Evolution Iii

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Wiederholung Praktikum 1/2 Typische Anwendungen für Dotplots Vergleich einer Sequenz gegen sich selbst: – Wiederholungen von Domänen – Wiederholungen von Motiven (motifs) (low complexity) – Gespiegelte Regionen (Palindrome) in Nukleinsäuren Praktikum 1 BLAST ANFRAGE (QUERY) DATENBANK Nukleotid Protein Nukleotid blastn, tblastx tblastn Protein blastx blastp Praktikum 1 Globales vs. Lokales Alignment Ein globales Alignment überdeckt die gesamte Länge der betroffenen Sequenzen → Der Needleman-Wunsch-Algorithmus findet das beste globale Alignment zweier Sequenzen Ein lokales Alignment überdeckt nur Teile der Sequenzen → Der Smith-Waterman-Algorithmus findet das beste lokale Alignment zweier Sequenzen  QKESGPSSSYC  | |||     | VQQESGLVRTTC Globales Alignment    ESG    |||    ESG Lokales Alignment Praktikum 2 Substitutionsmatrizen, Berechnung von Alignmentscores Welche der folgenden Distanzmatrizen ist eine Ähnlichkeitsmatrix? A T C G A 0 5 5 1 T 5 0 1 5 C 5 1 0 5 G 1 5 5 0 A T C G A 10 1 1 5 T 1 10 1 1 C 1 5 10 1 G 5 1 1 10 Berechnen Sie mit Hilfe dieser Substitutionsmatrix den Score für folgendes Alignment: TATCGGCGCG TGCAGATAAG Verwenden Sie nun als Scoringschema: Match = 0, Mismatch = 1, Gap = 5 Praktikum 2 Needleman-Wunsch Algorithmus Sequenz A: GGAATGG Sequenz B: ATG Scoring-Schema: Match = 0, Mismatch = 20, Gap = 25 Φ A T G Φ 0 25 50 75 G 25 20 45 50 G 50 45 40 45 A 75 50 65 60 A 100 75 70 85 T 125 100 75 90 G 150 125 100 75 G 175 150 125 100 ● ● Wie ist der Score des/der optimalen Alignments? Gibt es nur ein optimales Alignment? http://www.har.mrc.ac.uk/services/MPC/microarray/ Evolution von Genexpression Evolutionsbiologie II für Bachelor-/Lehramtsstudierende 22. Februar 2016 Sonja Grath [email protected] Evolutionsbiologie 2 Gesamtplan Vorlesungen/Praktika Dozent I John Parsch Molekulare Evolution II Evolutionäre Bioinformatik I Sonja Grath III Molekulare Variabilität Stephan Hutter IV Evolutionäre Bioinformatik II Sonja Grath V Evolution von Genexpression Sonja Grath VI Populationsgenetik Katharina Böndel Übersicht 1) Molekulare Grundlagen 2) Wie entstehen Genexpressionsunterschiede? 3) Wie häufig sind sie? 4) Wie können Expressionsunterschiede gemessen werden? 5) Wie wichtig ist Genexpression für adaptive Evolution? 6) 2 Beispiele (a)Genexpression in Primaten (b)Alkoholdehydrogenase in Drosophila 7) Hinweise zum Laborpraktikum Molekulare Grundlagen Ausgangspunkt: Eine Zelle Bsp. Tierzelle commons.wikimedia.org Embryonalentwicklung biokurs.de http://research.fhcrc.org/parkhurst/en/embryo.html Verschiedene Zelltypen paradoja7.com Unterschiede zwischen den Geschlechtern (sexueller Dimorphismus) → Woher kommen derartige Unterschiede? Molekulare Grundlage DNA-Sequenz? Beispiel: ♂ und ♀ teilen über 99.8% ihrer Genome! (siehe auch Vorlesung 1) → Gen-Expression Zentrales „Dogma“ der Molekularbiologie (Francis Crick – 1958, 1970) Transkription DNA Translation RNA 4 Nukleotide: 4 Nukleotide: A, C, G, T A, C, G, U ATGGTAGCT… AUGGUAGCU… Genetischer Code Nicht-überlappend, degeneriert 43 = 64 Triplets/Codons (inkl. START/STOP) AUG GUA GCU … UAA Start Val Ala … STOP Protein Protein 20 Aminosäuren (as) Genexpression Genregulation Chen and Rajewsky Nature Reviews Genetics 8, 93–103 (February 2007) | doi:10.1038/nrg1990 Wie entstehen Expressionsunterschiede? cis vs. trans cis Änderung in der regulatorischen Sequenz (Promoter oder Enhancer des Zielgens) trans Änderung in einem anderen, nicht verbundenen Gen (z.B. Transkriptionsfaktoren), welche die Genexpression des Zielgens beeinflusst Cheung & Spielman, 2009 → Wie können wir diese beiden Möglichkeiten unterscheiden? Evolutionary changes in cis and trans gene regulation Wittkopp et al. (2004) Kreuzung: ♂/♀ D. melanogaster ➔ ♂/♀ x D. simulans Vergleich der Expressionsstärken in Genen der Eltern und der F1Hybriden Methode: Pyrosequenzierung ● ● Sehr sensitiv Expression von 2 Allelen in einem heterozygoten Individuum kann unterschieden werden Evolutionary changes in cis and trans gene regulation Wittkopp et al. (2004) Erwartung: cis Beide Allele sollten unterschiedlich transkribiert werden in den Hybriden und den Expressionsunterschieden zwischen den Eltern entsprechen trans Beide Allele sollten gleich exprimiert werden in den Hybriden (→ gleicher Pool an Transkriptionsfaktoren) Ergebnis: Test von 29 Genen mit unterschiedlicher Expression zwischen den beiden parentalen Arten ● ● 28 (97%) zeigten Expressionsunterschiede in den Hybriden (cis) Für 50% dieser Gene waren diese Unterschiede ausschließlich durch cis-Änderungen erklärbar Evolutionary changes in cis and trans gene regulation Wittkopp et al. (2004) Expression quantitative trait loci (eQTL) ● ● ● Zusammenhang zwischen DNA-Polymorphismen und Expressionsunterschieden Kombination von Transkriptomdaten und Genotyping SNPs (= Single Nucleotide Polymorphisms), welche mit Genexpression korrelieren, heißen eQTL Wolen & Miles, 2012 Wie häufig sind Expressionsunterschiede? Bsp.: Geschlechtsspezifische Genexpression Wie viele geschlechtsspezifische Gene gibt es? Absolute Anzahl hängt von verschiedenen Faktoren ab: ➔ Art und Gewebe ➔ Experimentelle Methode ➔ Grad der Replikation ➔ Statistische Kriterien zur Definition von Expressionsunterschieden In jedem Fall: Anzahl nicht unbedeutend! Beispiele: D. melanogaster, ganze Fliegen: ~57% der Gene zeigen geschlechtsspezifische Expression → Mehrheit: exprimiert in reproduktiven Geweben (Ovarien, Hoden) M. musculus, somatische Gewebe (Yang et al. 2006): > 10,000 Gene mit geschlechtsspezifischer Expression Ursprung geschlechtsspezifischer Gene ➔ ➔ ➔ ➔ ➔ ➔ ➔ Sexueller Antagonismus an einem Lokus Sexueller Antagonismus + Genduplikation Duplikation geschlechtsspezifischer Gene Retrotransposition de novo Tandem-Duplikation 'Zufall' Gene duplication Fitness trade-offs: sexually antagonistic mutation en.wikipedia.org Ellegren & Parsch, 2007 Gen-Duplikation und die Entstehung eines neuen geschlechtsspezifischen Genes Beispiel: janus/ocnus Ellegren & Parsch (2007) Wie können Expressionsunterschiede gemessen werden? Methodenübersicht 2 Möglichkeiten: 1) Quantifizierung der Menge an mRNA Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) Northern Blots Microarrays Next-Generation-Sequencing (RNA-Seq) 2) Quantifizierung der Proteinmenge Immunologische Verfahren (z.B. Western Blot) Massenspektrometrie Photometrische Messungen (z.B. Bradford, Lowry) ➔ Laborpraktikum Quantifizierung der Menge an mRNA Microarrays Beispiel: Geschlechtsspezifische Expression ♂ Sample 1 ♀ Sample 2 Quantifizierung der Menge an mRNA Next-Generation Sequencing MacLean et al., 2009 Ein typisches RNA-Seq Experiment 2 Schritte: a) Gewinnung der Daten b) Analyse der Daten Martin & Wang, 2011 Vergleich Microarray – RNA-Seq wikipedia Harrison et al. (2011) Quantifizierung der Proteinmenge Lowry Protein Assay labome.com ● ● ● ● Cu2+-Ionen bilden mit Peptidbindungen einen quadratisch-planaren, blauvioletten Komplex Reduktion der Cu2+-Ionen durch bestimmte AS-Reste (v.a. Tyr und Trp) Cu2+-Ionen dienen als Reduktionsmittel für Molybdän- und Wolframat-Ionen (enthalten im Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagens, kurz: Folin-Phenol) Entstehendes Molybdänblau kann im Photometer bei 750nm gemessen werden Beispiel: Messung Gesamtproteinmenge in Drosophila ➔siehe Praktikum – Experiment 1 Wie wichtig sind Unterschiede in Genexpression für adaptive Evolution? Evolution eines Phänotyps „Phänotypen werden durch Gene bestimmt und daher wird die Mehrzahl vererbbarer Änderungen in Phänotypen durch Änderungen in der DNA der Gene verursacht.“ Ist das wirklich so? Zu einfach? Komplexer Zusammenhang zwischen Gen und Phänotyp: Verschiedene Arten von Molekülen, Signalen, Interaktionen... Phänotypischer Evolution liegen viele Mechanismen zugrunde Strukturelle Veränderungen: Veränderungen in der kodierenden DNA-Sequenz Regulatorische Veränderungen: Veränderungen in der Menge des produzierten Proteins Veränderung in Expression kann zu phänotypischen Unterschieden und Adaption führen Fellfarbe in Sandmäusen The developmental role of agouti in color pattern evolution Manceau et al., Science 2011; 331:1062-5 Pigmentierung in Drosophila Schnabelform in Darwin-Finken Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population Rebeiz et al., Science 2009; 326:1663-7 The calmodulin pathway and evolution of elongated beak morphology in Darwin's finches Abzhanov et al., Nature 2006; 442:563-7 Veränderung in Expression kann zu phänotypischen Unterschieden und Adaption führen Bisher: Änderungen im Phänotyp durch Änderung der Genexpression eines einzigen Lokus mit großem Effekt (QTL-Analysen, candidate gene approaches) → Was ist mit komplexen Phänotypen? Beispiel: Verschiedene Kasten in Feuerameisen Evolution of gene expression in fire ants: the effects of developemental stage, caste and species Ometto et al., Mol Biol Evol 2010; 19:1200-11 → Vergleichende Genexpressionsanalysen (comparative transcriptomics) und Modelle zur Evolution von Genexpression Neutrale oder adaptive Evolution? Harrison et al. (2011) Anwendung der neutralen Theorie genetischer Evolution (Kimura): Arten von Selektion können bestimmt werden durch die Berechnung des Verhältnisses von Expressionsvariation innerhalb und zwischen Populationen I. Variation innerhalb Populationen < Divergenz zwischen Populationen → positive Selektion II. Variation innerhalb und zwischen Populationen klein → negative Selektion III. Variation innerhalb Populationen  Divergenz zwischen Populationen → genetische Drift Genexpression in Primaten Expressionsunterschiede in Geweben zwischen Mensch und Schimpanse Khaitovich et al. (2006) Negative Selektion ist stärker für Gene, die in mehreren Geweben exprimiert werden Khaitovich et al. (2006) Positive Selektion? Alkoholdehydrogenase in Drosophila Das Adh-Gen in Drosophila ● ● ● ● ● Eines der bekanntesten und am besten untersuchten Gene in Drosophila ADH-Enzym degradiert und detoxifiziert Alkohole, z.B. Ethanol Unter den 2% der am höchsten exprimierten Gene Mehr als 500 bekannte Allele (z.B. F/SAllel) 5 annotierte Transkripte und Polypeptide Polymorphismen beeinflussen Enzymaktivität 1) Polymorphismus in der codierenden Region des Adh-Gens ● Fast/Slow-Allel: ADH-F und ADH-S ● Aminosäureunterschied im 3. Exon und Nukleotid-Position 1490: ADH-F(Threonin)/ADH-S(Lysin) ● verändert Enzymaktivität 2) Deletion in der 3'-UTR (untranslated region) des Adh-Gens ● 8-bp-Sequenz ● Deletion führt zu Erhöhung der ADH-Aktivität um den Faktor 2 ● Verändert Transkriptmenge Parsch et al., 2000 Polymorphismen beeinflussen Enzymaktivität Parsch et al., 2000 Exkurs: Codon Usage Bias Genetischer Code Codon Usage Bias Synonyme Codons werden unterschiedlich häufig verwendet Beispiel: Leucin UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG E. coli: CUG ~90% Yeast: UUG ~90% Wie kann Codon Bias erklärt werden? 1) “Neutrales Model” ● Bei Neutralität sollten alle Codons einer Familie mit gleicher Wahrscheinlichkeit genutzt werden ● Codon Bias wird erklärt durch einen Bias in der Mutation hin zu G und C Nukleotiden 2) “Selektionsmodel” ● Natürliche Selektion bevorzugt Codons, welche die Effizienz und Genauigkeit der Translation optimieren ● Anpassung an den tRNA-Pool und die häufigsten tRNAs Das Adh-Allel und die Leucin-Codon-Familie Leucin wird durch 6 Codons codiert “unpreferred codons” “preferred codons” Fall 1: Einführung von nicht-bevorzugten Codons Carlini & Stephan (2003) ● ● Einführung von nicht-bevorzugten synonymen Leu-Codons in Adh-Gen Messung der Enzymaktivität → 4 Allele: Wildtyp, 3 transgene Konstrukte mit 1, 6 bzw. 10 nicht-bevorzugten Leu-Codons Fall 2: Einführung von bevorzugten Codons Hense et al. (2010) → Erhöhte Enzymaktivität in Larven Hinweise zum Laborpraktikum Übersicht Experiment 1 – ADH-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge 3) Photometrische Messung der Enzymaktivität Experiment 2 – Bgal-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Bgal-Test Experiment 1 Alkoholdehydrogenase (ADH, E.C. 1.1.1.1) Allgemeine Reaktion: R-CH2OH + NAD+ ↔ R-CHO + NADH + H+ Beispiel: Im Praktikum: Wir verwenden als Substrat für die Oxidation Isopropanol (2-Propanol), das durch die Reaktion zu Aceton (Propanon) umgesetzt wird. Experiment 1 ADH-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge (a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA) (b) Messung der eigentlichen Proben (c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge 3) Photometrische Messung der Enzymaktivität (a) Messung der Enzymaktivität (b) Bestimmung der Regressionsgeraden (c) Berechnung der ADH-Enzymaktivität Erklärung im Praktikum → Die Messung der ADH-Aktivität ist eine quantitative Messung Experiment 1 ADH-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge (a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA) Beispiel: BSA BSA (mg/ml) Extinktion BSA 0 0 0 5 0,0125 0,067 0,35 10 0,025 0,194 0,30 15 0,0375 0,292 20 0,05 0,347 25 0,0625 0,39 BSA-Eichkurve 0,45 Extinktion BSA 0,40 f(x) = 6,6x + 0,01 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 BSA (mg/ml) 0,05 0,06 0,07 Experiment 1 ADH-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge (a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA) (b) Messung der eigentlichen Proben (c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge Beispiel: Proben Extinktion Proteinmenge der verdünnten Proben Gesamtproteinmenge (-) 0,264 0,039 0,777 (+) 0,563 0,083 1,658 S 0,327 0,048 0,962 S-Δ 0,372 0,055 1,096 F 0,344 0,051 1,014 F-Δ 0,323 0,048 0,952 Experiment 1 ADH-Aktivität in Drosophila 1) Proteinextraktion 2) Photometrische Messung der Gesamtproteinmenge (a) Eichkurve mit Bovine Serum Albumin (BSA) (b) Messung der eigentlichen Proben (c) Berechnung und Darstellung der Gesamtproteinmenge Beispiel: Gesamtproteinmenge 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 (-) (+) S S-Δ F F-Δ Experiment 2 β-Galaktosidase (Bgal, E.C. 3.2.1.23) Allgemeine Reaktion: Katalyse der Hydrolyse von β-Galaktosiden in Monosaccharide Beispiel: Hydrolyse von o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid (ONPG, farblos) in Galaktose und o-Nitrophenol (gelb) Experiment 2 β-Galaktosidase in Drosophila β-Galaktosidase kommt in Drosophila nicht natürlich vor! →Kann mit transgenen Methoden in Drosophila eingebracht werden und ist dort ein wichtiges Reporter-Gen Das lac-Operon in Escherichia coli: Experiment 2 β-Galaktosidase-Assay (-)-Kontrolle (+)-Kontrolle farblos ? Gelbfärbung → Die Messung der ADH-Aktivität ist eine qualitative Messung