Gentechnisch Veränderte Pflanzen: Warum Wird Europa Vom

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Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät Neue Methoden der Pflanzenzüchtung zur Selektion und gezielten Veränderung von Nutzpflanzen Christian Jung 6. Agrarwissenschaftliches Symposium, 24. September 2015 , Innovative Biomasse-Erzeugung , Herausforderungen und Perspektiven, Weihenstephan Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung Die Anwendung biotechnologischer Methoden in der Pflanzenzüchtung Erhöhung des Selektionserfolges Marker-gestützte Selektion, genomic selection Verkürzung der Züchtungsphase DH-Produktion, in vitro Vermehrung Genetisch veränderte Pflanzen Gentechnisch veränderte Pflanzen • de facto • de jure Erweiterung der genetischen Variabilität embryo rescue Somatische Fusion Artbastardierung allele mining Pflanzengenetische Ressourcen Zell- und Gewebekultur Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Mutationsauslösung, genome editing Biostatistik, Bioinformatik, Genomforschung Gentechnik, Genetik, Molekularbiologie Größenvariation pflanzlicher Chromosomen 10µm Photo: Thomas Schmidt Alle diploiden Pflanzen besitzen eine ähnliche Anzahl von Genen (25.000 – 35.000), unterscheiden sich aber im Anteil der repetitiven DNA des Genoms (bis 95%). Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Stadien der strukturellen Genomanalyse Kerngenom Chromosom genetische Karte Physische Karte aus largeinsert Klonen (BAC-contigs) DNA-Sequenz ......AGCAGATTT AGACGTAGAT TGCAGATGAC AGTAGACGGA TAGACGGATG CGGTGATGAC GTGTGGGGTG ACGGTGAGTG TTTATGTGAGG GTCGTGAGTG GCGAGGGTGC AGTTGGGTCG TGGTGAAAAC GTGTGACTGA TGCTGATGCT GACGTTGACG TAAGTTTGA..... 109 108 Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel 107 106 105 104 103 Bp Marker-gestützte Selektion vs. Genomische Selektion Marker-gestützte Selektion: • wenige Marker • Einzelne Gene Genomische Selektion: • sehr viele Marker • Viele (alle) Gene, die an der Ausprägung eines Merkmals beteiligt sind (quantitative trait loci, QTL) Marker Gene, QTL Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Hochdurchsatz-Genotypisierungen als Voraussetzung für die genomische Selektion Microarray Technologie: Hundertausende oder Millionen Sequenzen auf einem Chip (Whole genome DNA chip array) Next generation sequencing Technologie: bis zu 300 Milliarden Nukleotide/Lauf (1 Woche) • SNP Detektion • Mapping by sequencing: Kartierung von crossover in spaltenden Populationen http://www.liv. ac.uk/lmf/ Affymetrix.com DNA SNP array Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Illumina hiseq Zwei Schritte führten zur Steigerung des Fruchtgewichtes bei Tomaten PIM: S. pimpinellifolium (wild ancestor) CER: S. lycopersicum var. cerasiforme (cherry tomato) BIG: S.Plant lycopersicum (big-fruited tomato) Christian Jung, Breeding Institute, University of Kiel Lin T, et al. (2014) Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding. Nature Genetics 46 (11):1220-1226. Die Möglichkeiten zur gentechnischen Veränderung von Nutzpflanzen sind in den letzten Jahren stark erweitert worden Die traditionelle Sichtweise gentechnisch veränderter Pflanzen: Transformation Spendergen Erweiterungen und Abwandlungen: • Cisgene Pflanzen • Ektopische Regulation endogener Gene • Genome editing Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Methoden zur Mutagenese pflanzlicher Gene • Zufällige Mutagenese durch – Bestrahlung – Chemische Substanzen • Insertionsmutagenese • Genome editing Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Zahlreich, ungerichtet, spontan Ortsspezifisch, gezielt auf eine Sequenz hin gerichtet 9 Genome editing, targeted genome modification • Einzelnukleotid-Mutation: – Betrifft ein Gen, welches Bestandteil des Genoms ist oder – gleichzeitig mehrere Gene, wenn diese über ein hohes Maß an Sequenzhomologie verfügen (Genfamilien) – Punktmutation (ein bis wenige Nukleotide), frame shift Mutation • Einfügen von Insertionen in einem bestimmten Sequenzabschnitt durch homologe Rekombination (gene replacement) • Deletion größerer Chromosomen-Fragmente – Gleichzeitiger Einsatz von zwei sgRNAs • Veränderte Genexpression • Routine für Reis, Mais, Soja Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel 10 Präzises genome editing und ortsspezifische Mutagenese ortsspezifische Rekombinase (künstliche Restriktionsenzyme) zur Erzeugung von Doppelstrangbrüchen (DSB) Führt zur Stimulation des zellulären DNA Reparatursystems: DSBs werden beseitigt durch • homologe Rekombination (Resultat ist eine de jure gentechnisch veränderte Pflanze) oder durch die • fehleranfällige Verknüpfung nicht-homologer Enden (non-homologous end joining NHEJ) Zinkfinger Nukleasen (ZFNs) • Fusion einer Zinkfinger DNA-Bindedomäne mit der FokI Endonuklease • Zinkfinger DNA-Bindedomäne kann gentechnisch so verändert werden, dass eine bestimmte Zielseqauenz im Genom angesteuert wird (je 3 Bp, die miteinander verknüpft werden können, so dass bis zu 18 Bp lange Sequenzen gebunden werden) • Zwei Gene müssen in die Zelle eingebracht werden (mit oder ohne Insertions-DNA) Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) • Künstliche Restriktionsenzyme nach Fusion der TAL Effektor DNA-Bindedomäne mit der FokI Endonuklease homing endonucleases (oder meganucleases) Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) Methoden, um die ortsspezifische Rekombinase in die Pflanzenzelle einzubringen: • Agroinfiltration • virale Vektoren • Agrobacterium vermittelter Transfer, üblicherweise in einem Expressionsplasmid, mit oder ohne Sequenz oder zuof Kiel inserierender DNA Christiantemplate Jung, Plant Breeding Institute, University Gezielte Modifikationen mit Designer Endonukleasen Erkennungssequenzen Endonuklease 1. Deletion Results of Zinc Finger Nuclease treatment of a specific gene sequence 2. Insertion Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Ortsspezifische Mutagenese mit dem CRISPR-Cas System CRISPR-Cas System: Immunabwehr von Bakterien gegen fremde DNA (Viren, Plasmide) • CRISPRs: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats • Cas: CRISPR associated RNA-guided DNA endonuclease (üblicherweise Endonuklease Cas9) • sgRNA: single guide RNA (Fusion aus crRNA und tracrRNA), gentechnisch modifiziert, bindet spezifisch an eine Zielsequenz Protospacer: transcribed sequences from the invading DNA PAM: protospacer adjacent motif (2-5 bp) crRNA: CRISPR RNAs tracrRNA: transactivating CRISPR RNA Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Jinek et al (2012): Science 337:816-821 Genome editing with crops Species technique Rice TALENs Rice Rice TALENs TALENs Maize Target gene Purpose/phenotype knockout TALENs OsBADH2 encoding betaine aldehyde dehydrogenase CAO1 Disease resistance gene OsSWEET14 IPK1, herbicide resistance Maize meganuclease MS26 Male sterility Soybean TALENs Fatty acid desaturase 2 (FAD2) Gene insertion High oleic acid, low linoleic acid b-ketoacyl-ACP synthase II (KASII) Inositol oxygenase and phytoene desaturase genes TaMLO Altered gene regulation Cotton branching pattern bacterial blight resistance Reduced phytate content, herbicide resistance, homologous recombination to simultaneously deliver the herbicide resistance gene and knock out the phytate synthase gene Herbicide resistance Rapeseed Zinc finger nucleases Wheat CRISPR/Cas9 Wheat CRISPR/Cas9 Sorghum CRISPR/Cas9 Proof of concept Barley TALENs Tomato TALENs PROCERA Proof of concept, haploid barley cells manipulated to produce DH barley gibberellic acid metabolism Tomato CRISPR/Cas9 ARGONAUTE7 Leaf shape Potato, apple Orange Zinc finger nucleases CRISPR/Cas9 Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Broad spectrum resistance to powdery mildew, Simultaneous targeting different homoeoalleles Proof of concept phytoene desaturase (September 2015) 14 Züchtung von nachwachsenden Rohstoffen für die Biomasseerzeugung Biomasse: • Festbrennstoffe aus Lignocellulose (perennierende Pflanzen und schnell wachsende Baumarten wie Miscanthus sinensis, Chinaschilf, Pappeln, Weiden) • zucker-, stärke- oder ölhaltige Pflanzen (z. B. Zuckerrüben, Kartoffeln, Raps) zur Erzeugung pflanzlicher Kraftstoffe (z. B. Ethanol, Pflanzenöl, Pflanzenölmethylester) • Überführung von Lignozellulose-Biomasse in Ethanol • gasförmige Energieträger (z. B. Biogas aus Gülle) zur Wärme- und Stromerzeugung Traditionelle Nutzung der zur Biomasseerzeugung genutzten Kulturpflanzen • Erzeugung von Nahrungs- und Futtermitteln → erfordert duale Ausrichtung der Zuchtziele • nur als Rohstoffe für die Biomasseerzeugung Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel 15 Energieversorgung – Bioenergie – Ernährung – technische Lösungen Züchterische Aktivitäten von nachwachsenden Rohstoffen für die Biomasseerzeugung Quelle Nutzung Traditionelle Zuchtziele Zuchtziel für Biomasseerzeugung Raps Samenöl Ölertrag Ölertrag Getreide Bioethanol, Ganzpflanzensilage, Biogas Samenertrag, Backqualität Gesamte Biomasse, hohe alpha Amylase Aktivität Zuckerrüben Bioethanol/Biogas Bereinigter Zuckerertrag Zuckerertrag Mais Biogas (Bioethanol) Kornertrag, Biomasse, Futterqualität Methanertrag, Nutzung von Kurztagsgenen zur Züchtung spätreifender Sorten, geringer Ligningehalt Miscanthus-Hybriden, incl. Miscanthus × giganteus Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag Weiden, Pappeln, Pinien Festbrennstoff Biomasseertrag Biomasseertrag Futterqualität Biomasseertrag Luzerne Sorghum (Sorghum bicolor), Sudangras (S. sudanense) Bioethanol/Biogas Kornertrag Biomasseertrag, Veränderung des Gehaltes an Komponenten der Zellwand (Zellulose, Hemicellulose, Lignin) Deutsches Weidelgras (Lolium perenne) Biogas Futterqualität Methanertrag Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Energiemaiszüchtung • • Reife verzögern: Kurztaggene aus exotischen Populationen integrieren Kältetoleranz in spätes Zuchtmaterial einlagern Silomais Energiemais Methanbildung Minimal im Pansen Maximal im Fermenter Verweildauer ½ Tag 30 – 40 Tage Stärkegehalt Hoch > 32 % ausgereiftes Korn notwendig Nicht entscheidend TS-Gehalt 30- 35 % zur max. Futteraufnahme 25 – 30 % zur Vermeidung von Sickersaft Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel GGP Bonn, W. Schmidt (KWS SAAT AG) Die pflanzliche Zellwand: Ein Forschungsobjekt für die Bioenergieerzeugung Pflanzliche Biomasse (exklusive Ernteorgane) besteht größtenteils aus Zellwandbestandteilen Ziel: Züchtung von Pflanzen mit höherem Celluloseanteil und geringerem Protein- und Ligninanteil (N-Gehalt) Ektopische Expression von Cellulose-Synthasegenen Ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. NAC- and Myb-domain-containing proteins), die die Bildung sekundärer Zellwändbestandteile initiieren Transgene Pappeln mit verringertem Ligninanteil (Energieersparnis bei Holzverarbeitung) Steigerung der Effizienz des Celluloseabbaus (Clostridium thermocellum, Trichoderma-Pilze) http://www.daviddarling.info/images/plant_cell_wall.gif Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel 18 Winterrüben, eine neuartige Kultur für die europäische Landwirtschaft Zuckerrübe: höchstes CO2 Einsparungspotential aller Pflanzen in Europa, ideal für Biogas Lagerung: Rüben für Biogas-Produktion müssen geschnitztelt werden, Lagerung als Silage, hoher Milchsäureanteil, kein Energieverlust bei Lagerung über Jahre hoher Wasseranteil (80%): großer Lagerflächenbedarf Hoher Schmutzanteil verringert Gärvolumen, höherer Maschinenverschleiß Ziel: weitere Steigerung des Zuckerertrages Winterrübenanbau mit schossresistenten Zuckerrüben Winterrübenanbau mit herkömmlichen Zuckerrüben AUTUMN WINTER AUTUMN WINTER SUMMER SPRING SUMMER SPRING Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Zwei Gene kontrollieren das Schossen bei Zuckerrüben Winterrüben Prototyp: BTC1-reprimierte transgene Pflanzen schossen nicht nach Vernalisation REC BBX19 BvFT1 BTC1d BvFT2 Interaction Activation Repression Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel A B A: Kontrollpflanze nach Vernalisation B: BTC1-RNAi transgene Pflanze nach Vernalisation Dally et al., 2014 20 Methoden zur Veränderung von Genen einer Nutzpflanze und deren rechtliche Bewertung Gentechnik-Gesetzgebung Ohne gesetzliche Regelungen • • Artbastardierung Induzierte zufällige Mutagenese Sehr viele Veränderungen Genetisch veränderte Pflanze Christian Jung, Plant Breeding Institute, University of Kiel Induzierte gezielte Mutagenese (genome editing) Eine Veränderung Gentechnisch veränderte Pflanze • • Einschleusen fremder Gene in das Genom Gezielte Veränderung endogener Gene durch Gentransfer Eine Veränderung Gentechnisch veränderte Pflanze