitig entwickelte der Patient eine Autoantikörperreaktion gegen SOX – 2. Der Titer stieg in gleichem Maße, wie die Paraproteinspiegel. Insgesamt kann in dieser Gruppe keine eindeutige Aussage zu Krankheitsverlauf und Verlauf der Titer gegen SOX – 2 getroffen werden. Jedoch zeigt sich hier, wie
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auch vorherig beschrieben, häufig eine Serokonversion nach autologer bzw. allogener Stammzelltransplantation. In der Patientengruppe, die während des Beobachtungszeitraumes eine fortschreitende Erkrankung erlebte, kam es gleichzeitig mit einem Anstieg der laborchemischen Parameter zu einem Anstieg der Titer gegen SOX – 2. Alle Patienten hatten vormals eine allogene Stammzelltransplantation erhalten. In zwei Fällen kam es noch vor dem Anstieg von LDH und Paraproteinen zu einem SOX – 2 Titeranstieg. Nach längerer Beobachtungsphase kam es wieder zu einem allmählichen Rückgang der Autoantikörpertiter. Es ließ sich zusätzlich in einem Fall beobachten, dass die Gabe von Bortezomib einherging mit einem Rückgang des Autoantitkörpertiters gegen SOX – 2. Nach Beendigung der Therapie mit Bortezomib kann es erneut zu einem sprunghaften Anstieg des SOX – 2 Titers. Zusammenfassend lässt sich anhand der Ergebnisse keine abschließende Aussage zur Bedeutung von Therapie, Krankheitsverlauf und der Höhe von Autoantikörpertitern gegen SOX - 2 machen. In der vorliegenden Studie befand sich ein Großteil der Patienten in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium, der Anteil der neu diagnostizierten Patienten war gering. Weiterhin erhielt ein gewisser Anteil der Patienten eine allogene Stammzelltranplantation. Es ist somit davon auszugehen, dass in dem untersuchten Patientenkollektiv eine Expression von CT – Antigenen und somit auch die Bildung von Autoantikörpern gegen CT – Antigene wahrscheinlicher ist, als in einem Kollektiv anders behandelter oder neu diagnostizierter Patienten. So ist es wahrscheinlich, dass der bereits 2007 von Dhodapkar et al. im Vorfeld geäußerte wesentlich geringe Nachweis von SOX – 2 Autoantikörpern im damals untersuchten Patientenkollektiv nicht ausschließlich auf eine geringe Anzahl untersuchter Patienten zurückzuführen ist, sondern auch Ausdruck des anders zusammengesetzten Patientenkollektivs ist. Aktuell liegen, meiner Erkenntnis nach, keine weiteren Studien vor, die klinische und laborchemische Parameter und Titer von Autoantikörpern gegen CT – Antigene untersuchten. Eine weitere Untersuchung und Spezifizierung der erhobenen Ergebnisse in weiterführenden Studien erscheint sinnvoll, um Zusammenhänge darzustellen und weiter zu untersuchen.
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4.3
Die Bedeutung von CT – Antigen - Titern als diagnotische Parameter für den Krankheitsverlauf und potentieller Nutzen in der Immuntherapie
4.3.1 Diagnose und Verlaufsparameter Die Rolle des Immunsystems in Zusammenhang mit der Entwicklung von Tumoren und dessen Bedeutung für die Entwicklung der malignen Erkrankung ist bereits seit langer Zeit Gegenstand intensiver Forschungen. Insbesondere die T – Zell – Immunität stand in diesem Zusammenhang im Mittelpunkt des Interesses. Darüber hinaus könnten immunologische Parameter als Verlaufsmaß einer Erkrankung dienen. Über einen möglichen Nutzen des Nachweises von CT – Genen im Knochenmark von Patienten zur Detektion einer minimal residual disease, in diesem Fall PRAME wurde bereits diskutiert (Matsushita et al. 2001). Die Expression eines weiteren CT – Antigens, MAGE – C1 bei Myelompatienten nach allogener Stammzelltransplantation scheint mit einer schlechten Prognose einherzugehen. Die betreffenden Patienten hatten sowohl eine kürzere rezidivfreie Zeit, als auch eine deutlich reduzierte Überlebenszeit wenn sie MAGE – C1 exprimierten (Atanackovic et al. 2009). Auch die Bedeutung der spontanen humoralen Immunantwort im Rahmen von Tumorerkrankungen war bisher bereits Gegenstand von Studien. Dabei wurden Autoantikörperantworten unter anderem auch bei hämatologischen Erkrankungen untersucht (Titulaer et al. 2009). Wird ein Antigen besonders häufig bei bestimmten Tumoren exprimiert und findet zu großen Teilen eine humorale Autoimmunantwort statt, lassen sich also regelmäßig Autoantikörper gegen tumorassoziierte Antigene nachweisen, so könnten diese Autoantikörper als serologischer Parameter für die Diagnostik einer Tumorerkrankung, eventuell auch als Verlaufsparameter, genutzt werden. In der hier vorliegenden Untersuchung konnte allerdings weder für Prame, noch für SOX – 2 ein Zusammenhang zwischen Autoantikörpertitern, laborchemischen Parametern und Expression der Antigene in den Plasmazellen nachgewiesen werden. Vor allem für das Mamma Carcinom, Prostata Carcinom und die Unterscheidung zwischen paraneoplastischem und sporadischem Lambert – Eaton – Syndrom, in letztem Fall sogar anhand der Bestimmung von SOX – 2 Autoantikörpern, wurde ein diagnostischer Nutzen von Autoantikörpern im Rahmen von Tumorerkrankungen angenommen (Titulaer et al. 2009; Kobold et al. 2010). Der Nachweis von Autoantikörpern gegen NY – ESO – 1 korrelierte in einer vorangehenden Studie mit der Tumormasse bei Multiplem Myelom (Jäger et al. 1999) und das Vorkommen von NY – ESO – 1 Autoantikörpern war assoziiert mit einem Krankheitsprogress oder Rezidiv (van Rhee et al. 2005). Mehrfach wurde das Auftreten bestimmter spezifischer Autoantikörper mit der Prognose bei Krebspatienten assoziiert, dabei waren sowohl positive, als auch negative Einflüsse auf die Prognose der Patienten nachvollziehbar (Kobold et al. 2010). Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Autoantikörpern gegen tumorassoziierte Antigene und einem guten Outcome der betreffenden Patienten wurde unter anderem 54
interpretiert als Folge eines guten allgemeinen Gesundheitszustandes. Andererseits gelten einige Autoantikörper auch als Indikator eines Krankheitsprogresses oder eines Rezidives (Jäger et al. 1999), darüber hinaus scheinen sie wiederum in anderen Fällen mit einem besseren Ansprechen auf die Therapie einherzugehen (Trieb et al. 2000). Kein spezifischer Effekt von Autoantikörpern gegen SOX – 2 wurde auf die Prognose bei kleinzelligem Lungenkarzinom (Titulaer et al. 2009; Maddison et al. 2010) festgestellt. Dennoch gelten die Autoantiköper gegen SOX als zunehmend wichtige Marker in der frühzeitigen Diagnostik von Tumorerkrankungen. Titulaer et al. entwickelten bereits 2009 einen ELISA zum Screening der Patienten mit kleinzelligem Lungenkarzinom (Titulaer et al. 2009). Die Ergebnisse bezüglich des Auftretens von Autoantikörpern und deren Bedeutung für Krankheitsverlauf sind also sehr unterschiedlich. Hinweise auf verwertbare Korrelationen in diesem Zusammenhang existieren allerdings, sowohl für die Erstdiagnostik, als auch für das Monitoring der Erkrankung. In Zusammenschau dieser Ergebnisse scheint die Nutzung von Autoantikörpern gegen CT – Antigene zur frühzeitigen Diagnostik im Rahmen maligner Erkrankungen sinnvoll zu sein.
4.3.2 Immuntherapie Aktuell ist die allogene Stammzelltransplantation die einzige Therapieoption für das Multiple Myelom, die als potentiell kurativ zu werten ist. Die Behandlung ist äußerst belastend und geht mit einer erhöhten Mortalität einher, darüber hinaus eignet sich nur ein eingeschränktes Patientenkollektiv zur Behandlung (Gahrton et al. 1995; Bladé 2003) und die Voraussetzung eines geeigneten HLA – kompatiblen Spenders muss ebenfalls gegeben sein. Die myleoablative Konditionierung im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation ist mit einem hohen Mortalitätsrisiko assoziiert und nur für ein kleines Patientenspektrum geeignet. Insbesondere ältere Patienten mit malignen hämatologischen Erkrankungen profitieren von neueren Entwicklungen zu Konditionierung mit reduzierter Intensität, die leichter verträglich sind. Dabei spielt die Graft – versus – Leukaemia Reaktion eine bedeutende Rolle. Die Infusion von T – Lymphozyten des Spenders kann bei Myelompatienten mit einem Rezidiv zu einer erneuten Remission führen (Schetelig et al. 2005). Die Anwendung von DLI´s (Donor Lymphocyte Infusions) bei Patienten mit einem Krankheitsprogress nach allogener Stammzelltransplantation wird zur Induzierung einer kompletten Remission genutzt, hierbei wird davon ausgegangen, dass es im Rahmen der Behandlung zu einer effektiven Graft – versus – Myeloma Reaktion kommt (Verdonck et al. 1998; Zeiser et al. 2004). Ein Zusammenhang zwischen den transplantationsinduzierten Immunreaktionen und der Elimination von Myelomzellen, zum Beispiel anhand humoraler Immunmechanismen gegen CT – Antigen exprimierende Zellen ist wahrscheinlich. In der Behandlung des Multiplen Myeloms werden zunächst Chemotherapie und im weiteren Krankheitsverlauf die autologe Stammzelltransplantation als therapeutische Maßnahmen eingesetzt, darüber hinaus steht für ein kleines Patientenkollektiv die allogene Stammzelltransplantation zur Verfügung. Als einer der zentralen Gründe für die häufigen Rezidive im Krankheits55
verlauf beim Multiplen Myelom wird das Vorhandensein einer minimal residual disease diskutiert. Nach der Beendigung der Therapie persistiert in einem Großteil der Patienten ein geringster Anteil von Tumorzellen, der in häufigen Fällen zu einem Rezidiv führt (Attal et al. 1996; Attal et al. 2003). Hierbei verbleibt trotz klinischen Remissionsstatus des Patienten eine minimale Population Tumorzellen, welche den therapeutischen Optionen gegenüber, zum Beispiel chemotherapeutischer Behandlung, widerstandsfähiger sind als die ursprüngliche Population. Dieses wurde durch die Studie von Matsui, Wang 2008 belegt, hier zeigte sich, dass eine kleine, chemotherapieresistente Population von Myelomzellen nach der konventionellen Chemotherapie verblieb. Diese minimale Zellgruppe war darüber hinaus fähig, klonales Wachstum zu initiieren (Matsui et al. 2008). CT – Antigene könnten aufgrund ihrer nahezu auf Tumorgewebe begrenzten Expression als Zielstuktur im Rahmen einer immunologischen Therapie der minimal residual disease dienen. Insgesamt scheinen enge Zusammenhänge zwischen einer minimal residual disease und dem Vorkommen von CT – Antigenen zu existieren. Die gezielte Immuntherapie zur Eradikation ebendieser verbleibenden Tumorzellen scheint vielsprechend. Der mögliche Einsatz in der Immuntherapie bei Tumorpatienten setzt die Immunogenität der Tumorantigene, hier CT – Antigene, voraus. Für MAGE – C1 und MAGE – C2 als Vertreter der CT – Antigengruppe konnten schon früh spontane Immunantworten bei soliden Tumoren nachgewiesen werden (Güre 2000; Wang et al. 2002; Wenbin 2004). Darüber hinaus wurde die Möglichkeit der Induzierung einer spontanen Immunantwort auch bei Multiplem Myleom aufgezeigt (Curioni-Fontecedro et al. 2008). In diesem Zusammenhang wurde von Dadabayev et al. 2005 eine Immuntherapie appliziert, die das CT – Antigen Sp17 als Zielstruktur nutzte. Hierbei wurden einem Myelompatienten mit Rezidiverkrankung nach allogener Stammzelltransplantation Sp17 gepulste dendritische Zellen verabreicht. Nach der Immunisierung konnte der Nachweis von Sp17 Autoantikörpern bei dem Patienten erfolgen und es kam zu einer deutlichen Reduktion des Paraproteins. Gleichzeitig entwickelte der entsprechende Patient währen der Therapie jedoch eine Graft – versus – Host Erkrankung (Dadabayev et al. 2005). Ein Einsatz der gewonnen Erkenntnisse zur Immuntherapie findet auf experimenteller Ebene somit schon statt und die Ergebnisse unterschiedlichster Untersuchungen sprechen für einen potentiellen Nutzen. Die tumorsuppressiven Effekte des immunologischen Geschehens scheinen dabei sowohl auf zellulärer als auch auf humoraler Ebene stattzufinden. DiFronzo et al. zeigten 2002, dass das Ansprechen auf eine Therapie und die Überlebenswahrscheinlichkeit sowohl mit einer wirkungsvollen T – Zell – Immunantwort, als auch mit den jeweilig gebildeten Autoantikörpern assoziiert waren (DiFronzo et al. 2002). Es wird vermutet, dass eine Aktivierung der T - Zellen im Rahmen einer Antitumoraktivität durch die humorale Immunantwort auf Tumorantigene induziert werden könnte (Milne et al. 2008). Autoantikörper gegen tumorassoziierte Antigene können in diesem Fall als Opsonine wirken und über die Aufnahme und 56
Prozessierung durch antigenpräsentierende Zellen immunogene Prozesse, so auch die Aktivierung von T – Zellen, beeinflussen. Gleichzeitig findet ein Recruitment der NK Zellen durch die Opsonierung der Tumorzellen statt und die Aktivierung der Komplementkaskade wird initiiert (Canevari et al. 1996). Dennoch scheint die spontane Antitumoraktivität des Immunsystems, insbesondere auf humoraler Ebene nicht ausreichend zur Kontrolle des Tumorwachstums zu sein. Hierfür werden verschiedene Strategien der Tumorzellen zur Immunsuppression, beziehungsweise Veränderung der tumorsuppressiven Funktionen des Immunsystems verantwortlich gemacht. Zum einen wird eine effektive Immunantwort der B – Zellen verhindert, zum anderen werden komplementsystemabhängige und antikörperabhängige zytotoxische Mechanismen beeinflusst. Darüber hinaus sind auch die Antikörper abhängigen Signalwege betroffen, so dass die Auswirkungen eines Auftretens der tumorantigenspezifischen Antikörper auf den Krankheitsverlauf der Tumorpatienten begrenzt bleiben (Nyhus et al. 2001; Cassard et al. 2008). So scheinen Autoantikörper gegen das CT – Antigen NY – ESO – 1 am ehesten mit einer erhöhten Tumorlast einherzugehen, eine immunologische Funktion wurde im fortgeschrittenen Krankheitsstadium eher als unwahrscheinlich angesehen. Insbesondere wurde CT – Antigenen zugeschrieben, eine Rolle in dem Prozess der Beeinflussung von Apoptosevorgängen zu spielen (Atanackovic et al. 2009; Nylund et al. 2012). CT – Antigene, unter anderem SSX2, wirken unter anderem als Transkriptionsfaktoren (Wang et al. 2002; Chen 2012). Dabei scheint die vermehrte Expression von Proteinen, welche Apoptosevorgänge verhindern, auch bei Multiplem Myelom stattzufinden (Spets, Strömberg et al. 2002; Bharti, Shishodia et al. 2004). So ging in einer vorangehenden Studie die vermehrte Expression von MAGE – C1 oder MAGE – A3 auch mit einer vermehrten Plasmazellproliferation einher (Jungbluth et al. 2005; Tinguely et al. 2008). Dadurch, dass häufig Coexpressionen von mehreren CT – Antigenen dargestellt werden konnten, geht man darüber hinaus von einer Regulationsfunktion einiger dieser Tumorantigene aus (Atanackovic et al. 2009). Es wird davon ausgegangen, dass MAGE – A3 eine solche Funktion einnehmen könnte. Dementsprechend würde diesem Tumorantigen in seiner Rolle als “Gatekeeper” im Rahmen einer Tumorerkrankung eine zentrale Bedeutung zur Steuerung nachfolgender Zellprozesse einnehmen und zum Beispiel als Target einer Immuntherapie dienen können (Atanackovic et al. 2007). In früheren Stadien der Erkrankung könnte dagegen eine tumorsuppressive Funktion von Autoantikörpern möglich sein (Jäger et al. 1999). Auch die Detektion von anti – SOX – 2 T – Zellen war in einer vorangehenden Studie mit einem besseren klinischen Outcome von Patienten mit MGUS assoziiert. In vitro konnte gezeigt werden, dass auf zellulärer Ebene eine Immunität gegenüber SOX – 2 das Wachstum von MGUS – Zellen verhindern kann (Dhodapkar et al. 2007). Bereits 2007 konnte gezeigt werden, dass Immunreaktionen auf CT – Antigene besonders nach allogener Stammzelltransplantation stattfinden (Atanackovic et al. 2007), diese Ergebnisse bestätigten sich auch durch die vorliegende Untersuchung. Eine spontane anti – Myelom Aktivität ließ sich somit nachweisen, die Nutzbarkeit als Zielstruktur auch im Rahmen therapeutischer Interventionen wirkt 57
vielversprechend, der Effekt scheint sich jedoch im Verlauf der Erkrankung, aufgrund fortschreitender immunsuppressiver Mechanismen der Tumorzellen an Bedeutung zu verlieren (Jäger et al. 1999). Es wurde in der Vergangenheit davon ausgegangen, dass eine Expression der CT Antigene nahezu ausschließlich in Tumorgewebe stattfindet. Sowohl für SOX – 2, als auch für PRAME, scheint diese Annahme nicht mehr gültig zu sein (Ikeda et al. 1997). Auch in der hier vorliegenden Untersuchung konnten SOX – 2 Autoantikörper bei gesunden Probanden nach gewiesen werden. Es wird davon ausgegangen, dass die Expression von PRAME ebenso nicht auf Tumor- und Hodengewebe limitiert ist (Ikeda et al. 1997). Fraglich ist somit, ob SOX – 2 und PRAME als CT – Antigene somit überhaupt zur in vivo Immuntherapie im eigentlichen Sinne geeignet sind. Diese Fragestellung könnte Gegenstand weiterer Studien sein. Ein diagnostischer Wert zur frühen Detektion einer minimal residual disease bei AML wurde allerdings mehrfach beschrieben (Steinbach et al. 2006) und könnte auch in Zukunft potentiell von Nutzen sein.
4.4
Ausblick
Durch chemotherapeutische Maßnahmen und autologe Stammzelltransplantation als initial zentrale Therapien kann bei Patienten mit multiplem Myelom eine signifikante Reduktion der Tumorzellen, auch unterhalb der Nachweisgrenze, erreicht werden. Die Eradikation mininmaler, verbleibender, maligner Zellpopulationen mit besonderen Eigenschaften der Resistenz gegenüber konventioneller Therapie scheint das ideale Ziel immunotherapeutischer Methoden zu sein. Dabei gelten Vakzinierungsstrategien und der Einsatz monoklonaler Antikörper, sowie die Modulation des Immunsystems durch gezielten Einsatzes von Zytokinen als die zentrale Ansatzmöglichkeit der Immuntherapie (Danylesko et al. 2012). Die erfolgreichste Vakzinierungsstrategie bei malignen Erkrankungen wird im Rahmen der Impfungen gegen HPV angewandt, durch die Vermeidung chronischer HPV Infektionen kann eine signifikante Reduzierung des Risikos für Cervixkarzinome erreicht werden (Rambout et al. 2007). Titer gegen HPV – Antigene treten auch spontan auf, diese scheinen jedoch, anders als nach Vakzinierung, nicht die erforderliche Titerhöhe zu erreichen um eine Reinfektion zu vermeiden (Frazer 2009; Kobold et al. 2010). Bei Lymphompatienten führten in einer vorherigen Studie die durch eine Vakzinierung gebildeten Autoantikörper zu einer effektiven Antigenpräsentation durch dendritische Zellen und gingen einher mit einem verlängertem progressfreien Zeitraum (Weng et al. 2004; Kobold et al. 2010). Neben einer unmittelbaren Wirkung im Sinne einer Antitumor Aktivität, erhofft man sich darüber hinaus die Entwicklung eines immunologischen Gedächtnisses und damit allgemein die frühzeitige Verhinderung von Rezidiverkrankungen (Meklat et al. 2007). CT – Antigene wirken auch in Zusammenhang mit zytotoxischen T – Lymphozyten immunogen. Es konnten zytotoxische T – Lymphozyten aus dem peripheren Blut von Patienten mit malignen hämatologischen Erkrankungen generiert werden, die gegen Sp17 und NY – ESO – 1 58
agierten und in der Lage waren, Tumorzellen, unter anderem Myelomzellen zu eliminieren (Chiriva-Internati et al. 2002; van Rhee et al. 2005). Diese Ergebnisse wurden als Möglichkeit interpretiert, CT – Antigene als Zielstruktur bei tumorspezifischen Impfungen zur Induzierung einer gegen die Myelomzellen gerichtete Reaktion zu nutzen (Meklat et al. 2007). Fraglich ist allerdings, ob eine spezifische Immuntherapie ebenfalls ähnlich Effekte anderer Therapien erzeugen könnte, es zu einer Selektion resistenter Tumorzellen kommen könnte. Eine Anwendung der Immuntherapie im Rahmen einer kombinierten Therapie mit verschiedenen Angriffspunkten scheint hierbei ein vielsprechender Ansatz zu sein. Im Zentrum von zukünftigen Studien, welche die Entwicklung immuntherapeutischer Strategien zum Ziel haben, sollte unter anderem stehen, ein in Vorbehandlung und Eingangskriterien vergleichbares Patientenkollektiv zu untersuchen. Ein Nutzen der bisher gewonnenen Erkenntnisse in der zukünftigen Immuntherapie des Multiplen Myeloms oder zu diagnostischen Zwecken scheint allerdings durchaus möglich zu sein.
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Zusammenfassung
Die Immuntherapie gilt als ein vielversprechender Ansatz in der Behandlung maligner hämatologischer Erkrankungen, die Identifizierung möglicher Zielstrukturen einer immunologischen Therapie ist aktuell der Gegenstand vieler Forschungen. CT –Antigene werden in vielfachen Geweben exprimiert und rufen bei Myelompatienten eine immunologische Reaktion hervor, die zum Beispiel in Form von Antikörpern und T – Lymphozyten nachweisbar ist (Atanackovic et al. 2007). Aufgrund ihrer Fähigkeit immunologische Reaktionen zu provozieren und gleichzeitig in gesundem Gewebe nur sehr limitiertem Vorkommen, gelten CT – Antigene als vielversprechende Zielstrukturen zur Diagnostik und Immuntherapie von malignen Erkrankungen. Das Auftreten der CT – Antigene bei Tumorerkrankungen wurde mehrfach voruntersucht. Modellprojekte zur Immuntherapie bei malignen Erkrankungen, die das Auftreten von CT – Antigenen nutzten, wurden durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Vakzinierungsstrategien, sowohl in Form von Peptiden, als auch in Form dendritischer Zellvakzine Immunantworten hervorrufen können (Krishnadas et al. 2013). Wenig evaluiert wurde die Bildung von Autoantikörpern gegen CT- Antigene. In der vorliegenden Untersuchung wurde das spontane Vorkommen von SOX – 2 und PRAME spezifischen Autoantikörpern und deren Titerverlauf bei Patienten mit Multiplem Myelom und gesunden Probanden untersucht. PRAME wird den vorangehenden Studien zufolge (Ikeda et al. 1997) in vielen Geweben, nicht ausnahmslos in Tumorgewebe, exprimiert. Im untersuchten Patientenkollektiv bildeten nur wenige Patienten Autoantikörper gegen PRAME, die Immunogenität von PRAME beim Multiplem Myelom scheint aufgrund der hier erhobenen Ergebnisse gering zu sein. Die Expression von SOX – 2 scheint ebenfalls nicht ausnahmslos tumor- oder myelomspezifisch stattzufinden (Kobold et al. 2011). SOX – 2 spezifische Autoantikörper konnten jedoch im Kollektiv der Myelompatienten deutlich häufiger nachgewiesen werden, als zuvor im Rahmen anderer Studien beschrieben (Dhodapkar et al. 2007). Die Titer gegen SOX 2 waren vergleichsweise hoch. Klinische und laborchemische Parameter korrelierten in der hier vorliegenden Untersuchung nicht mit der Bildung von Autoantikörpern gegen die untersuchten CT – Antigene, obwohl ein Zusammenhang zwischen Tumorstadium, verschiedenen relevanten Parametern und Expression von anderen CT – Antigenen, wie MAGE-C1/CT7, vorbeschrieben ist (Atanackovic et al. 2009). Lediglich die Applikation einer allogenen Stammzelltransplantation nahm Einfluss auf die Entwicklung SOX – 2 und PRAME spezifischer Autoantikörper. Es ist somit anzunehmen, dass die allogene Stammzelltransplantation eine Immuntoleranz gegenüber CT – Antigenen zu durchbrechen vermag. Darüber hinaus scheinen Zusammenhänge zwischen LDH, Paraproteinwerten und Höhe der SOX – 2 Titer zu bestehen, ohne dass eine eindeutige Aussage bezüglich des kurzfristigen Fortschritts der Erkrankung getroffen werden konnte. 60
Inwiefern SOX – 2 und PRAME spezifische Autoantikörper am Verlauf der Krankheitsentwicklung des Multiplen Myeloms beteiligt sind, ob ihr Auftreten durch weitere Faktoren begünstigt oder verhindert wird und welche klinische Relevanz ihre Detektion haben könnte, könnte in Zukunft im Rahmen weiterer Studien untersucht werden.
61
6 Anhang Tabelle 3: Patientencharakteristika und Bildung von Antiköpern gegen CT-Antigene
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Tabelle 4: Probencharakteristika und Bildung von Antiköpern gegen CT-Antigene
63
Tabelle 5: Probenparameter und SOX – 2 Titer
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Tabelle 6: Probenparameter und PRAME Titer
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Tabelle 7: Probenparameter und Expression von SOX – 2 und Prame
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7 Abkürzungsverzeichnis Allo – SCT
Allogenic Stem Cell Transplantation, Allogene Stammzelltransplantation
AML
Akute myeloische Leukämie
Auto – SCT
Autologous Stem Cell Transplantation, Autologe Stammzelltransplantation
CEA
Carcinoembryonic antigen, karzinoembryonales Antigen
CR
Complete remission, komplette Remission
CT - Antigen
Cancer – Testis – Antigen
CTL
Cytotoxic - T – Lymphocytes, zytotoxische T – Lymphozyten
DLI
Donor lymphocyte infusion
DNA
Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
ELISA
Enzyme - linked immunosorbent assay
FISH
Fluoreszenz – in – situ – Hybridisierung
GST
Glutathione S - Transferase
GvHD
Graft – versus – Host – Disease
HLA
Human Leukocyte Antigen
HPV
Humane Papillomaviren
Ig
Immunglobulin
IL – 6
Interleukin - 6
IMF
International Myeloma Foundation
LDH
Lactatdehydrogenase
MAGE – A3
Melanoma-associated antigen 3
MAGE – C1
Melanomaantigenfamily C 1
MAGE – C2
Melanomaantigenfamily C 2
MGUS
Monoklonale Gammopathie unklarer Signifikanz
MHC
Major Histocompatibility Complex
MM
Multiples Myelom 67
MRD
Minimal residual disease
NK – Zellen
Natürliche Killerzellen
NP
Influenza A protein
NY – ESO – 1
New York esophageal squamous cell carcinoma 1
OD
Optische Dichte
PCR
Polymerase chain reaction
PR
Partielle Remission
PRAME
Preferentially Expressed Antigen of Melanoma
RNA
Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RT - PCR
Reverse transcription polymerase chain reaction
SMM
Smoldering multiple myeloma
SOX – 2
SRY - related HMG box 2
Sp17
Sperm protein 17
SSX2
Synovial sarcoma, X breakpoint 2
STIKO
Ständige Impfkommission
THC
T – Helper - Cells, T – Helfer – Zellen
TT
Tetanus Toxoid
VAD
Vincristin, Doxorubicin (Adriamycin), Dexamethason
VEGF
Vascular endothelial growth factor
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9 Danksagung Mein besonderer Dank gilt PD Dr. med. Djordje Atanackovic und Dr. med. Sebastian Kobold für Ihre kontinuierliche Unterstützung und für manchen guten Ratschlag. Ich möchte mich darüber hinaus bei meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Bokemeyer und auch bei Herrn Prof. Dr. Kröger bedanken, deren Patienten aus der Abteilung für Stammzelltransplantation im UKE die Untersuchungsgruppe meiner Arbeit bildeten. Außerdem sei an dieser Stelle auch der Deutschen José Carreras Leukämie-Stiftung e.V. ein Dank hinsichtlich der Finanzierung der Laboranalysen ausgesprochen. Bei allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie im UKE möchte ich mich für die nette Arbeitsatmosphäre und ihre Hilfsbereitschaft im Labor bedanken. Besonders Katrin Bartels und Tanja Stahl waren mir bei Problemen häufig eine große Hilfe. Ein außerordentlich großer Dank gilt an dieser Stelle meiner Familie. Mit ihrer Unterstützung in allen Lebenslagen haben sie es mir ermöglicht, Medizin zu studieren und diese Doktorarbeit erfolgreich abzuschließen.
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Curriculum vitae
Entfällt aus datenschutzrechtlichen Gründen
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11 Eidesstattliche Erklärung Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.
Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe.
Ich erkläre mich einverstanden, dass meine Dissertation vom Dekanat der Medizinischen Fakultät mit einer gängigen Software zur Erkennung von Plagiaten überprüft werden kann.
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