Expression Therapeutischer Proteine In Bakteriellen Systemen

Transcript

Expression therapeutischer Proteine  in bakteriellen Systemen Dr. Klaus Eisele klaus.eisele@uni‐ulm.de Gentechnisch hergestellte Proteine als mikrobielle Produkte  Herstellung in Escherichia coli u . a. Bakterien  Protein  Anwendung  Interferon  Insulin  Wachstumshormone  Urokinase Parathyroid‐Hormon  Interleukin‐2  Influenza‐Virus  Cytomegalovirus MKS‐Virus  Antivirale Substanz  Diabetes‐Behandlung  Wachstumsdefekte Blutgerinnungs‐Probleme Calcium‐Regulation  T‐Zellen‐Wachstumsförderung Impfstoff Impfstoff Impfstoff Und noch viele weitere…. Bakterielle Proteinexpression: Was spricht für E.coli? • • • • Einfaches System (Klonierung, Transformation, Kultivierung) Kostengünstig Schnelles Wachstum Hochzelldichtekultivierung möglich Was spricht gegen E.coli? • Keine posttranslationale Modifikation (N‐ oder O‐Glycosylierung…) • Cytoplasmatisch ‐S—S‐ Brücken nur teilweise ausgebildet ( Periplasma) • Ausbildung von „inclusion bodies“* *inclusion bodies:  sind kleine Partikel im Inneren von Zellen  bestehen aus Ansammlungen von zumeist fehlerhaft oder unvollständig gefalteten Proteinen Entstehen oft bei exzessiver Proteinsynthese Bildung kann auch gezielt angeregt und das entstandene Protein industriell weiterverwertet werden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Plasmid origin of replication Origin of replication (ORI)  Definiert die Kopienzahl des Plasmids in der Zelle Low copy : Medium copy High copy 10 ‐ 12   Kopien (p15A) 15 ‐ 20   Kopien (pBR322) 500 – 700 Kopien (pUC 19) Ein Plasmid kann verschiedene ORI´s tragen:  Konventioneller ORI:  steuert die Kopienzahl in der Zelle  f1 origin: führt unter bestimmten Bedingungen zur Produktion von  einzelsträngiger Vektor‐DNA  effektivere Produktion Nicht alle ORI´s sind miteinander kompatibel da sie unterschiedlich stabil in E. coli  repliziert werden. Gefahr des Verlusts der Geninformation. Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Plasmid Resistenzmarker Resistenzmarker wird zur Selektion benötigt sorgt für permanente Nutzung und Replikation der Plasmid‐DNA Ampicillin‐Resistenz (ampR) Vermittelt durch ß‐Lactamase (bla‐Gen)  Hydrolyse des ß‐Lactamrings Vorsicht bei dichten Kulturen Gefahr der Übersäuerung des Mediums Kanamycin‐Resistenz Inaktivierung durch Aminoglycosid‐Phosphotransferase im Periplasma  Nur bei Gram negativen Bakterien gut Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Plasmid multiple clonig site Der Promotor • Proteinüberproduktion erfordert einen starken Promotor • möglichst geringe basale Transkription („dichter“ Promotor)  wichtig bei toxischen Proteinen, um toxischer Selektion des  Expressionsplasmids vorzubeugen • Induzierbar um den Promotor für die Transkription zu „öffnen“ Häufigster Induktor ist IPTG (Isopropyl‐ß‐D‐thiogalactopyranosid) IPTG: Induktor des lac‐Operons,  bindet an den Lac I‐Repressor(lacI Genprodukt). allosterische Konformationsänderung des Repressors,  die seine Wechselwirkung mit dem lac Operator inhibiert. Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Plasmid MCS Ribosomenbindestelle (RBS) Shine‐Dalgarn‐Sequenz: Effizienz der Translationsinitiation wird erhöht durch: Sequenz der RBS Initiationscodon  ATG ist besser als GTG Folgecodon A/T‐reiche Codons sind vorteilhaft Terminator für die RNA‐Polymerase Terminator‐Loop erhöht die Stabilität der m‐RNA gegen Abbau durch RNAse sollte nach der MCS im Vector vorhanden sein Die multiple cloning site: T7  Promotor spezifisch für T7‐RNA‐Polymerase lacO  lac operator region blockiert nachfolgende Gene RBS  Ribosomenbindestelle ATG  modifiziertes Startcodon 6xHis  TagI zur Reinigung Xpress epitop TagII zur Reinigung EK  Protease Schnittstelle zur Entfernung der Tags Schnittstellen  Einfügen des Inserts (gerichtet) T7 terminator  Hairpin am Ende der m‐RNA lacI = Überproduktion des lac  Repressorproteins um den  Operator lacO zu blocken bis zur Induktion Resistenzgen gegen  Antibiotikum pET‐Vector mit  allen Elementen Zwei origins of replication: f1 origin ermöglicht die Produktion von  single stranded vector bei geeigneten Bedingungen pBR322 ori der konventionelle ORI  unter Kontrolle von rop  20 copies/cell Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Bakterium genetische Eigenschaften E. coli BL 21 (DE 3): E.coli BL 21:  • Restriktions‐defizienter Stamm  keine Restriktionsendonucleasen, d.h. eingebrachte Fremd‐DNA bleibt  erhalten E. coli B‐Stamm mit DE3:  • enthält im Genom ein DNA Fragment des Bakteriophagen λ.  • Fragment codiert für die T7‐RNA‐Polymerase  und  • den vorgeschalteten Lac I‐Repressor • Transformierte Plasmide die unter Kontrolle des T7‐Promotors stehen sind  solange reprimiert bis der Induktor (IPTG)  zugegeben wird.  !! in unserem Fall doppelte Repression !!  Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Bakterium genetische Eigenschaften Verringerung des Proteinabbaus während der Expression lon :  keine Lon‐Protease  reduziert den Proteinabbau im Cytosol ompT : Mutation von Protease VII (Membranprotein der äusseren Membran)  reduziert Proteolyse von Sekrteierten Proteinen Verbesserung der Induktion gal : Defizient im Galaktose Metabolismus  Vorteil: zugegebener Induktor IPTG bleibt erhalten  Nachteil: kein gesteuertes “Induktionsniveau” Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Induktion Start der Proteinsynthese Induktion durch Zugabe von IPTG: IPTG bindet an  Lac I Protein  Repressor dissoziiert T7‐Polymerase wird transkribiert/translatiert  T7‐Polymerase bindet an den T7‐Promotor Nach IPTG‐Zugabe beginnt die Bildung von T7‐Polymerase (Genom) und die MCS des Plasmids wird freigegeben  Bildung der m‐RNA T7‐RNA‐Polymerase: 230 Basen/sec E. coli RNA‐Polymerase:  50 Basen/sec  Große Mengen m‐RNA führen zu entsprechender Bildung von Protein Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Bakterium: Sekretion Sekretion: lösliche Proteine sollten optimalerweise aus dem Bakterium heraus transportiert  werden: • Geschieht über ein Sekretions‐System (E. coli Sec‐System) hierfür werden spezielle Peptid‐Signalsequenzen benötigt (Sec‐Signal) • Sec‐B bindet an das neu synthetisierte Protein   verhindert vorzeitige Faltung • Sec‐A (ATP‐Hydrolase) erkennt die Signalsequenz und schleust das  Protein durch den Translokator‐Komplex SecY, SecG, SecE aus dem  Cytoplasma Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression: Das Bakterium: Sekretion inclusion bodies Mangelnde Sekretion oder toxische Proteine führen dazu, dass die exprimierten Proteine in Einschlußkörperchen (inclusion bodies) eingekapselt werden Inclusion Bodies: • Ansammlung von Protein in der Zelle • meist nicht sekretiertes oder missgefaltetes Protein • häufig bei viraler Infektion Vermeidung: • geringere Wachstumstemperatur • gleichzeitige Überproduktion von Chaperonen • gleichzeitige Überexpression von seltenen tRNAs • Produktion von Fusionsproteinen • Rückfaltung von inclusion bodies Gewinnung exprimierter Proteine aus der Lösung Reinigung mittels Affinitätschromatografie über einen mit dem Protein exprimierten Tag