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DISS. ETH NO. 23509
Enzyme Specificities Determine Starch Formation in Arabidopsis Leaves A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich)
presented by Kuan-Jen Lu
born on 16.11.1980 citizen of Taiwan
accepted on the recommendation of Prof. Samuel C. Zeeman (examiner) Prof. Wilhelm Gruissem (co-examiner) Prof. Alison M. Smith (co-examiner)
2016
Summary Starch is synthesized in plants and algae as semi-crystalline granules and is composed of two types of glucose polymers - amylose and amylopectin. Amylose is a long, rarely branched polysaccharide, whereas amylopectin is a relatively highly branched glucan, and constitutes around 80% of mass of most starches. While some features of starch are highly conserved, there is diversity in numerous factors, including structural features of the polymers,
polymer
composition,
starch
granule
size,
and
granule
morphology.
Consequently, the physicochemical properties of starches vary between plant sources, resulting in a wealth of applications for starch in the food- and non-food industries. To advance the use of starches, it is essential to understand how plants synthesize it, and which factors determine the form of native starch and relate this to its functional properties. My aim was to investigate the specificities of enzymes in starch biosynthesis using the model plant Arabidopsis thaliana. The first part of my work (Chapter 2) focused on analyzing starch formation from a series of mutants deficient in different combinations of the biosynthetic enzymes – starch synthases (SSs) and the isoamylase (ISA) type of debranching enzyme (DBE). Two mutant plants - ss1ss2ss3 triple mutants and isa1isa2 double mutants were crossed and mutant combinations selected from the F2 progeny. SS1, SS2, and SS3 are all starch synthases that produce certain lengths of glucan chains, while ISA1 and ISA2 form a single heteromultimeric enzyme that removes some branches to facilitate starch crystallization. Analysis of glucan amount, glucan structure and solubility, and granule morphology in these mutants collectively demonstrate that both the chain lengths and the branching patterns of amylopectin influence starch granule formation. The second part of this work (Chapter 3) investigated the functions of different branching enzyme (BE) types in starch biosynthesis. BEs transfer part of a linear, α-1,4-linked chain to itself or to a neighboring chain creating an α-1,6-linkage (i.e. a branch point). Different BE types involved in glycogen or amylopectin synthesis have distinct, albeit overlapping, specificities in vitro. To compare their roles and ability to mediate starch biosynthesis in vivo, (ach of WKH three types of BE (maize BE IIa [ZmBE2a], potato BE I [StBE1] and Escherichia coli glycogen BE [EcGLGB]) ZDV LQGLYLGXDOO\ H[SUHVVHG in an Arabidopsis mutant background (be2be3), which lacks its endogenous BEs and is therefore unable to make starch. Analysis of glucan synthesis in these lines revealed different degrees of complementation depending
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on BE type. Full complementation was achieved by expression of ZmBE2a – the enzyme most closely related to the Arabidopsis BEs. Partial complementation was observed in lines expressing StBE1, while EcGLGB expression restored only minimal amounts of starch, which was aberrant in its chain length distribution, branching pattern, and granule morphology. These data add significantly to our understanding of how BE properties influence starch production and amylopectin fine structure. Part three of my thesis (Chapter 4) investigated starch granule initiation. I expressed the reportedly self-priming glycogen synthase (GS) from Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis ss3ss4 mutant plants, which are deficient in granule initiation. This restored granule formation, although granule numbers varied significantly between individual chloroplasts and granule morphology was abnormal. I conclude that GS indeed promotes granule initiation, but is not capable of fulfilling all the functions of SS3 and SS4. Finally, in Chapter 5, I extended the work on starch granule initiation using the ss4 single mutant, which rarely produces more than a single starch granule per chloroplast. I transformed ss4 with constructs encoding SS4 variants or fusion proteins between A. tumefaciens GS and the non-catalytic N-terminal region of SS4 VHSDUDWHO\. Observing granule formation in each line revealed that the catalytic C-terminal region of SS4 alone simply promotes the initiation of aberrant granules in a similar way to the GS. However, my data also showV that WKH N-terminal region of SS4 is critical LQ determining starch granule morphology as normal granules were produced when it was fused to GS.
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Summary in German (Zusammenfassung) Stärke wird von Pflanzen und Algen in Form von semi-kristallinen Körnern synthetisiert. Sie besteht aus zweierlei Glukosepolymeren - Amylose und Amlyopektin. Während Amylose ein langkettiges, kaum verzweigtes Polysaccharid darstellt, ist Amylopektin relativ stark verzweigt und bildet rund 80% der Masse der meisten Stärkesorten. Einige Merkmale von Stärke treffen auf viele Sorten zu; andere hingegen variieren beträchtlich, beispielsweise die Molekülstrukturen von Amylopektin, der Anteil an Amylose und die Grösse und Morphologie der Körner. In Folge unterscheiden sich Stärkesorten je nach pflanzlichem Ursprung in ihrem physikalisch-chemischem Verhalten und können in zahlreichen industriellen Bereichen eingesetzt werden. Um die Nutzung von Stärke weiter auszuweiten, ist es von entscheidender Bedeutung zu verstehen, wie sie genau in Pflanzen synthetisiert wird, welche Faktoren die Stärkestruktur bedingen und wie sich diese letztlich auf ihre Funktionalität auswirken. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Spezifitäten von stärkeherstellenden Enzymen mithilfe der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu studieren. Der erste Teil (2. Kapitel) behandelte dies anhand einer Serie an Pflanzenlinien, in denen unterschiedliche Kombinationen
von
Enzymen
mutiert
sind
-
Stärkesynthasen
(SS)
und
das
Entzweigungsenzym Isoamylase (ISA). Dafür wurden zunächst zwei mutierte Pflanzen der Genotypen ss1ss2ss3 und isa1isa2 miteinander gekreuzt und die gewünschten multiplen Mutanten aus der F2-Generation isoliert. Die Stärkesynthasen SS1, SS2 und SS3 produzieren Zuckerketten unterschiedlicher Längen, während ISA1 und ISA2 zusammen ein Enzym bilden, das bestimmte Ketten entfernt, um die Kristallisation von Stärke zu erleichtern. Durch die Analyse der Menge, Struktur, Form und Löslichkeit der in den Linien produzierten Polysaccharide konnte ich dann zeigen, dass sowohl die Länge als auch das Verzweigungsmuster
der
Amylopektinketten
die
Ausbildung
von
Stärkekörnern
massgeblich beeinflussen. Im zweiten Teil dieser Arbeit (3. Kapitel) wurden die Funktionen von verschiedenen Verzweigungsenzymen (branching enzymes, BEs) untersucht. BEs übertragen Teile einer Kette auf dieselbe oder eine andere Kette, wobei sie Verzweigungen bilden. Im Reagenzglas weisen verschiedene BE-Klassen unterschiedliche, wenngleich teils überlappende
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Spezifitäten auf. Um die Wirkungsweisen der BE-Klassen auch in der Pflanzenzelle zu vergleichen, habe ich von jeder Klasse ein Verzweigungsenzym in einer ArabidopsisMutante exprimiert - diese Mutante besitzt keine eigenen Verzweigungsenzyme (Genotyp be2be3) und kann folglich keine Stärke mehr herstellen. Es zeigten sich drei verschiedene Komplementierungsgrade: Expression von BE2a aus Mais (welches die grösste Ähnlichkeit zu den entsprechenden Arabidopsis-Enzymen besitzt) konnte den Phänotyp vollständig komplementieren, das heisst, es erlaubte die Synthese von normalen Stärkekörnen; BE1 aus Kartoffel komplementierte teilweise, während das Enzym aus dem Bakterium Escherichia coli (EcGLGB) nur zu geringfügiger Stärkesynthese führte. In letzterem Fall war die Stärke war zudem hinsichtlich Molekülstruktur und Kornmorphologie stark verändert. Diese Ergebnisse verbessern unser Verständnis über die Rolle von Verzweigungsenzymen erheblich; insbesondere klären sie, wie die Spezifitäten dieser Enzyme die Stärkesynthese und Amylopektinstruktur beeinflussen. Der dritte Teil meiner Dissertation (4. Kapitel) behandelte die Initiierung der Stärkebildung. Dazu wurde die Glykogensynthase (GS) aus Agrobakterium tumefaciens in einer Arabidopsis-Mutante exprimiert, die selbst keine Körner mehr initiieren kann (Genotyp ss3ss4). GS kann bekanntermassen die Polysaccharidsynthese selbst starten. In der Tat ermöglichte die Präsenz dieses Enzymes auch die Stärkesynthese in der ArabidopsisMutante, obwohl die Anzahl von Stärkekörnern von Chloroplast zu Chloroplast schwankte und die Kornmorphologie abnormal war. Daraus schliesse ich, dass GS zwar die Initiierung von Stärkekörnern fördert, aber nicht alle Funktionen von SS3 und SS4 ersetzen kann. Dieser Aspekt wurde im 5. Kapitel noch vertieft, hier unter Verwendung einer ArabidopsisLinie, die im SS4-Gen mutiert ist und deshalb nur in wenigen Chloroplasten mehr als ein Stärkekorn produziert. In diesen Pflanzen habe ich verschiedene Variationen von SS4 und Fusionsprodukte aus GS (aus Agrobacterium) und der nichtkatalysierenden N-terminalen Region von SS4 exprimiert. Die Untersuchung der Stärkekornbildung in den verschiedenen Pflanzenlinien zeigte, dass die katalysierende C-terminale Hälfte von SS4 ebenso wie GS zur Ausbildung von abnormalen Körnern führt. Meine Daten deuten darauf hin, dass die Nterminale Region von SS4 die Morphologie von Stärkekörnern bestimmt, da diese Region als Fusionsprodukt mit GS zur Synthese von normalen Körnern führte.
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