Mikrobiologische Methoden Für Den Naturwissenschaftlichen

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Mikrobiologische Methoden für den naturwissenschaftlichen Unterricht. Arbeitsanleitung und Versuchsbeschreibungen Inhaltsverzeichnis Dieses Handbuch soll Ihnen notwendige Informationen über die Arbeitsweise mit Membranfiltern bei mikrobiologischen Untersuchungen vermitteln. Die nachfolgend beschriebenen Versuche sind nur ein kleiner Ausschnitt aus dem weiten Anwendungsbereich der Membranfiltertechnik. Wir hoffen, dass wir damit Anregungen geben und dazu beitragen, den Unterricht lebendig zu gestalten. Die Anzahl der Versuche werden wir noch erweitern und nehmen dazu auch gern Ihre Anregungen entgegen. 1. Nachweis von Mikroorganismen 3 2. Die Nährmedien 4 3. Methoden zur mikroskopischen Untersuchung 6 4. Mikrobiologisches Praktikum 9 5. Grundausrüstung für Schulversuche 10 6. Versuch 1 Nachweis von Mikroorganismen im Wasser 11 Für spezielle Fragen steht Ihnen unsere Abteilung PM Laborfiltration|Mikrobiologie zur Verfügung. 7. Versuch 2 Nachweis von Mikroorganismen in der Luft 13 Telefon 0551.308.0 oder 308.3433 8. Versuch 3 Nachweis von Mikroorganismen im Erdreich 14 9. Versuch 4 Wirkung von Antibiotika 15 10. Versuch 5 Nachweis von Hefen in der Natur 16 11. Versuch 6 Gasbildung durch alkoholische Gärung 17 12. Versuch 7 Bakterienwachstum bei unterschiedlichen Temperaturen 18 13. Allgemeine Arbeitshinweise in Bildern 19 14. Alternative Edelstahlgeräte 21 2 Nachweis von Mikroorganismen Die Mikroorganismen können durch unterschiedliche Verfahren nachgewiesen und bestimmt werden. Zum Nachweis werden kulturelle und mikroskopische Methoden, zur Differenzierung gewöhnlich biochemische und serologische Methoden angewendet. Beim kulturellen Nachweis bedient man sich flüssiger und fester Nährböden, in oder auf denen die Mikroorganismen durch Wachstum angereichert werden. Wenn im Zusammenhang mit dem Keimnachweis die Membranfiltermethode gegenüber anderen Methoden bevorzugt wird, dann vor allem dort, wo einige wenige Mikroorganismen in relativ großen Flüssigkeitsmengen nachzuweisen sind. Durch Filtration werden auf der Oberfläche eines Membranfilters Mikroorganismen abgeschieden, die größer als die gewählte Porengröße des Membranfilters sind. Das ist nur deshalb möglich, weil Membranfilter mit definierten Porengrößen gefertigt werden können. Beim Keimnachweis werden normalerweise Membranfilter mit 0,45 μm Porengröße verwendet. Das Membranfilter wird nach der Filtration dem Gerät entnommen, auf einen geeigneten Nährboden aufgelegt und nach spezifischen Bedingungen bebrütet. Die Nährstoffe diffundieren durch die Porenstruktur des Filters an die Keime heran, die sich vermehren und sichtbare Kolonien bilden. Oberflächenstruktur eines 11406 Membranfilters, 0,45 μ Porengröße. (REM Aufnahme, 6750x) Bei der Koloniezahlbestimmung, wie z.B. im Rahmen einer Wasseruntersuchung, wird durch Auszählen nur die Anzahl der Kolonien ermittelt. Um die makroskopische Auswertung, die rein optische Beurteilung der sichtbaren Kolonien, zu erleichtern, wird in bestimmten Fällen den Nährmedien ein Indikator zugesetzt, der geeignet ist, aufgrund der Stoffwechselvorgänge eine Farbstoffreaktion herbeizuführen, die typisch für bestimmte Keimarten ist (z. B. der charakteristische Metallglanz [Fuchsinglanz] von Escherichia coli auf Endo-Nährmedien). Soll die Auswertung einer Kultur über das reine Auszählen der Kolonien hinausgehen, muss in jedem Fall mit Hilfe einer Impfnadel oder Impföse Material aus einer typischen, einzeln gewachsenen Kolonie entnommen werden. Sollen mikroskopische Präparate über längere Zeit aufbewahrt werden (Dauerpräparate), kommen nur solche in Betracht, bei denen die Mikroorganismen durch geeignete Färbemethoden angefärbt wurden. Die für mikrobiologische Untersuchungen einzusetzenden Sartorius Stedim Biotech Membranfilter bestehen aus biologisch inertem Cellulosenitrat. Die Membranfilter, die zusammen mit den Nährkartonscheiben Würze, Standard und Endo zum Umfang dieses Kits gehören, sind beim Typ Würze grau und beim Typ Standard grün eingefärbt. Die Anfärbung erlaubt einen deutlichen Kontrast gegenüber den meist hell wachsenden Kolonien. Der Gitternetzaufdruck erleichtert das Auszählen dicht gewachsener Kolonien, weil ein Quadrat von 3,1 mm Kantenlänge einem 1/130 der wirksamen Filtrationsfläche entspricht. Im Abschnitt »Methoden zur mikroskopischen Untersuchung« auf der Seite 7 wird die Bereitung verschiedener Präparate ausführlich beschrieben. Mikroskopische Präparate erlauben eine erste Orientierung über Größe, Form und Beweglichkeit der Bakterien und anderer Mikroorganismen. Hier wird – wegen des schärferen Kontrastes – der mikroskopischen DunkelfeldMethode gegenüber der Hellfeld-Methode der Vorzug gegeben. Schnitt durch ein Membranfilter: a) obere Bildhälfte: Oberfläche; b) Mitte: Schnittkante; c) untere Bildhälfte: vertikaler Schnitt (REM Aufnahme 2500x) Partikelabtrennung auf einem Membranfilter (REM Aufnahme 6700x) 3 Die Nährmedien Die Nährmedien müssen genügend Feuchtigkeit, einen für das Wachstum geeigneten pH-Wert und spezifische Nährstoffe enthalten. Deshalb können auf Nährböden, die zur Züchtung von Bakterien besonders geeignet sind, Pilze nicht optimal angezüchtet werden. Das gilt auch für die Anzüchtung von Bakterien auf Nährböden für Pilze. Nährkartonscheiben Nährkartonscheiben, kurz NKS genannt, sind sterile Nährböden in Trockenform. Nach Anfeuchten mit sterilem destillierten Wasser sind sie gebrauchsfertig. Die im nachfolgenden Text am häufigsten verwendeten Nährböden sind die Standard-NKS zur Bestimmung der Koloniezahl (Gesamtkeimzahl), Würze-NKS, ein Nährboden zum Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen, Endo-NKS, ein selektiver Nährboden zum Nachweis des Indikatorkeimes Escherichia coli und coliformer Keime. Auf allgemeinen (kollektiven) Nährmedien lassen sich alle Mikroorganismen anzüchten, wobei einige Spezies nur sehr schwach wachsen. Dagegen wachsen auf speziellen (selektiven) Medien nur bestimmte Arten oder Gruppen bei gleichzeitiger Hemmung unerwünschter Gattungen. Die Nährkartonscheiben werden während des Herstellungsprozesses mit dem entsprechenden Nähmmedium getränkt, anschließend getrocknet und sterilisiert. Daher muss vor der mikrobiologischen Anwendung die zuvor entzogene Wassermenge wieder zugesetzt werden. Der Einsatz selektiver Nährböden ist dort von praktischer Bedeutung, wo nur wenige Keime in einer Überzahl dominierender Keime nachgewiesen werden sollen. Die Befeuchtung der Nährkartonscheiben ist optimal, wenn an der Randzone ein deutlicher Flüssigkeitsüberschuss sichtbar ist. Im Untersuchungsmaterial vorhandene Mikroorganismen werden durch den Siebeffekt des Membranfilters auf der Oberfläche abgeschieden. Nach dem Auflegen auf die feuchte Nährkartonscheibe findet der Austausch von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten durch das Porensystem des Membranfilters statt. Während der Bebrütung entwickeln sich Kolonien, die in ihrer Ausbildung (Form und Färbung) denen auf vergleichbaren Agarnährböden entsprechen. Nährmedien Die zur Anzüchtung von Mikroorganismen zu verwendenden Nährmedien haben unterschiedliche Zusammensetzungen. Natürliche Nährmedien wie Bierwürze, Fleischextrakt etc. und auch synthetische können kollektiv oder selektiv sein. Nährmedien können flüssig oder fest sein. Durch Zusatz eines erstarrenden Festigungsmittels (Gelatine oder Agar) wird ein flüssiges Medium zu einem festen Nährboden. Nur mit festen Nährböden ist eine quantitative Aussage möglich, weil dort einzeln wachsende Kolonien bewertet und ausgezählt werden können. Bei den von Sartorius Stedim Biotech entwickelten Nährkartonscheiben werden statt der Trägersubstanzen Gelatine oder Agar Cellulosekartonscheiben als Nährbodenträger verwendet. Bakterien bevorzugen im allgemeinen pepton- und fleischextrakthaltige Nährböden im pH-Bereich 6,8-8,0, während Hefen und Schimmelpilze zuckerhaltige Medien im pH-Bereich 2,0-6,0 bevorzugen. Feste Nährböden, Agar-Nährböden wie auch Nährkartonscheiben werden hauptsächlich im Zusammenhang mit Membranfiltern eingesetzt, weil quantitative Analysen hiermit leicht und sicher durchgeführt werden können. Die Mikroorganismen entwickeln sich auf dem bebrüteten Membranfilter zu einzeln wachsenden Kolonien, deren makroskopische und mikroskopische Beurteilung leicht möglich ist. 4 Zur Isolierung und z.B. zur morphologischen, biochemischen und serologischen Untersuchung werden die Kolonien mit einer Impfnadel vom Membranfilter abgeimpft. Ein Verdünnungsausstrich ist ebenfalls auf der Oberfläche des Membranfilters möglich. Bebrütete Membranfilter, die zur Dokumentation aufbewahrt werden sollen, können auf Vliespapier im Trockenschrank dreißig Minuten bei 70°C getrocknet werden. Hierdurch ist eine sichere Abtötung aller vegetativen Keimformen gewährleistet. Das Aufkleben der Membranfilter erfolgt mit lösungsmittelfreiem Klebstoff. Endo-Nährkartonscheiben Typ 140 53 Das Endo-Nährmedium ist ein LactoseFuchsin-Sulfit-Medium, nach dem japanischen Arzt Endo benannt und wird zum Nachweis von Escherichia coli und coliformen Bakterien in vielen Standards ausdrücklich empfohlen. Infolge des Gehaltes an Natriumsulfit und Fuchsin werden grampositive Bakterien weitgehend unterdrückt. Es findet eine Selektion zugunsten der gramnegativen Bakterien statt (E.coli und Coliforme). Lactoseabbauende coliforme Keime bilden Aldehyde und Säuren. Aldehyd wiederum setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfit-Verbindung frei, so dass die Kolonien rot gefärbt werden. Bei E.coli ist diese Reaktion so intensiv, dass Fuchsin auskristallisiert und den Kolonien einen grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. Bakterien der Art E.coli werden in großer Zahl im Darminhalt von Menschen und Tieren angetroffen. Ihr Nachweis im Wasser gilt als Zeichen einer fäkalen Verunreinigung. Stanpard-Nährkartonscheiben Typ 14055 Das Standard-Nährmedium ist ein Kollektivmedium und wegen seines reichen Nährstoffangebotes für das Anzüchten eines breiten Artenspektrums besonders geeignet. Mit einem pH-Wert von 7,2 bietet dieses Medium den meisten Bakterien optimale Wachstumsbedingungen. Es wird hauptsächlich zur Bestimmung der Koloniezahl aus Trinkwasser, Oberflächenwasser, Abwässern und ähnlichem eingesetzt. Es enthält den Indikator TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) der durch Reduktion zu Formazan die dort anwachsenden Kolonien ziegelrot färbt. Dadurch lassen sich auch sehr klein wachsende Kolonien sehr deutlich erkennen. Würze-Nährkartonscheiben Typ 14058 Das Würze-Nährmedium auf der Basis von Bierwürze ist ein bewährtes Medium zum Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen. Sein natursaurer Charakter mit einem pH-Wert von 4,4 hemmt dabei das Wachstum von Bakterien. Hefen wachsen meist als glatte, weiße oder gefärbte Kolonien. Schimmelpilze bilden samt- oder wattebauschartige Kolonien, die in der frühen Wachstumsphase weiß sind und später – nach Konidienbildung – unterschiedlich gefärbt sein können. Die in ihrer natürlichen Farbe wachsenden Kolonien bilden einen deutlichen Kontrast auf dem schwarzen Hintergrund des Membranfilters. Es handelt sich hier um das grau eingefärbte Membranfilter, 13005, das im feuchten Zustand schwarz ist und serienmäßig allen Würze-Nährkartonscheiben beigefügt ist. Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon in Röhrchen Die Nährbouillon wird zur Durchführung von Versuchen im Rahmen dieses Kits zum Anzüchten verschiedener aerob wachsender Bakterien benötigt. Die anderen coliformen Bakterien können fäkalen Ursprungs sein, sie haben aber ihren Hauptvermehrungsort im Oberflächenwasser und Abwasser. Der Nachweis im Wasser gilt als Zeichen einer entsprechenden Verunreinigung. Im Trinkwasser dürfen diese Bakterien nicht nachweisbar sein. Sie wird in verschraubbaren wiederverwendbaren Glasröhrchen in 20 ml-Mengen steril geliefert. Anmerkung zur Lagerung: Die Endo-NKS müssen immer lichtgeschützt aufbewahrt werden. Hefen und Schimmelpilze aus Rückbier E. coli und Coliforme aus Flusswasser Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon in Röhrchen Mischkultur aus Brunnenwasser 5 Methoden zur mikroskopischen Untersuchung Mikroskopische Präparate Das Lebendpräparat vermittelt ein natürliches Bild von der Form und der natürlichen Bewegung der Mikroorganismen. Zum Nachweis der Beweglichkeit der Bakterien bedient man sich der Dunkelfeld-Methode. Dabei wird ein starker Kontrast erreicht. Das direkte Licht wird abgeblendet, zerstreutes Licht fällt an den Seiten des Kondensors ein. Im dunklen Beobachtungsfeld leuchten die seitlich angestrahlten Objekte (Bakterien und Verunreinigungen) hell auf. Im Hellfeld werden die Bakterien sichtbar, weil das Durchlicht an und in ihnen anders gebrochen wird als in der Untersuchungsflüssigkeit. Im Blickfeld erscheinen sie als graue oder dunkle Objekte. Anfertigen eines einfachen Präparates Auf den gereinigten Objektträger wird ein Wassertropfen aufgebracht. Die Impföse wird durch Ausglühen in der Bunsenbrennerflamme sterilisiert. Das Untersuchungsmaterial wird mit der abgekühlten Impföse in den Wassertropfen getupft und das Deckglas aufgelegt. Ein so gewonnenes Präparat dient zur ersten Orientierung über Größe, Form und Beweglichkeit. Bakterien, die durch die Filtration auf Membranfiltern angereichert wurden, lassen sich auf sehr einfache Weise mikroskopieren. Auf dem gereinigten Objektträger wird anstelle des Wassertropfens ein Tropfen Immersionsöl aufgebracht. Das luftgetrocknete Membranfilter wird auf den Objektträger aufgelegt. Nach Auflegen des Deckglases kann mit Durchlicht mikroskopiert werden. Genauere Bestimmungen sind mit Hilfe gefärbter Präparate möglich. Färbeverfahren Im fixierten (abgetöteten) Zustand nehmen Bakterien sehr viel mehr Farbstoff auf. Deshalb ist die Untersuchung fixierter, gefärbter Präparate als die mikrobiologische Standardmethode zu bezeichnen. Die Färbung gelingt um so besser, je dünner der Ausstrich angefertigt und je schonender die Fixierung vorgenommen wurde. Die Bakterienmenge ist richtig bemessen, wenn der Ausstrich als durchsichtiger, leicht getrübter Fleck zu sehen ist. Fixierung Zweck der Fixierung ist das Haften der Bakterien an der Glasfläche und das Abtöten unter weitgehender Strukturerhaltung. Dazu wird der Objektträger mit dem Ausstrich nach unten 3 + durch die kleine Flamme des Bunsenbrenners gezogen. Zeigt der Ausstrich nach oben, muss dieses ca. 10 + erfolgen. Ausstrichpräparat Auf einen gut gereinigten und entfetteten Objektträger wird ein Wassertropfen aufgebracht und darin Bakterien aufgeschwemmt. Danach wird mit Hilfe des Deckglases der Ausstrich gefertigt (siehe Skizze). Der Ausstrich wird an der Luft getrocknet, fixiert und gefärbt. Färbung mit Tintenstift Auf dem Objektträger wird neben dem fixierten Präparat so lange mit einem Tintenstift in einem Wassertropfen gerührt, bis eine violette Farblösung entstanden ist. Diese wird über das Präparat verteilt und soll 5-10 Minuten einwirken. Danach wird mit Wasser gespült und getrocknet. Dauerpräparat Ist ein Ausstrich gut gefärbt, kann man ihn als Dauerpräparat aufbewahren. Dazu wird auf den trockenen Ausstrich ein Tropfen Canadabalsam oder Caedax gegeben und mit einem sauberen Glas bedeckt. Lichtgeschützt lassen sich Dauerpräparate jahrelang aufbewahren. Anzüchten einer Reinkultur Reinkulturen lassen sich mit verschiedenen Methoden anzüchten. Zur Auftrennung eines Bakteriengemisches (z. B. ein stark verkeimtes Oberflächenwasser oder eine mit verschiedenen Keimen angereicherte Nährbouillon) bedient man sich folgender Verfahren: a) Verdünnungsreihe Vor der Untersuchung von Proben mit zu erwartendem hohen Keimgehalt ist es notwendig, diese Proben nach einem bestimmten Schema zu verdünnen. Man geht dabei folgendermaßen vor: Färben mit Farbstofflösungen Zunächst werden Stammlösungen hergestellt. Dazu werden die Farbstoffe (z. B. Methylenblau oder Fuchsin) in 96%igem Alkohol bis zur Sättigung gelöst. In der Flasche sollte ein ungelöster Rest als Bodensatz zurückbleiben. Nach einer Filtration über ein Faltenfilter sind Stammlösungen, lichtgeschützt aufbewahrt, unbegrenzt haltbar. Alkalische Methylenblau-Lösung (nach Löffler) 100 ml destilliertes Wasser 30 ml Stammlösung 1 ml 1%ige Kalilauge (Nach Mischung filtrieren) Karbol-Fuchsin-Lösung (nach Ziehl-Neelsen) 100 ml einer 5%igen Phenol-Lösung 10 ml Fuchsin-Stammlösung (nach Mischung filtrieren) Phenol-Lösung 5 g Phenol wird unter Schütteln in 100 ml Wasser gelöst. Vorsicht: Phenol und Fuchsin sind giftig, deshalb Hautkontakt vermeiden. Beide Farbstofflösungen sind auch gebrauchsfertig im Handel zu beziehen. 6 Färben Der getrocknete und fixierte Ausstrich wird auf eine Färbewanne oder ein ähnliches Gefäß gelegt. Die Farbstofflösung wird aufgetropft bis das Präparat bedeckt ist. Nach ca. 5 Minuten Färbedauer wird mit Leitungswasser so lange gespült, bis keine Farbstoffwolken mehr entstehen. Danach trocknen lassen. Mit Karbol-Fuchsin-Lösung ca. 1 Minute färben. In unserem Beispiel soll eine Verdünnung in 10er Schritten beschrieben werden. Handelsübliche Reagenzröhrchen mit ca. 15 ml Volumen werden mit 9 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung beschickt, mit einem Stopfen verschlossen und in einem Reagenzglasständer im Autoklaven bei 121°C oder im Dampftopf sterilisiert (30 Minuten). Nach Beendigung der Sterilisationszeit wird nach Abkühlen das erste Röhrchen mit 1 ml der zu untersuchenden Probe beimpft. Der erste Verdünnungsschritt 1:10 ist hiermit erreicht. Schema einer Verdünnungsreihe Nach kräftigem Durchschütteln wird aus dieser ersten Verdünnung 1 ml entnommen und auf das nächste Röhrchen übertragen. In dem 2. Röhrchen liegt nun die Verdünnung 1:100 vor. Weitere Verdünnungsschritte werden in der gleichen Weise vorgenommen. Zum Zwecke der mikrobiologischen Untersuchung wird aus den einzelnen Verdünnungsstufen jeweils 1 ml entnommen und in der bereits beschriebenen Weise membranfiltriert oder nach anderen Verfahren untersucht. Wenn nach der üblichen Bebrütungszeit von 48 Stunden ausgewertet wird, so findet man meist in 2 oder 3 Kulturen einer Verdünnungsreihe Koloniezahlen, die in einem Bereich liegen, der das Auszählen ermöglicht. Dabei liegen die »auszählbaren« Koloniezahlen im Bereich zwischen 30 und 200 Kolonien pro Petrischale oder Membranfilter. Bei Kulturen mit mehr als 200 Kolonien erschwert zu dichter Bewuchs das Auszählen der Kolonien, es kommt zu einem verminderten Nährstoffangebot und die anfallenden Stoffwechselprodukte verhindem oft völlig den Nachweis langsam wachsender Keime. Unterhalb 30 Kolonien wird aufgrund der biologischen Schwankungsbreite die statistische Aussage zu unsicher. Die bei der Auswertung ermittelte Koloniezahl wird mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert. Daraus ergibt sich die Koloniezahl der unverdünnten Probe. Zu Anfang dieses Abschnittes wurde die Sterilisation von Wasser in verschlossenen Reagenzröhrchen kurz erläutert. Steht kein Autoklav oder Dampftopf zur Verfügung, werden die leeren Reagenzröhrchen im Trockenschrank bei 180°C in 1 Stunde trocken sterilisiert. Steriles Wasser wird durch eine Sterilfiltration durch ein Membranfilter mit 0,2 μm Porengröße gewonnen. Dazu wird das Membranfilter 11307-025 in den Filtrationsvorsatz aus Kunststoff eingelegt und dieser in kochendem Wasser oder Dampftopf sterilisiert. Nach der Sterilisation wird der Filtrationsvorsatz auf eine Spritze gesetzt und das in der Spritze befindliche Wasser wird durch Herunterdrücken des Kolbens sterilfiltriert. 7 b) Verdünnungsausstrich Mit einer sterilen Impföse wird Material aus der Bakteriensuspension entnommen. Mit der Öse wird in engen Schlangenlinien über die Oberfläche einer Agar-Platte oder über ein auf der getränkten Kartonscheibe liegendes Membranfilter gestrichen. Im letzten Abschnitt kommt es zur Vereinzelung der Bakterien und nach der Inkubation zu einzeln wachsenden Kolonien. Eine noch bessere Auftrennung erhält man, wenn man den Ausstrich wie bei Abb. 3 ausführt. Beide beschriebenen Verfahren führen zum Anzüchten von Einzelkolonien, die anschließend zur Erhaltung und Konservierung auf Schrägagarröhrchen überimpft werden können. Schrägagar-Röhrchen Reagenzröhrchen mit Watte |Staniol-Verschluss oder Röhrchen mit Schraubverschluss (z.B. geleerte Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon-Röhrchen) werden zur Hälfte mit entsprechendem Agar-Medium (z.B. WürzeAgar) gefüllt, verschlossen und sterilisiert. Während der Erstarrung des Agars werden die Röhrchen in Schräglage gelegt. Dadurch wird die Agaroberfläche in der gewünschten Weise um das zwei- bis dreifache vergrößert. Die schräge Agaroberfläche vereinfacht das Beimpfen und eine Entnahme von Zellmaterial, ohne dabei die Oberfläche zu beschädigen. Nach Beimpfen des Schrägagar-Röhrchens wird dieses 48 h bebrütet. Das gut verschlossene Röhrchen wird im Kühlschrank aufbewahrt. Durch die niedrige Temperatur kommt das Wachstum zum Stillstand, Nährstoffe werden kaum verbraucht, Stoffwechselprodukte fallen in Minimalmengen an. Austrocknen des Nährbodens ist aufgrund der großen Schichtdicke nicht möglich. Trotzdem werden Schrägagar-Kulturen etwa nach 2-3 Monaten erneut auf einen in der gleichen Weise bereiteten Schrägagar überimpft, um die Reinkultur schonend über lange Zeit aufbewahren zu können. 8 1. Schema eines Verdünnungs-Ausstrichs 3. Schema eines fraktionierten Ausstrichs 2. Ausstrich nach Bebrütung 4. Fraktionierter Ausstrich nach Bebrütung Mikrobiologisches Praktikum Kulturen von Mikroorganismen auf Membranfiltern, in oder auf anderen Medien, müssen mit großer Sorgfalt behandelt werden. Der Untersucher muss sich so verhalten, als handele es sich in jedem Fall um Krankheitserreger. Allgemeine methodische Arbeitshinweise Um den Erfolg der Experimente nicht zu gefährden ist es notwendig, immer unter aseptischen Bedingungen zu arbeiten, d. h., dass alle unerwünschten Mikroorganismen ferngehalten werden müssen. Zur Filtration einer Probe durch ein Membranfilter wird Unterdruck benötigt. Dazu kann einer der beiden seitlichen Anschlüsse über die mitgelieferte Schlaucholive mit einer Unterdruckquelle, z. B. einer Wasserstrahlpumpe verbunden werden. Der Umgang mit Mikroorganismen ist gefahrlos, wenn bestimmte Verhaltensmaßregeln beachtet werden: Es sollte deshalb in einem vor Luftzug geschützten Raum neben einer Bunsenbrennerflamme gearbeitet werden. Etwa 30 Minuten vor Arbeitsbeginn ist der Arbeitsplatz mit einer desinfizierenden Lösung zu besprühen oder abzuwaschen. Es ist notwendig, dass die Gerätschaften wie Pinzette, Filtrationsgerät, Probenahmegefäß u.s.w. steril sind. Damit die Durchführung der Experimente nicht an einen Ort gebunden ist, in dem festmontierte Unterdruckquellen installiert sind, enthält der Sartorius Stedim Biotech Schulkit eine 50 ml Spritze und ein Dreiwegeventil zur Erzeugung von Unterdruck. Mit dieser Geräteausrüstung können die Experimente auch direkt in der freien Natur – an einem Fluss oder See – durchgeführt werden. Filtrationsgerät 16510 Das Filtrationsgerät aus Kunststoff 16510 bildet die Grundlage für die Durchführung der Versuche. Vor der Durchführung des Experiments wird das Oberteil des Gerätes einschließlich der Filterunterstützung durch Eintauchen in kochendes Wasser sterilisiert. Eine Sterilisation des Auffanggefäßes (Unterteil) ist nicht notwendig, da bei den Experimenten das Filtrat verworfen wird. Mit einer abgeflammten Tiegelzange werden die Teile des Filtrationsgerätes aus dem siedenden Wasser entnommen und nach kurzem Abtropfen zusammengeschraubt. Das Einlegen des sterilen Membranfilters ins Filtrationsgerät geschieht wie folgt: Um einen solchen Versuch durchzuführen, wird das Dreiwegeventil mit der Spritze zusammengebaut. In das freie Ende des Silikonschlauchs wird der Kunststoffadapter 17108 eingesteckt. Der Adapter wird dann in die seitliche Öffnung des Gerätes eingeführt. Nachdem die gegenüberliegende seitliche Öffnung und die drei Öffnungen im Auffanggefäß (Unterteil) verstopft sind, kann durch Betätigen des Kolbens der Spritze Unterdruck erzeugt werden. – Gründliches Händewaschen vor und nach der Arbeit. – Die Arbeitsplätze sind vor Beginn der Arbeiten mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z.B. 70%igem Alkohol) abzureiben (Oberflächendesinfektion). – Am Arbeitsplatz soll nicht gegessen und getrunken werden. – Bakterienkulturen dürfen nicht offen stehen. – Bakterienmaterial darf nicht mit den Händen berührt werden. – Bakteriensuspensionen nie mit dem Mund pipettieren, immer Pipettierhilfen benutzen. (z. B. Peleus-Ball). – Impfösen und Impfnadeln müssen vor und nach dem Gebrauch durch Ausglühen sterilisiert werden. – Arbeitsgeräte, die mit Bakterien in Berührung gekommen sind, müssen sterilisiert werden. – Glas- und Porzellangeräte können bei 180°C 1 Stunde im Trockenschrank oder durch Auskochen sterilisiert werden. Metallgeräte werden, wie die Glasgeräte, hitze sterilisiert oder abgeflammt. Nach Aufreißen der Einzelverpackung wird das sterile Membranfilter mit einer abgeflammten Pinzette entnommen und auf die Filterunterstützung des Filtrationsgerätes aufgelegt (siehe »Allgemeine Arbeitshinweise in Bildern« auf Seite 19/20). Danach wird das Oberteil des Gerätes aufgeschraubt. Bei Versuchen in der freien Natur können äußere Bedingungen vorliegen, die ein mikrobiologisches Arbeiten erschweren Zum Schutz vor einer Kontamination (Staub, Luftkeime) wird deshalb der Trichter abgenommen und dafür die Kappe aufgeschraubt. Auf einen der Anschlüsse im Oberteil wird ein Filtrationsvorsatz aus Kunststoff, 13 mm d, mit einem Glasfaserfilter bestückt, aufgesetzt. Jetzt kann die Luft frei von Schmutzstoffen ins Oberteil des Gerätes gelangen. – Petrischalen- und Reagenzglaskulturen sind 2 Std. mit einer 10%igen Formalinlösung zu überschichten, bevor die Gefäße gereinigt werden können. Kulturen in Plastikgefäßen können, sofern die Möglichkeit gegeben ist, verbrannt werden, andernfalls sind sie vor dem Verwerfen mit Formalinlösung zu desinfizieren. Filtrationsgerät 16510 9 Grundausrüstung für Schulversuche Sämtliche Teile des Schulkit sind auch einzeln lieferbar, mit Ausnahme der Kunststoffspritze (50 ml) 16647, die außerhalb dieser Ausrüstung unter der Best.-Nr. 16647 E in Packungen zu 12 Stuck lieferbar ist. Die in der Grundausrüstung in der Normpackung 14095-047 N enthaltenden Nährkartonscheiben, Typ Endo, Standard und Würze sind auch getrennt (in Packungen zu 100 Stck.) unter folgenden Bestellnummern lieferbar: 1 9 10 14055-047 N Standard-Nährkartonscheiben, für Koloniezahl, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) 11 12 2 140 53-047 N Endo Nährkartonscheiben, für E. coli und Coliforme, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) 14058-047 N Würze Nährkartonscheiben, für Hefen und Schimmelpilze, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) 4 5 6 Nährkartonscheiben für andere mikrobiologische Zielsetzungen finden in unserer Broschüre SM-4017d 3 Die Bebrütung der Kulturen unter definierten Bedingungen wird in Brutschränken durchgeführt. 24002 Schulkit für mikrobiologische Experimente, im Alu-Koffer Komplett im Alu- Koffer verpackt: 1 1+ 16510 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1+ 16639 1+ 17108 D 1+ 16647 1+ 16625 1+ 16646 E 1+ 16517 E 1+ 117109 1+ 14132K 1+ 14095047 N 11 12 1+ 11307025 N 1+ 13400013 S Filtrationsgerät aus Polycarbonat, für Unterdruck oder Oberdruck, 47 mm, 250 ml Dreiwegeventil Kunststoff-Adapter (10 St.) für Verbindung 16639 und 16510 Einwegspritze aus Kunststoff, 50 ml, steril Edelstahlpinzette Einwegspritzen aus Kunststoff, 20 ml, steril (12 St.) Filtrationsvorsätze aus Kunststoff, 25 mm (12 St.) Impföse mit Halter Nährbouillon in Röhrchen steril (50 + 20 ml) Endo-, Würze-, Standard-Nährkartonscheiben für Schulkit in Petrischalen, mit Filter, steril Zelluslose-Nitrat-Membranfilter, weiß; 25 mm, 0,2 μm (100 St.) Glasfaserfilter, weiß, 13 mm (200 St.) Wir empfehlen: 18113 Brutschrank 220 V/50 Hz Folgende Ausrüstung ist hervorragend für die Verarbeitung von sterilem Wasser, insbesondere für die Befeuchtung von Nährkartonscheiben, geeignet: 16685-2 Dosierspritze mit einstellbarem Volumen von 0,5 bis 5,0 ml in Schritten von 0,5 ml 16214 Filtrationsvorsatz aus Edelstahl, 25 mm. 1324 Edelstahlnadel für Luer-Konus 11107-25 Cellulose-Acetat-Membranfilter, weiß, 0,25 mm, 0,2 μm (100 St.) Der Filtrationsvorsatz mit eingelegtem Filter kann entweder durch Autoklavieren (121°C, 20’) oder mit Trockenhitze (180°C, 1 h) sterilisiert werden. 10 Versuch 1 1. Nachweis von Mikroorganismen im Wasser 1.1 Einleitung In industrialisierten Ländern ist das Wasser durch kommunale oder industrielle Abwässer besonders gefährdet. Insbesondere bei Oberflächenwasser (Flüsse, Teiche und Seen) besteht die Gefahr einer Verschmutzung. Die natürlichen Grundwasservorräte reichen oft in dicht besiedelten Gebieten für die Trinkwasserversorgung nicht aus, so dass zur Ergänzung des Trinkwasserbedarfs aufbereitetes Oberflächenwasser verwendet werden muss. Durch verunreinigtes Trinkwasser können jedoch gefährliche Darmerkrankungen verursacht werden, die in leichteren Fällen zu einem Krankheitsbild führen, das allgemein unter dem Begriff »Durchfall« zusammengefasst wird. Um den Verbraucher vor Erkrankungen zu schützen, sind vom Gesetzgeber regelmäßige mikrobiologische Kontrollen vorgeschrieben. Die Aufsichtsbehörden führen solche Untersuchungen durch und überwachen außerdem interne Untersuchungen von Wasserwerken und Betrieben mit eigenen Brunnenanlagen. Die mikrobiologische Untersuchung des Trinkwassers umfasst a) die Bestimmung der Koloniezahl und b) den Nachweis von Escherichia coli und coliformen Bakterien. Zu a) Als Koloniezahl wird die Zahl der auszählbaren Kolonien bezeichnet, die sich aus den in 1 ml Untersuchungswasser befindlichen Bakterien auf nährstoffreichen, peptonhaltigen Nährmedien bei bestimmter Bebrütungstemperatur innerhalb von 48 h entwickeln. (Genaue Definition siehe einschlägige Verordnungen wie »Deutsche Einheitsverfahren zur Wasseruntersuchung« oder »EG Richtlinie der Trinkwasserqualität«) Da Mikroorganismen oft in Keimverbänden vorkommen oder an Partikel in großer Zahl angelagert sind, muss die Zahl der Kolonien nicht mit der Zahl der vermehrungsfähigen Keime übereinstimmen. Deshalb wurde der Definition Koloniezahl gegenüber Keimzahl der Vorzug gegeben. Zu b) Der Nachweis von Escherichia coli und coliformen Bakterien im Trinkwasser ist als eine Untersuchung auf Nichtvorhandensein dieser Keime anzusehen. Deshalb werden für diesen Nachweis 100 ml Wasser zur Untersuchung über ein Membranfilter filtriert. Escherichia coli und die übrigen coliformen Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Da einige humanpathogene Gattungen, z. B. der Typhuserreger Salmonella typhosa ebenfalls aus der Familie der Enterobacteriaceen, mit praktisch gleichen Nährstoffansprüchen ausgestattet und gleichem Hauptvermehrungsort unter ähnlichen Bedingungen vorkommt, gilt der Nachweis der Indikatorkeime im Trinkwasser als gefährliche Verunreinigung. Aufbereitetes Leitungswasser aus dem Leitungswassernetz ist von vorzüglicher Qualität. Deshalb sollten Sie für den Versuch möglichst Oberflächenwasser (Fluss oder See) verwenden. Der Nachweis von E. coli und coliformen Keimen auf Endo-NKS ist bereits unter »Endo-Nährkartonscheiben« beschrieben. Die typische Koloniebildung ermöglicht einem geübten Untersucher bereits vorab die makroskopische Beurteilung der angewachsenen Kolonien. Neben der Eigenschaft, die Enterobakterien in einer typischen Koloniebildung zum Nachweis zu bringen, wirkt das Medium gleichzeitig als Selektivmedium, indem es das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt. 1.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Filtratonsgerät 16510 Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter 11307-025 Petrischale mit Nährkartonscheibe »Standard« Petrischale mit Nährkartonscheibe »Endo« 1.3 Probe Zur Entnahme der Wasserprobe aus einem Fluss oder Teich verwenden Sie einen sauberen, möglichst sterilen Behälter (Glasflasche mit Schraubverschluss). Nehmen Sie die Probe wenn möglich 20 cm unterhalb der Oberfläche. 1.4 Methodische Durchführung In das vorbereitete Filtrationsgerät werden 10 bis 20 ml Wasser mit Hilfe der Spritze durch den Filtrationsvorsatz als Vorlage in den Trichter des Filtrationsgerätes sterilfiltriert. Zur Untersuchung auf coliforme Keime werden je nach Verschmutzungsgrad 0,1 ml bis 1,0 ml der Wasserprobe gleichmäßig mit der Pinzette in der Vorlage verteilt. Mit der Spritze und dem Dreiwege-Ventil wird die Luft aus dem Unterteil des Filtrationsgerätes abgesaugt. Die Probe wird filtriert. Mit abgeflammter Pinzette wird das Membranfilter dem Gerät entnommen und unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die befeuchtete Nährkartonscheibe gelegt. (Endo-Nährkartonscheibe) Zur Bestimmung der Koloniezahl wird das Filtrationsgerät wieder in der gleichen Weise vorbereitet und steriles Wasser im Trichter des Gerätes vorgelegt. Aus einer zuvor hergestellten Verdünnungsreihe (siehe Verdünnungsreihe!) wird mit einer Pipette 1 ml aus einer der Verdünnungsstufen entnommen und in der Vorlage verteilt. Sollen Kulturen mit steigenden Koloniezahlen angesetzt werden, so beginnt die Untersuchung immer mit der am stärksten verdünnten Probe. Die Filtration der Verdünnung, die Entnahme des Filters aus dem Filtrationsgerät, das Auflegen auf eine vorbereitete Nährkartonscheibe erfolgt in der gleichen Weise wie bei der Untersuchung auf coliforme Keime. Allerdings wird das Filter zur Koloniezahlbestimmung auf eine vorbereitete »Standard Nährkartonscheibe« aufgelegt. Die Kulturen, die Endo-Nährkartonscheiben und auch die Standard-Nährkartonscheiben, können bei Raumtemperatur 48 Stunden bebrütet werden. Wenn möglich, werden die Endo-Kulturen in einem Brutschrank bei 37°C über 24 h bebrütet. Während der Bebrütung werden die Petrischalen nicht umgedreht. 11 1.5 Auswertung Nach der Bebrütung werden die Kulturen ausgewertet. Dazu werden die auf den Membranfiltern gewachsenen Kolonien, ggf. mit einer Lupe ausgezählt. Standard: Die auf diesem Nährboden wachsenden Bakterien sind ziegelrot gefärbt. Dadurch bilden sie auf dem hellen Untergrund einen deutlichen Kontrast. (Der Zusatz TTC, Triphenyltetrazoliumchlorid, wird zu Formazan, einem roten Vitalfarbstoff reduziert). Endo: Auf diesem Selektivmedium wachsen ausschließlich Escherichia coli und coliforme Bakterien, wobei die Kolonien mit grünem metallischen Glanz von E. coli und die leuchtend roten Kolonien von coliformen Bakterien gebildet werden. 12 Zur weiteren Differenzierung oder zum Anstellen einer Reinzucht können einzeln gewachsene Kolonien mit einer Impföse vom Membranfilter abgeimpft und in ein Nährbouillon-Röhrchen übertragen werden. Die beimpfte Bouillon kann bei Raumtemperatur bebrütet werden. Die Reinzucht wird für einen der nächsten Versuche benötigt. Zur Dokumentation werden die Filter von den immer noch feuchten Nährkartonscheiben abgenommen und bei 70°C im Trockenschrank getrocknet. Dabei werden die vegetativen Zellen abgetötet. Die getrockneten Membranfilter können dann mit einem lösungsmittelfreien Kleber in Untersuchungsprotokolle eingeklebt und mit einer Klarsichtfolie vor Beschädigung geschützt werden. Versuch 2 2. Nachweis von Mikroorganismen in der Luft 2.1 Einleitung Luft besitzt keine eigene mikrobiologische Flora, da sie ungünstige Lebensbedingungen bietet. Fast immer fehlen geeignete Nährstoffe und der benötigte Wassergehalt. Darüberhinaus sind Luftkeime in der freien Atmoshäre der UV-Strahlung ausgesetzt, die besonders die vegetativen Lebensformen vieler Mikroorganismen schädigt. Dennoch bleiben gewisse Bakterien, Hefen und Schimmelpilze über längere Zeiträume in der Luft lebensfähig. Die sporen- und farbstoffbildenden Organismen sind besonders geschützt. Die sporenbildenden Dauerformen durch ihre resistente Schutzhülle, die sie gegen alle möglichen Widrigkeiten der Umwelt schützt, die farbstoffbildenden aufgrund der Farbstoffeinlagerung gegen die ultra-violette Strahlung. Die meisten Mikroorganismen sind an Partikel angelagert. Sie sind Teile ausgetrockneter Substrate, in denen sie gewachsen sind. Die an einem bestimmten Ort vorkommenden Arten stammen überwiegend von den in unmittelbarer Nachbarschaft vorhandenen Quellen ab. So wird beispielsweise an einem windigen Tag die Luft über einem Acker die gleichen Arten von Mikroorganismen enthalten, die im Erdreich anzutreffen sind. Wo viele Menschen beisammen sind, z. B. Kinos, Schulen, Betriebskantinen, werden Mikroorganismen oft durch Husten und Niesen übertragen. In Räumen, in denen sich Menschen aufhalten, finden wir in der Luft Bakterien aus dem Erdreich (Staub) und eine Reihe anderer Bakterien und Pilze, die von den Menschen selbst stammen. Durch das Öffnen von Fenstern und Türen und durch Luftbewegungen werden Mikroorganismen immer wieder hochgewirbelt. Mit dem folgenden Versuch können Sie selbst die Eignung ihres Arbeitsplatzes für mikrobiologisches Arbeiten feststellen, indem Sie unter geänderten Bedingungen den Gehalt an Luftkeimen an Ihrem Arbeitsplatz überprüfen. 2.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Bereiten Sie 8 Petrischalen mit je 4 Standardund 4 Würze-Nährkartonscheiben vor, indem Sie das Filter gleich auf die befeuchtete Nährkartonscheibe in die Petrischale legen. 2.3 Probe Die Luftkeimbestimmung nach dem Sedimentationsprinzip wird gewöhnlich mit Agar-Nährböden durchgeführt. Soll die Bestimmung von Keimen in der Luft mit Nährkartonscheiben durchgeführt werden, muss auf den befeuchteten Nährboden immer das Membranfilter aufgelegt werden. Nur so ist es möglich, von den sedimentierten Luftkeimen einzeln wachsende Kolonien anzuzüchten. 2.4 Methodische Durchführung Beschriften Sie die Petrischalen mit Namen, Ort der Aufstellung und Prüfzeit. Stellen Sie gleichzeitig je eine Petrischale mit Standardund Würze-Nährkartonscheiben auf. 2.4.1 Überprüfen Sie Ihren Arbeitsplatz, indem Sie je eine Petrischale mit Standardund Würze-Nährkartonscheiben öffnen und in die Nähe stellen, während Sie andere Arbeiten durchführen. Durch Luftbewegungen z.B. bei Betreten des Raumes durch Personen, werden Mikroorganismen hochgewirbelt. (Ungünstige Bedingungen am Arbeitsplatz). 2.5 Auswertung Zur Auswertung der angewachsenen Kulturen und zum besseren Erkennen der Einzelheiten, sollten Sie eine Lupe benutzen. Auf dem Standard Medium werden Sie bevorzugt Bakterien nachweisen können, die aufgrund des TTC-Zusatzes mehr oder weniger rot gefärbt sind. Hefen- und Schimmelpilzkolonien werden nur sehr langsam wachsen. Auf dem Würze-Medium wachsen bevorzugt Hefen und Schimmelpilze. Hefen wachsen meist als gewölbte weiße oder farbige Kolonien. Bei Luftkeimuntersuchungen überwiegen die farbigen Kolonien. Schimmelpilze bilden meist samt- oder wattebauschartige Kolonien, die in der frühen Wachstumsphase weiß sind und später, je nach Art, unterschiedlich gefärbt sein können. Vereinzelt wachsen auf dem Würze-Medium auch Bakterien an; doch auch hier werden farbige Kolonien überwiegen (Farbstoffbildende Mikroorganismen sind resistenter gegenüber UV-Strahlung). 2.4.2. Verbessern Sie jetzt die Bedingungen an Ihrem Arbeitsplatz, indem Sie mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z.B. Äthanol 70%ig) Ihren Arbeitsplatz besprühen oder abwaschen. Stellen Sie nach angemessener Einwirkungszeit an gleicher Stelle wieder zwei geöffnete Petrischalen auf. Veranlassen Sie, dass Fenster und Türen geschlossen bleiben und niemand während der Prüfzeit den Raum betritt. 2.4.3 Stellen Sie die nächsten beiden Petrischalen in der Nähe einer stark befahrenen Straße (z. B. Fensterbank) auf. 2.4.4. Die verbleibenden Petrischalen stellen Sie an einem nach Ihrer Meinung besonders geschützten Platz auf. (z. B. unter einer Käseglocke). Wählen Sie für diese Versuchsreihe gleiche Prüfzeiten (zwischen 15 und 60 Minuten). 2.4.5. Danach werden die Petrischalen sorgfältig verschlossen und anschließend bei Raumtemperatur an lichtgeschützter Stelle oder im Brutschrank 48 h bebrütet. Da Luftkeime mehr oder weniger stark geschädigt sind, wachsen sie oft erst nach mehreren Tagen zu sichtbaren Kolonien heran. Deshalb sollten Sie die endgültige Auswertung erst nach 3 oder 5 Tagen vornehmen. 13 Versuch 3 3. Nachweis von Mikroorganismen im Erdreich 3.1. Einleitung Der Boden ist der wichtigste, natürliche Lebensraum für Mikroorganismen. ihre Anzahl hängt sehr stark von der Bodenbeschaffenheit ab. Ein Gramm feuchter schwerer Ackerboden kann enthalten: Bakterien Aktinomyceten Pilze Algen Protozoen ca. 2 500 000 000 ca. 700 000 000 ca. 400 000 000 ca. 50 000 ca. 30 000 Darüber hinaus enthält guter Ackerboden etwa 400 m Pilzmycel. Der Keimgehalt schwankt stark, da er von vielen Faktoren abhängig ist. Die gröBte Anzahl von Mikroorganismen befindet sich in der Nähe der Oberfläche, weil dort, wegen des größeren Nährstoffangebotes, die bessere Vermehrung stattfindet. In tieferen Bodenschichten nimmt die Zahl der Mikroorganismen stark ab. 3.2. Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Filtrationsgerät 16510 Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter 11307-025 Bereiten Sie sich 5 sorgfältig gesäuberte Reagenzröhrchen vor, indem Sie diese 5-10 Minuten durch Auskochen entkeimen. Entnehmen Sie die Röhrchen mit einer abgeflammten Pinzette dem kochend heißen Wasser und stellen Sie diese nach Verschließen mit einem Wattestopfen oder einer Alu-Kappe in einen Reagenzglasständer. (Wattestopfen oder Alu-Kappen zuvor, wenn möglich, 30’ bei 180°C sterilisieren.) 3.3 Probe Nehmen Sie mit einem Probenlöffel nach Entfernung der oberen Schicht eine kleine Menge Erde in ein verschließbares Fläschchen oder in einen mit Alu-Folie verschlossenen Erlenmeyer-Kolben. 14 3.4 Methodische Durchführung Zur Durchführung dieses Versuches sollten Sie, wegen der zu erwartenden hohen Keimzahl, vor Beginn der Filtration eine Verdünnungsreihe herstellen. Benutzen Sie dazu die durch Auskochen sterilisierten Röhrchen. 3.4.1 Geben Sie in eine sterile, verschließbare Flasche 1 g Erde und füllen mit sterilem Wasser bis auf 100 ml auf. Verschließen Sie die Flasche. Durch kräftiges Schütteln lösen Sie die Erdprobe gut auf. Aus dieser ersten Verdünnung (10 -2) werden für weitere Verdünnungen sterile Reagenzröhrchen benutzt. Filtrieren Sie in das erste Reagenzröhrchen 9 ml steriles Wasser ein, stellen Sie das Reagenzröhrchen in den Ständer und füllen Sie die weiteren Röhrchen bis zur gleichen Höhe ebenfalls mit sterilfiltriertem Wasser auf. Entnehmen Sie aus der Flasche (erste Verdünnung 10 -2) mit einer sterilen Pipette 1 ml und füllen Sie diese Teilmenge in das erste Reagenzröhrchen. Nach gutem Durchmischen liegt dort eine Verdünnung von 10 -3 vor. Nach Entnahme von 1 ml aus dem Reagenzröhrchen wird die jeweils nächste Verdünnung um eine Zehnerpotenz weiterverdünnt. (10 -4, 10 -5 usw.) 3.4.2 Wenn Sie die Verdünnungen nicht in genau abgemessenen Zehnerschritten ansetzen, können Sie auch nach folgendem vereinfachten Verdünnungsschema arbeiten: Füllen Sie eine kleine Menge der Erdprobe in ein wie unter 3.2. vorbereitetes Reagenzglas. Filtrieren Sie ca. 10 ml steriles Wasser hinzu. Lösen Sie die Probe durch kräftiges Schütteln auf. Nach Absetzen der unlöslichen Bestandteile überimpfen Sie mit einer abgeflammten Platinöse die Suspension ins erste Röhrchen. Durch Schütteln verteilen Sie die Keime im Röhrchen und überimpfen auf das nächste Röhrchen. Dadurch erhalten Sie Verdünnungen in abnehmender Konzentration. 3.4.3 Legen Sie in das Filtrationsgerät 16510 ein steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie mit Hilfe der Spritze und dem Filtrationsvorsatz ca. 10 ml steriles Wasser (Vorlage) in den Trichter des Filtrationsgerätes. Entnehmen Sie dann mit der Pipette aus der stärksten Verdünnungsstufe (z. B. 10 -6) 1 ml der Verdünnung und verteilen Sie diese Menge gleichmäßig in der Vorlage. Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck. Die Probe wird filtriert. Danach entnehmen Sie mit einer abgeflammten Pinzette das Membranfilter aus dem Gerät und legen es unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die angefeuchtete Standard-Nährkartonscheibe. 3.4.4 Sie arbeiten in der gleichen Weise, wenn Sie aus der Verdünnung die Probe filtrieren, die auf der Würze-Nährkartonscheibe bebrütet wird. Sollten Sie nach der vereinfachten Verdünnungsreihe arbeiten, können Sie vergleichbare Teilmengen entnehmen oder – bei Bebrütung auf nur einem Nährmedium – die gesamte Menge eines Röhrchens filtrieren. Die bereits vor Beginn der Versuchsreihe beschrifteten Petrischalen werden zur Bebrütung über 48 h an lichtgeschützter Stelle bei Raumtemperatur aufgestellt. 3.5 Auswertung Nach der Bebrütung werden die Kulturen ausgewertet, deren Koloniezahl innerhalb der biologischen Schwankungsbreite jeweils um eine Zehnerpotenz voneinander abweichen kann. Zur Bestimmung der Koloniezahl des Ausgangsmaterials werden nur solche Kulturen berücksichtigt, deren Koloniezahl zwischen 30 und 200 Kolonien liegt. (Erläuterungen siehe Verdünnungsreihe.) Versuch 4 4. Wirkung von Antibiotika 4.1 Einleitung Auf sehr dicht bewachsenen Membranfiltern können oft sehr deutlich die antagonistischen Beziehungen zwischen den Mikroorganismen erkannt werden. Die dabei von einigen Pilzen und Bakterien (Aspergillus, Penicillium, Actinomycetales) ausgeschiedenen Antibiotika (Stoffwechselprodukte) sind Substanzen, die schon in geringen Konzentrationen das Wachstum von Mikroorganismen hemmen. Man unterscheidet zwischen hemmend wirkenden (Bacteriostatica, Fungistatica) und abtötenden Stoffen (Bactericide, Fungicide). Die ersten Antibiotika sind zufällig an der Bildung von Hemmhöfen entdeckt worden. Auf einer Agarplatte, die mit einem Testkeim dicht beimpft war, blieb um den zufällig auf die Platte gelangten Schimmelpilz das Wachstum des dichten Bakterienrasens aus. Das aus der Schimmelpilzkolonie in den Agar diffundierte Stoffwechselprodukt (Antibiotika) verursacht die Bildung des Hemmhofes im geschlossenen Bakterienrasen. 4.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Filtrationsgerät 16510 Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter 11307-025 1 Reagenzröhrchen, ausgekocht, mit Stopfen verschlossen Petrischale mit Standard-Nährkartonscheibe 4.3 Methodische Durchführung Filtrieren Sie mit Hilfe der Spritze und Filtrationsvorsatzes 5-10 ml steriles Wasser in das Reagenzröhrchen. Verschließen Sie es mit dem Stopfen. Impfen Sie von einem mit Kolonien bewachsenen Membranfilter mit der Impföse etwas Bakterienmasse ab und überführen sie in das Reagenzglas. Reiben Sie – zur besseren Aufschwemmung der Bakterien – die Impfnadel vorsichtig an der Wandung. Durch Schütteln des Reagenzröhrchens werden die Bakterien gleichmäßig verteilt. 4.3.1 In das Filtrationsgerät 16510 legen Sie ein steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie ca. 10 ml steriles Wasser in den Trichter des Filtrationsgerätes. Enffernen Sie dann den Stopfen vom Reagenzröhrchen und flammen Sie die Öffnung des Röhrchens ab. Gießen Sie den Inhalt in die sterile Vorlage im Trichter. 4.4 Auswertung Nach der Bebrütung wird die Kultur ausgewertet. Dabei ist ein mehr oder weniger weiter Hemmhof im sonst dichten Bakterienrasen zu sehen. Das Ausmaß der Wachstumshemmung liegt im spezifischen Wirkungsspektrum des in diesem Fall aktiven Antibiotikums begründet. Die Antibiotika unterscheiden sich bezüglich ihrer Wirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien und andere Mikroorganismen. Zur Dokumentation wird das Membranfilter abgenommen und zwischen Fließpapier 1 Std. bei 80°C im Trockenschrank getrocknet. Dabei werden die vegetativen Zellen abgetötet. Nach der Trocknung kann das Membranfilter mit einem lösungsmittelfreien Kleber in ein Protokollbuch eingeklebt und mit einer Klarsichtfolie vor Beschädigungen geschützt werden. Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck. Die Probe wird filtriert. Danach entnehmen Sie mit abgeflammter Pinzette das Membranfilter aus dem Gerät und legen es unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die angefeuchtete StandardNährkartonscheibe. 4.3.2 Mit der abgeflammten Impfnadel entnehmen Sie aus einer Schimmelpilzkolonie aus Versuch 3 (möglichst mit sichtbarer Hemmhofbildung) ein wenig Substanz und tupfen diese an zwei auseinanderliegenden Stellen auf das Membranfilter. Dabei werden Sporen übertragen, die mit deutlicher Hemmhofbildung in dem dichten Bakterienrasen zu Kolonien anwachsen. Die beschriftete Petrischale wird an lichtgeschützter Stelle bei Raum temperatur 48 h bebrütet. 15 Versuch 5 5. Nachweis von Hefen in der Natur 5.1 Einleitung Hefen sind einzellige Pilze, die sich durch Sprossung vermehren. Viele Hefearten können Zucker vergären. Sie sind in der Natur weiter verbreitet als allgemein angenommen wird. Man findet sie an allen Standorten, an denen vergärbare, zuckerhaltige Säfte zur Verfügung stehen: auf Früchten und Blättern, im Nektarsaft der Blüten, im Boden als Zersetzer abgestorbener Pflanzenteile. Hefen wurden erstmals von Antonie van Leeuwenhoek im Jahre 1680 entdeckt. Sie zeigen eine große Vielfalt von Formen: kugelförmig, elliptisch, spindel-, wurst- oder zitronenförmig. Viele Heferassen werden technologisch genutzt. Die Herstellung von Wein, Bier und Branntwein ist ohne Hefe nicht denkbar, bei der Vergärung der zuckerhaltigen Substrate wie Most, Würze oder Maische werden Alkohol und Kohlendioxid gebildet. Diese Eigenschaft der Hefe ist für die Bäckerei von großer Bedeutung. Durch die Entwicklung von CO2 werden im Teig Blasen gebildet, die das Brot oder den Kuchen lockern. 5.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Filtrationsgerät 16510 Petrischale mit Nährkartonscheibe Typ Würze zum Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen. Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter 11307-25 für steriles Wasser. 5.3 Probe Bei den folgenden Versuchen sollen in der Natur vorkommende Hefen von der Schale einer Weintraube isoliert und auf WürzeNährkartonscheiben angezüchtet werden. Auf Äpfeln, Birnen, Pfirsichen oder Weintrauben sind neben anderen Mikroorganismen vor allem Hefen anzutreffen. In vielen Weinbaugebieten werden auch heute noch die auf den Trauben befindlichen Hefen für den Gärungsprozess bei der Weinherstellung genutzt. 16 5.4 Methodische Durchführung Mit der Spritze werden 2-30 ml Wasser durch den Filtrationsvorsatz in den Trichter des Filtrationsgerätes filtriert. Mit einer abgeflammten Pinzette wird eine Weintraube in den Trichter gelegt. Nach Aufsetzen des Deckels auf den Trichter wird die Weintraube im Trichter durch Umschwenken stark bewegt, um vorhandene Mikroorganismen von der Oberfläche abzuwaschen. Dann wird der Deckel abgeschraubt, die Weintraube mit steriler Pinzette entnommen und die Flüssigkeit durch Anlegen von Unterdruck filtriert. Das Membranfilter wird mit steriler Pinzette dem Filtrationsgerät entnommen und unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die feuchte Würze-Nährkartonscheibe gelegt. Die Petrischale wird zur Bebrütung bei Raumtemperatur möglichst an einem vor Tageslicht geschützten Platz gestellt. 5.5 Auswertung Nach der Bebrütung wird die Kultur ausgewertet. Da wir ein Medium verwendet haben, auf dem Hefen und Schimmelpilze besonders gut wachsen und das Wachstum von Bakterien gehemmt wird, sind die Hefekolonien als gewölbte, glatte, weiße oder farbige Kolonien zu sehen, während die Bakterienkolonien oft nur mit der Lupe erkannt werden können. Versuch 6 6. Gasbildung durch alkoholische Gärung 6.1 Einleitung Wie in der Einleitung des Versuches Nr. 5 »Nachweis von Hefen in der Natur« erläutert, sind Hefen, insbesondere SaccharomycesHefen, in der Lage, zuckerhaltige Substrate zu vergären. Hauptsächlich entsteht bei der alkoholischen Gärung Äthylalkohol, der im Substrat verbleibt, und Kohlendioxid (oft Kohlensäure genannt), das zum größten Teil in die Luft entweicht. So entsteht in einer abgefüllten verschlossenen Flasche (z.B. Apfelsaft) ein hoher Druck, wenn eine alkoholische Gärung stattfindet. Diese entsteht durch eine Infektion mit Hefen. Im folgenden Versuch soll veranschaulicht werden, welche Mengen Kohlendioxid-Gas schon bei der Vergärung relativ kleiner Mengen Apfelsaft oder ähnlicher Fruchtsäfte entstehen. Die in den Lebensmittelgeschäften erhältlichen Säfte sind zur Erhöhung der biologischen Haltbarkeit nach der Abfüllung pasteurisiert worden. (Pasteurisation = Kurzzeiterhitzung). Durch diese Maßnahmen sind alle vegetativen Zellen im geschlossenen Gefäß abgetötet worden. 6.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben Filtrationsgerät 16510 Petrischale mit Nährkartonscheibe Typ Würze zum Nachweis von Hefe und Schimmelpilzen. Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter 11307-025 6.3 Probe Bei Durchführung des Gärversuches zur Erzeugung von Kohlendioxid-Gas wird eine einzeln wachsende Saccharomyces-HefeKolonie aus Versuch 5 auf einen keimfreien Saft überimpft. 6.5 Auswertung Während dieser Zeit hat sich der Ballon über dem beimpften Röhrchen mit Gas angefüllt. Es handelt sich hierbei um Kohlendioxid (CO2) das die Hefe bei der Vergärung des Zuckers erzeugt. 6.4 Methodische Durchführung Legen Sie das sterile Membranfilter 13005 in das sterilisierte Filtrationsgerät ein. Der Ballon auf dem zweiten Röhrchen bleibt leer, da keine Gärung stafflindet. Öffnen Sie die Saftflasche in der Nähe des Bunsenbrenners und füllen Sie nach Abflammen der Flaschenmündung ca. 50 ml Saft in das Filtrationsgerät. Durch Anlegen des Unterdrucks mit Hilfe der Spritze und des Dreiwegeventils wird der Saft filtriert. Mit abgeflammter Pinzette wird das Filter entnommen und unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die Würze-Nährkartonscheibe aufgelegt. Die Petrischale wird 48 h bei Raumtemperatur bebrütet. Diese Kultur hat nur eine Kontrollfunktion hinsichtlich der Keimfreiheit des Saftes. Sie können diesen Versuch mit abgepackter Bäckerhefe wiederholen, da es sich bei der Bäckerhefe ebenfalls um eine zuckervergärende Hefe (Saccharomyces-Hefe) handelt. Sie können nachweisen, dass es sich bei dem Gas tatsächlich um Kohlendioxid handelt, indem Sie das Gas mit Hilfe eines gebogenen Glasröhrchens in eine Baryt-Lösung (Ba [OH]2) einströmen lassen. Kohlendioxid reagiert mit Ba [OH]2 unter Bildung des unlöslichen Niederschlags (Bariumcarbonat [BaCo3]). Dadurch wird die Lösung schwach milchig getrübt. Die Überprüfung der Kulturen auf dem Medium Würze ergibt in fast allen Fällen keinen Befund. 6.4.1 Saugen Sie ca. 20 ml des Saftes in die Spritze. Nach Aufsetzen des Filtrationsvorsatzes mit Filter 11307.025 (0,2 μm Porengröße) sterilfiltrieren Sie in jedes der beiden Reagenzröhrchen 10 ml des Saftes. Mit der abgeflammten Impföse übertragen Sie eine Hefekolonie einer Kultur aus Versuch 5 in eines der beiden Röhrchen. Durch Zusammenpressen oder Aufrollen entfernen Sie die Luft aus beiden Ballons. Ziehen Sie vorsichtig über jedes Röhrchen einen Ballon und stellen Sie die Röhrchen in einen Reagenzglasständer. Kennzeichnen Sie das beimpfte Röhrchen. 1 Flasche handelsüblichen Saft, z.B. Apfelsaft 2 sterile Reagenzgläser, mit Stopfen verschlossen Bebrüten Sie bei Raumtemperatur und überprüfen Sie die Gasentwicklung nach 24 und 48 Stunden. 2 kleine Gummiballons (Luftballons) 17 Versuch 7 7. Bakterienwachstum bei unterschiedlichen Temperaturen 7.2 Benötigte Geräte, Membranfilter und Nährkartonscheiben 7.1. Einleitung Neben einer Reihe individueller Eigenschaften wie dem physiologischen Leistungsvermögen oder der Vorliebe für einen bestimmten ph-Bereich, besitzen Mikroorganismen auch die Eigenschaft, bei einer bestimmten Umgebungstemperatur besonders lebhaftes Wachstum zu zeigen. Die für jede Art typische Temperatur ist deren optimale Wachstumstemperatur. Man unterscheidet drei Hauptgruppen, zwischen denen fließende Übergänge bestehen. Die psychrophilen (kälteliebenden) Arten können sich schon bei Temperaturen kurz über dem Gefrierpunkt vermehren, die thermophilen (wärmeliebenden) haben ihre optimale Wachstumstemperatur bei über 45°C, während die in großer Zahl vorkommenden mesophilen Arten ihre optimale Wachstumstemperatur in mittleren Temperaturbereichen um 25°C-40°C haben. In natürlichen Substanzen wie Wasser oder Erde lassen sich Vertreter aller drei Gruppen nachweisen. Dabei sind jedoch die mesophilen Mikroorganismen in der Überzahl, weil die genannten Lebensbereiche vorwiegend mittleren Temperaturen ausgesetzt sind und unter diesen Bedingungen die mesophilen Keime gewöhnlich schneller wachsen als die thermophilen und psychophilen. Filtrationsgerät 16510 Sollen Mikroorganismen in einem beliebigen Milieu nachgewiesen werden, so wird immer die Bebrütungstemperatur gewählt, die der natürlichen Umgebungstemperatur der nachzuweisenden Keime entspricht. So wird beispielsweise zum Nachweis des Indikatorkeims Escherichia coli im Rahmen einer Wasseruntersuchung eine Bebrütungstemperatur von 37°C gewählt, weil Bakterien dieser Art ihren Hauptvermehrungsort im Verdauungstrakt von Menschen und warmblütigen Tieren haben und sich deshalb bei dieser Temperatur am schnellsten vermehren können. Andere Mikroorganismen, z.B. solche, die aus dem Erdreich stammen, werden bei Bebrütungstemperaturen um 25°C angezüchtet. Auch bei Temperaturen, die nicht ihrer optimalen Wachtumstemperatur entsprechen, können Mikroorganismen wachsen, jedoch erheblich langsamer. Der Einfluss der Temperatur auf das Wachstum von Bakterienkulturen kann durch den folgenden Versuch leicht nachgewiesen werden. 18 Filtrationsvorsatz 16517 Membranfilter 11307.025 Petrischalen mit StandardNährkartonscheiben 6 Reagenzröhrchen mit Stopfen verschlossen 7.3 Probe Beimpfen Sie ein Nährbouillon-Röhrchen mit ein wenig Bakterienmaterial aus einer einzeln gewachsenen Kolonie von einem der vorausgegangenen Versuche (z.B. Versuch 1). Zur besseren Verteilung wird das Bakterienmaterial an der Wand verrieben und nach Verschließen des Röhrchens durch Schütteln gleichmäßig verteilt. 7.4 Methodische Durchführung Bei Raumtemperatur wird das Röhrchen 24 Stunden bebrütet. Sie können beobachten, dass die Nährbouillon nach der Bebrütung völlig trüb geworden ist (starke Bakterienvermehrung). Bereiten Sie sich 6 sorgfältig gereinigte Reagenzröhrchen vor, indem Sie diese 5-10 Minuten durch Auskochen entkeimen. Entnehmen Sie die Röhrchen mit einer abgeflammten Pinzette dem kochendheißen Wasser und stellen sie nach Verschließen mit einem Wattestopfen oder einer Alu-Kappe in einen Reagenzglasständer. (Wattestopfen oder Alu-Kappen zuvor, wenn möglich, 30’ bei 180°C sterilisieren.) Filtrieren Sie in das erste Reagenzröhrchen 9 ml steriles Wasser ein, stellen das Reagenzröhrchen in den Ständer und füllen Sie die weiteren Röhrchen ebenfalls bis zur gleichen Höhe mit sterilfiltriertem Wasser auf. Stellen Sie von der Reinkultur eine Verdünnungsreihe her. Gehen Sie dabei in der Weise vor, wie unter Abschnitt Verdünnungsreihe beschrieben. Legen Sie in das Filtrationsgerät 16510 ein steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie mit Hilfe der Spritze und dem Filtrationsvorsatz 10 ml steriles Wasser in den Trichter des Filtrationsgerätes. Entnehmen Sie mit der Pipette aus der stärksten Verdünnungsstufe (z.B. 10 -6) 1 ml der Verdünnung und verteilen Sie diese Menge gleichmäßig in der Vorlage. Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck. Die Probe wird filtriert. Danach entnehmen Sie mit einer abgeflammten Pinzette das Membranfilter aus dem Gerät und legen es unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf die angefeuchtete Standard-Nährkartonscheibe. Für jede weitere Verdünnungsstufe mit zunehmender Konzentration ist der Arbeitsgang gleich. Sollten Sie nach der vereinfachten Verdünnungsreihe arbeiten, können Sie vergleichbare Teilmengen entnehmen und in der sterilen Vorlage verteilen. Damit in drei verschiedenen Temperaturbereichen bebrütet werden kann müssen aus jeder Verdünnungsstufe drei gleiche Proben filtriert werden. Beschriften Sie die Petrischalen mit der entsprechenden Verdünnungsstufe und den Ziffern 1-3. Die Petrischalen der verschiedenen Verdünnugsstufen und der Ziffer 1 werden in den Kühlschrank gestellt. Die Petrischalen mit der Ziffer 2 werden an lichtgeschützter Stelle bei Raumtemperatur bebrütet, die Petrischalen mit der Ziffer 3 werden entweder bei 37°C im Brutschrank oder an einem Platz mit vergleichbarer Temperatur, z.B. oberhalb eines Heizkörpers zur Bebrütung aufgestellt. 7.5 Auswertung Werten Sie nach 48 Stunden die Kulturen aus, indem Sie die mit bloßem Auge sichtbaren Kolonien auf dem Membranfilter auszählen. Dabei werden Sie feststellen können, dass das Wachstum in einem der Temperaturbereiche am weitesten fortgeschritten ist. Bebrüten Sie die beiden in den anderen Bereichen angezüchteten Kulturen jetzt ebenfalls unter optimalen Wachstumsbedingungen und werten Sie nach 48 Stunden aus. Vergleichen Sie dann die Koloniezahl mit der nach der Bebrütung unter ungeeigneten Temperaturbedingungen. Allgemeine Arbeitshinweise in Bildern 2. Vorbereiten der 50-ml-Spritze mit dem Dreiwegeventil, dem Adapter und dem Filtrationsgerät zur Erzeugung von Unterdruck. 1. Vorbereiten der Sprike und des Filtrationsvorsatzes 1.1. Membranfilter mit 0,2 μm Porengröße in das Unterteil des Filtrationsvorsatzes einlegen. 1.4. …und sterilen Filtrationsvorsatz auf die Kunststoffspritze aufsetzen. 2.1. Sinker am Silikonschlauch des Dreiwegeventils durch Kunststoff-Adapter ersetzen. Dreiwegeventil mit der 50-ml-Kunststoffspritze verbinden. 1.2. Beim Verschrauben Unterteil des Filtrationsvorsatzes waagerecht halten. Anschließend durch Auskochen sterilisieren. 1.5. Steriles Wasser zur Filtration bei kleinen Probemengen vorlegen. 2.2. Kunststoff-Adapter in den seitlichen Anschluss des Filtrationsgerätes stecken. Gegenüberliegenden Anschluss mit Stopfen verschließen. 1.3. Unsteriles Wasser in die Kunststoffspritze aufziehen… 2.3. Mit der Spritze im Geräteunterteil Unterdruck erzeugen und damit die Filtration ermöglichen. 19 3. Vorbereiten der Nährkarton scheiben 4. Vorbereiten des Filtrationsgerätes zur Filtration 3.1. Zehner-Verpackung aufschneiden, Petrischalen so herausnehmen, dass sie geschlossen bleiben. 4.1. Membranfilter mit abgeflammter Pinzette aus Einzelverpackung entnehmen… 3.2. Mit 3,5 ml sterilem destillierten Wasser die Nährkartonscheibe benetzen. 4.2. …und auf Filterunterstützung des Filtrationsgerätes legen. Oberteil aufschrauben. 4.3. Probe durch den Trichter einfüllen. 20 4.4. Nach der Filtration das Membranfilter mit einer Pinzette dem Filtrationsgerät entnehmen… 4.5. …und unter »Abrollen« auf die befeuchtete Nährkartonscheibe auflegen. Alternative Edelstahlgeräte Die in den Versuchen beschriebenen mikrobiologischen Arbeiten lassen sich anstelle des Filtrationsgerätes aus Kunststoff 16510 auch mit einem Filtrationsgerät aus Edelstahl 16201 durchführen. Dieses Gerät hat sich seit vielen Jahren in allen Bereichen der mikrobiologischen Anwendung bewährt. Dieses Gerät wird seit vielen Jahren für mikrobiologische Kontrolluntersuchungen eingesetzt. Es wird durch Abflammen des Innenkegels sterilisiert. Dadurch wird das Arbeiten mit dem Gerät vereinfacht und die Untersuchungen sind schneller durchzuführen. Die Filtrationsgeräte werden auf Saugflaschen oder im Routinebetrieb auf Mehrfachabsaugvorrichtungen aufgesetzt. Zur Erzeugung von Unterdruck wird entweder eine Wasserstrahlpumpe (16611) oder eine Laborpumpe (16692) verwendet. Das Unterteil des Filtrationsgerätes wird mit Hilfe eines Stopfens auf eine Saugflasche gesetzt. Diese wird über einen Vakuumschlauch (16623) und eine Woulff’sche Flasche (16610) mit der Laborpumpe verbunden. Bei Verwendung einer Wasserstrahlpumpe entfällt die Woulff’sche Flasche. Der Hahn im Unterteil des Gerätes wird geöffnet und die Pumpe in Betrieb gesetzt. Mit dem Bunsenbrenner wird der Filtertisch abgeflammt. Dabei wird die Flamme auch durch die Metallfritte gesaugt. Es wird nur so lange abgeflammt, bis das sich an der Oberfläche bildende Schwitzwasser wieder verschwunden ist. Nach Abflammen der unteren Seite des Aufsatzes wird dieser auf den Filtertisch aufgesetzt. Anschließend wird der Aufsatz innen spiralförmig abgeflammt, der Hahn verschlossen und der Deckel aufgesetzt. Jetzt kann das Membranfilter in das Gerät eingelegt werden. Es wird mit einer sterilen Pinzette auf den Filtertisch aufgelegt. Empfohlene Geräte, Filter und Nährkartonscheiben Der Aufsatz wird wieder aufgesetzt und mit dem Hebelverschluss verschlossen. Nachdem die zu untersuchende Probe in das Filtrationsgerät überführt wurde, wird der Hahn im Unterteil geöffnet und die Filtration durchgeführt. entweder 16611 Wasserstrahlpumpe mit 3" Gewindeanschluss oder 16612 Laborpumpe für Unterdruck, 220 V, 50 Hz, zusammen mit Die in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen wasserunlöslichen Schwebstoffe lagern sich auf der Oberfläche des Membranfilters ab und behindern dadurch die Entwicklung des Kolonienwachstums. Durch eine Vorfiltration unter Zuhilfenahme des Zusatzgerätes, (kann mit der Filtration in einem Arbeitsgang durchgeführt werden), lässt sich eine Abtrennung der Schwebstoffe auf dem bakteriologischen Vorfilter und damit eine ungestörte Kultivierung der Keime erreichen. 16201 Filtrationsgerät aus Edelstahl für Unterdruck 47/50 mm, 500 ml 16672 Saugflasche, 2 Liter 17173 Gummistopfen für 16201, 16219, 16220 auf 16672 16610 Woulff’sche Flasche, 500 ml 3+ 16623 Gummi-Vakuumschlauch (1 m) 16625 Edelstahlpinzette 16807 Zusatz zur Vorfiltration aus Edelstahl, zur Abscheidung wasserunlöslicher Feststoffe in einem Arbeitsgang 11301.050ACN Zellulosenitrat Vorfilter, weiß, 8 μm, 50 mm, (100 St.) Bei Verwendung dieser Ausrüstung empfehlen wir Nährkartonscheiben mit einem Durchmesser von 50 mm: 14095.050 N Endo-Würze-Standard Nährkartonscheiben für Schulkit in Petrischalen mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St. gemischt) 14053.050 N Endo Nährkartonscheiben, für E. coli und Coliforme, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) 140 55.050 N Standard-Nährkartonscheiben für Koloniezahl, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) Zusatzgerät zur Vorfiltration 16807 140 58.050 N Würze Nährkartonscheiben für Hefen und Schimmelpilze, in Petrischalen, mit einzeln verpackten Filtern, steril (100 St.) Filtrationsgerät aus Edelstahl 16201, 500 ml Aufgussraum und Zusatzgerät zur Vorfiltration 16807 21 Sartorius Stedim Biotech GmbH August-Spindler-Straße 11 37079 Göttingen Telefon 0551.308.0 Fax 0551.308.3289 www.sartorius-stedim.com Technische Änderungen vorbehalten. Printed in Germany. Gedruckt auf chlorfrei gebleichtem Papier W/sart-231 Publication No.: SM-6044-d11054 Order No.: 80830-000-55 Ver. 05 | 2011