Lecture 3 Principles Of Tem Image Formation Peter

Transcript

10/21/2015 Lecture 3 Principles of Peter Rosenthal TEM Image Formation (Francis Crick Institute) • • • • • • • Electron Optics Electron‐Specimen Interactions Amplitude and Phase Objects Zernike Phase Plate Lens Aberrations Defocused Phase Contrast In‐focus Phase Contrast in Cryo EM I I n  d sin  EMBO Course on Image Process for Cryo EM Birkbeck College, London, Sept 1-11, 2015 high res Low res electron de Broglie wavelength  12.3 V Typical wavelengths for biological specimens 0.033 Å (120kV) 0.025 Å (200kV) 0.02 Å (300 kV) ~1 Å X‐ray 1 10/21/2015 Geometrical Optics FT FT SCATTERED BEAMS ARE FOCUSSED AT THE BACK FOCAL PLANE FORMING A “DIFFRACTION PATTERN” UNSCATTERRED BEAMS FOCUSSED AT SINGLE POINT “ZERO ORDER” Gun Electron Lens C1 C2 Aperture OBJ Aperture Intermediate Projector Screen 2 10/21/2015 Electron‐specimen interaction • • • • • Coulomb field: positive nucleus, negative cloud Depends on atomic properties (Z) Elastic Scattering Inelastic Scattering Atomic scattering factors Published in: E. V. Orlova; H. R. Saibil; Chem. Rev. Article ASAP Copyright © 2011 American Chemical Society Amplitude Object Amplitude Object Phase Object Phase Object 3 10/21/2015 Phase Object Approximation: electrons experience a phase shift on  passing through the projected 2D Coulomb potential of the specimen PHASE SHIFT  e i Weak Phase Object Approximation e i ( x ,y )   1 i  x, y ... e i ( x ,y )  (x, y)    (x, y, z)dz Thin biological specimens are weak phase objects • Proteins Low Z atoms (C,O,P,N) 1.35 g/cm3 • Vitreous Ice 0.92 g/cm3 The phase shift is very small, in which case: The transmitted wave is the resultant of the unscattered wave  and the second term is the scattered wave with a 90 phase  shift. We measure intensities at the image plane: 1i  x, y  1   1 2 2 No Contrast! 4 10/21/2015 Zernike Phase Plate     4  Zernike, F. How I discovered phase contrast. Science 121, 345‐9 (1955).  Zernike Phase Contrast • The phase plate changes the relative length of the  optical path of the diffracted beams with respect  to the zero‐order beam (such that an extra phase • Converts phase contrast to amplitude contrast. • Possible because of separation of unscattered and  scattered waves at the back focal plane. Phase Contrast Amplitude Contrast Contrast in TEM Negative Stain Cryomicroscopy Cryo-Negative Stain 5 10/21/2015 Lens Aberrations Scattering/Aperture Contrast Negative Stain Source: Wikipedia Path Length Difference/Phase Shift Due to Lens Aberrations  Cs 4 Spherical Aberration Ray diagrams of lens aberrations: (a) perfect lens, (b) spherical, (c) chromatic, and (d) astigmatic aberration. F is the focal length of the lens. =0 is not affected! Published in: E. V. Orlova; H. R. Saibil; Chem. Rev. Article ASAP Copyright © 2011 American Chemical Society 6 10/21/2015 Defocus Phase Contrast Scatterer at focus Scatterer not at focus  F 2 Defocus =0 is not affected! Path Length Difference/Phase Shift Due to Lens Aberrations Cs 4 Phase contrast for selected X   Spherical Aberration Defocus Phase contrast for selected X   • The contrast of a spacing X of the image is  modified by the 2sin  (X) phase contrast transfer function: Erickson, H. P. The Fourier Transform of an Electron Micrograph‐First Order and Second Order Theory of  Image Formation. Advances in Optical and Electron Microscopy 5 (1973). Erickson, H. P. & Klug, A. Fourier Transform of an Electron Micrograph ‐ Effects of Defocussing and  Aberrations, and Implications for Use of Underfocus Contrast Enhancement. Berichte Der Bunsen‐ Gesellschaft Fur Physikalische Chemie 74, 1129‐& (1970). 7 10/21/2015 Contrast Transfer Function Scherzer Focus FFT of Carbon Film F1 F2 Angle of astigmatism F  F1 cos2   F 2 sin 2  Defocus choice for proteins Weak Phase/Weak Amplitude Objects  ei ( x, y)eu( x,y)   1 i  x, y ... eu( x,y) eu( x, y)  1 u(x, y) Weak Phase  1 i (x, y) 1 u(x, y) Weak Amplitude IF WE LOOK AT THE EFFECT ON THE IMAGE: Contrast Transfer Function 2sin  (X)  Q2 cos (X) 8 10/21/2015 2sin  (X)  Q2 cos  (X) The fraction (Q) of amplitude contrast for proteins in ice has been measured: Contrast Transfer Function FFT of Carbon Film F1 F2 Angle of astigmatism 5.8% at 120kV 4.8% at 200kV 2.7% at 300kV, (6.9% when using an energy filter).  Toyoshima, C. & Unwin, N. Ultramicroscopy 25, 279-91 (1988). Toyoshima, C., Yonekura, K. & Sasabe, H. Ultramicroscopy 48, 165-176 (1993). Yonekura, K., Braunfeld, M. B., Maki-Yonekura, S. & Agard, D. A. J Struct Biol 156, 524-36 (2006). 2 F 2 Cs  4 (  )  2 4 F  F1 cos2   F 2 sin 2  In‐focus Phase Contrast Electrons Boersch, S. Z. Naturforsch.  2a, 615 (1947). Unwin, P. N. Phase contrast and interference microscopy with the electron microscope. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci  261, 95‐104 (1971). Majorovits, E. et al. Optimizing phase contrast in transmission electron microscopy with an electrostatic (Boersch) phase  plate. Ultramicroscopy 107, 213‐26 (2007). Cambie, R., Downing, K. H., Typke, D., Glaeser, R. M. & Jin, J. Design of a microfabricated, two‐electrode phase‐contrast  element suitable for electron microscopy. Ultramicroscopy 107, 329‐39 (2007). Danev, R. & Nagayama, K. Transmission electron microscopy with Zernike phase plate. Ultramicroscopy 88, 243‐52  (2001). Danev, R. & Nagayama, K. Single particle analysis based on Zernike phase contrast transmission electron microscopy. J Struct Biol 161, 211-8 (2008). 9 10/21/2015 Recommended Books 1. Reimer, L. Transmission electron microscopy : physics of image formation and microanalysis  (Springer, Berlin ; New York, 1997). 2. Frank, J. Three‐dimensional electron microscopy of macromolecular assemblies :  visualization of biological molecules in their native state (Oxford University Press, Oxford ;  New York, 2006). 3. Slayter, E. M. & Slayter, H. S. Light and electron microscopy (Cambridge University Press,  Cambridge [England] ; New York, 1992). 4. Misell, D. L. Image Analysis, Enhancement and Interpretation (ed. Glauert, A. M.) (Elsevier  Science & Technology, Oxford, 1978). 5. Spence, J. C. H. High‐resolution electron microscopy (Oxford University Press, Oxford ; New  York, 2003). 6. Glaeser, R. M. Electron crystallography of biological macromolecules (Oxford University  Press, Oxford ; New York, 2007). 7. Cowley, J. M. Diffraction physics (North‐Holland ; Sole distributor for the U.S.A. and Canada  Elsevier Science Pub. Co., Amsterdam ; New York, 1984). 8. Hawkes, P. W. & Valdrè, U. Biophysical electron microscopy : basic concepts and modern  techniques (Academic Press, London ; San Diego, 1990). 10