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DISS. ETH NO. 23677
ENGINEERING OF AN AMINO ACID RACEMASE FOR APPLICATION IN SEPARATION-INTEGRATED DYNAMIC RESOLUTIONS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich) presented by
Christian Femmer Diplom-Ingenieur Biotechnology, TU Berlin born on 16.04.1979 citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Sven Panke (ETH Zurich, Switzerland), examiner Prof. Dr. Martin Fussenegger (ETH Zurich, Switzerland), co-examiner
2016
SUMMARY Chiral carbon atoms play a crucial role in the activity of organic compounds that interact with biological systems, including drugs, flavors and fragrances, and agricultural compounds such as pesticides. One of the main synthetic routes to optically pure preparations of such chiral compounds is the preparation of the racemate and subsequent resolution. Such resolutions are limited to a theoretical yield of 50 %. This yield can be doubled by integration of a step-wise or continuous racemization of the non-desired enantiomer. However, many of the different routes toward racemization of a compound require harsh treatments and are therefore often incompatible with the highly functionalized state of the compound to be resolved. Employing enzymatic catalysis for racemization can therefore be highly beneficial, yet their application in biocatalysis is rarely explored. Coupling mild enzymatic racemization and a potent physical enantioseparation technology such as continuous chiral chromatography, realized in the form of a simulated moving bed (SMB), enables the production of single enantiomers from racemates in theoretically 100% yield and hence constitutes a highly desirable process route for fine chemicals. This requires the availability of a cost effective enzyme, which depends on factors such as catalytic proficiency of the enzyme with the substrate of interest, its efficient production, and its stability under process conditions. While the first two aspects are generic problems in biocatalysis, the latter aspect is specific to the strategy of reaction-integrated processing: The direct coupling of SMB and bioreactor requires the same phase in both units, the separation and the racemization unit. As the productivity of the overall process is highly sensitive to the composition of the mobile phase that is applied in the continuous chromatography, the enzyme needs to operate efficiently under suitable separation conditions, such as high content of 5
water-miscible organic solvents. In this thesis, a suitable amino acid racemase is engineered for such a process, which constitutes an important model enzyme for such an approach due to the importance of amino acids as building blocks in the fine chemical industry. We improved the racemization of ornithine, a possible starting block for the large-scale synthesis of sulphostin, by a broad-spectrum amino acid racemase from Pseudomonas putida (PpAAR). In order to improve the catalytic performance of the racemase, we constructed a strain whose growth is dependent on the conversion of D- to L-ornithine so that changes in enzyme performance could be scored by their effect on growth behavior which is one of the most widely applied strategies for identifying improved biocatalysts. While this strategy is powerful in removing non-functional catalysts, measuring subtle differences in growth behavior remains difficult at high throughput due to the lack of suitable methods. Here, we demonstrate successful miniaturization of a growth-based directed enzyme evolution process in optically clear gel-like microcarriers of nanoliter volume (“nanoliter reactors” or NLRs), which allow reading out subtle differences in growth by measuring the fluorescence of cells constitutively expressing a fluorescent protein in a fluorescence-assisted particle sorter. The discriminatory power of the assay was increased by including lysine as a competitive inhibitor, or antimetabolite. We isolated a PpAAR mutant with a total of twelve mutations, none of which close to the active site of PpAAR, with a catalytic efficiency improvement of 2.1-fold (conversion of D- to Lornithine) and 2.7-fold (L to D), respectively. In order to improve the PpAAR stability in MeOH/water mixtures, we developed a simple method that allowed considerable stability improvements with low experimental effort. It is based on the assumption that the introduction of additional arginine residues on the surface of an enzyme improves the behavior in water/organic solvent mixtures because of its increased capacity to form hydrogen bonds which either increases the 6
energy that is required for unfolding or hinders the removal of critical water molecules from the structure. By sequence comparison with thermophilic homologous enzymes, we identified suitable residues for exchange, constructed a master variant with all previously identified mutations, and performed gene shuffling with the gene for the parent enzyme. This way, we identified PpAAR variants that had a significantly extended half-life time in 40 % MeOH [up to 8-fold] and 30 % acetonitrile [up to 8-fold] while retaining their catalytic activity under aqueous conditions.
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ZUSAMMENFASSUNG Chirale Kohlenstoffatome spielen eine entscheidende Rolle in der Aktivität von organischen Molekülen, die mit biologischen Systemen interagieren, wie zum Beispiel Arzneistoffe, Geschmacks- und Duftstoffe, oder Pestizide in der Landwirtschaft. Eine der Hauptrouten zur Herstellung von Verbindungen, die nur eine von zwei möglichen chiralen Formen enthalten (enantiomerenreine Stoffe) ist die Kopplung der Herstellung eines Racemats (Gemisch beider chiraler Formen in gleicher Menge) der gewünschten Verbindung und dessen Spaltung. In einer solchen Route ist die Ausbeute auf maximal 50 % limitiert, da immer mindestens 50% des Ausgangsmaterials zurückbleiben, nämlich das Material mit der falschen Konfiguration. Eine Verdopplung der Ausbeute kann erreicht werden, wenn die Racematspaltung mit einer schrittweisen oder kontinuierlichen Racemisierung des ungewünschten Enantiomers gekoppelt wird. Jedoch finden viele Racemisierungsreaktionen unter extremen Bedingungen statt und sind daher oft unvereinbar mit den hochfunktionalisierten Molekülen, die für die LifeScience
Branchen
relevant
sind.
Eine
enzymatische
Racemisierung,
die
typischerweise unter sehr milden Bedingungen stattfindet, kann daher sehr vorteilhaft sein. Allerdings ist deren Anwendung in der weissen Biotechnologie noch recht wenig erforscht. Die Kopplung einer milden enzymatischen Racemisierung mit einer effizienten kontinuierlichen
Chromatographieeinheit
zur
Racematspaltung,
realisiert
als
sogenanntes „simuliertes Fliessbettverfahren“ (SMB, für Englisch „simulated moving bed“), ermöglicht die Produktion des gewünschten Enantiomers mit einer theoretischen Ausbeute von 100 % und ist daher ein sehr attraktiver Prozessweg zur Herstellung
von
enantiomerenreinen
Feinchemikalien.
Dieser
erfordert
die
Verfügbarkeit eines kostengünstigen Enzyms, welches sich leicht rekombinant 9
herstellen lässt, eine hohe katalytische Aktivität für das Substrat von Interesse besitzt und stabil unter Prozessbedingungen ist. Während die ersten beiden Aspekte jeden Bioprozess betreffen, ist letzterer ein spezifisches Problem für die Strategie der reaktionsintegrierten Prozesse: Das direkte Koppeln von SMB und Bioreaktor erfordert dasselbe Reaktionsmedium in beiden Prozesseinheiten. Ferner hängt die Produktivität des Gesamtprozesses sehr stark von der Komposition der mobilen Phase in der Chromatographieeinheit ab. Da diese für die Trennung von Feinchemikalien wie Aminosäuren einen hohen Anteil von organischem Lösungsmittel enthalten muss, sollte das Enzym effizient in diesem Medium arbeiten können. In der vorliegenden Arbeit wird ein geeignetes Enzym, genauer gesagt eine Aminosäureracemase, für einen solchen Prozess mittels gerichteter Evolution optimiert. Die Wichtigkeit von Aminosäuren als Bausteine für die Feinchemikalienindustrie macht dieses Enzym zu einem hochinteressanten Modellenzym. Wir verbessern die Racemisierung von Ornithin, einem möglichen Ausgangsstoff für die grossmassstäbliche Synthese von Sulphostin, durch eine Aminosäureracemase von Pseudomonas putida (PpAAR). Um die katalytische Effizienz der Racemase zu verbessern, konstruierten wir einen Stamm, dessen Wachstum von der effizienten Umwandlung von D-zu L-Ornithin abhängt. Unterschiede in der Leistungsfähigkeit der Racemase konnten so durch ihre Auswirkung auf das Wachstum leicht nachvollzogen werden. Diese Strategie ist eine der gebräuchlichsten, um verbesserte Varianten zu identifizieren. Sie ist sehr aussichtsreich, um nicht-funktionelle Enzymvarianten auszusortieren. Um jedoch kleinere Unterschiede im Hochdurchsatz zu detektieren, fehlen bisher die nötigen Methoden.
Hier
demonstrieren
wir
die
erfolgreiche
Miniaturisierung
einer
wachstumsbasierten Methode zur gerichteten Enzymevolution in optisch klaren, aus einem Hydrogel bestehenden Nanoreaktoren mit Volumina im Nanoliterbereich (NLRs, für Englisch „nanoliter reactors“). Diese erlauben das Detektieren von kleinsten 10
Wachstumsunterschieden durch die Messung der Fluoreszenz von Zellen, die ein fluoreszierendes Proteins konstitutiv exprimieren. Dazu wird ein Gerät genutzt, das die Fluoreszenz von Kolonien in diesen Nanoreaktoren im Hochdurchsatz messen kann. Die Trennschärfe des Assay wurde durch die Zugabe eines Antimetaboliten erhöht. Schlussendlich konnte eine PpAAR Variante mit 12 Mutationen isoliert werden, von denen keine in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrums liegt, deren katalytische Effizienz jedoch 2.1-fach (D- zu L-Ornithin) bzw. 2.7-fach (L zu D) über der des Wildtyps lag. Um als nächstes die PpAAR Stabilität in Methanol/Wassermischungen zu optimieren, wurde ein einfaches Protokoll entwickelt, um erhebliche Verbesserungen der Stabilität mit geringem experimentellem Aufwand zu erzielen. Dies basierte auf der Annahme, dass zusätzliche Argininreste auf der Oberfläche von einem Enzym das Verhalten des Enzymes in Mischungen von organischen Lösungsmitteln und Wasser dadurch verbessern,
dass
die
Argininreste
zusätzliche
Wasserstoffbrückenbindungen
eingehen und somit entweder die Energie erhöhen, die es braucht, um das Enzym zu entfalten, oder das Entfernen von kritischen Wassermolekülen von der Struktur verhindern. Durch den Vergleich mit Sequenzen von homologen Enzymen aus thermophilen Organismen wurden passende Aminosäurerestepositionen ausgewählt und einzeln ersetzt. Nutzbringende Mutationen wurden in einer Hauptvariante vereint und
mittels
multipler
Hauptvariante
DNS
Rekombinationen
zwischen
Elternenzyme
und
in verschiedenen Kombinationen getestet. Dadurch, wurde
schlussendlich eine PpAAR Variante identifiziert mit einer signifikant verbesserten Halbwertzeit in 40 % MeOH [bis zu 8-fach besser] und 30 % Acetonitril [ebenfalls bis zu 8-fach besser], wobei die katalytische Aktivität in wässriger Lösung beibehalten werden konnte.
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