Phagozytose Von Nekrotischen Zellen Durch Gesunde Haut

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Phagozytose von nekrotischen Zellen durch gesunde HautFibroblasten und Tumorzellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät Der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Manuela Schwegler aus München Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2016 Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms Gutachter/in: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn Prof. Dr. Rainer Fietkau ii Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... 6 Abbildungsverzeichnis ........................................................................................... 8 Tabellenverzeichnis ............................................................................................... 10 Zusammenfassung ................................................................................................ 11 Abstract.................................................................................................................... 14 1. 2. Einleitung.......................................................................................................... 16 1.1. Formen von Zelltod ................................................................................ 16 1.1.1. Apoptose ................................................................................................. 17 1.1.2. Primäre und sekundäre Nekrose .......................................................... 17 1.1.3. Regulierte Nekrose................................................................................. 18 1.1.4. Autophagischer Zelltod .......................................................................... 19 1.1.5. Immunogenität der Zelltodesformen ..................................................... 19 1.2. Endozytose.............................................................................................. 21 1.2.1. Pinozytose ............................................................................................... 21 1.2.2. Phagozytose ........................................................................................... 22 1.3. Beseitigung sterbender Zellen durch Professionelle Phagozyten ..... 23 1.3.1. Phagozytose apoptotischer Zellen........................................................ 24 1.3.2. Phagozytose nekrotischer Zellen .......................................................... 25 1.4. Nicht-professionelle Phagozyten und Zell-in-Zell Phänomene .......... 25 1.4.1. Nicht-professionelle Phagozyten und Zell-Kannibalismus ................. 26 1.4.2. Emperipolese .......................................................................................... 27 1.4.3. Entose...................................................................................................... 28 1.5. Zielsetzung .............................................................................................. 28 Material und Methoden .................................................................................. 30 2.1. Verwendete Zelllinien, Reagenzien, Geräte und Verbrauchsmaterial 30 1 2.2. Zellkultur .................................................................................................. 36 2.2.1. Kultivierungsbedingungen ..................................................................... 36 2.2.2. Passage und Konservierung von Zellen .............................................. 36 2.2.3. Transfektion ............................................................................................ 37 2.2.4. Nukleosid-Inkorporation ......................................................................... 37 2.3. Induktion und Inhibition von nicht-professioneller Phagozytose ........ 38 2.3.1. Inaktivierung von Zellen durch Hitzeeinwirkung .................................. 38 2.3.2. Proliferationspotenzial von Hitze-behandelten Zellen......................... 38 2.3.3. Vitalfärbung ............................................................................................. 39 2.3.4. Phagozytose von hyperthermierten Zellen .......................................... 40 2.3.5. Inhibition der Phagozytose von Hitze-behandelten Zellen ................. 41 2.3.6. Funktionale Blockade von E-und P-Cadherin...................................... 42 2.3.7. Behandlung mit Annexin V zur Blockade von Phosphatidylserin ...... 42 2.3.8. Phagozytose von bestrahlten Zellen .................................................... 43 2.3.9. Beobachtung der Phagozytose-Ereignisse über die Zeit ................... 44 2.3.10. Erstellung der Objektträger nach der Koinkubation ............................ 45 2.3.11. Quantifizierung der Phagozytose-Raten .............................................. 45 2.4. Durchflusszytometrie.............................................................................. 46 2.4.1. Bestimmung der Zellmorphologie und Zellviabilität............................. 46 2.4.2. Messung der Zell-Adhäsion ................................................................... 48 2.5. Messung der Konzentration der zellulären Proteine aus Zelllysaten und von freigesetztem HSP70 nach Hyperthermie ........................................... 49 2.6. Immunfluoreszenz-Färbung................................................................... 50 2.6.1. Färbe-Verfahren ..................................................................................... 51 2.6.2. Quantifizierung der Lokalisation von Phagozytose-assoziierten Proteinen ............................................................................................................... 51 2.7. Immunhistochemie ................................................................................. 52 2 2.7.1. Auswahl von Gewebeproben ................................................................ 52 2.7.2. Färbung von histologischen Schnitten ................................................. 52 2.7.3. Quantifizierung von Phagozytose-Raten in histologischen Präparaten 53 3. 2.8. Mikroskopie ............................................................................................. 53 2.8.1. Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie.................................... 53 2.8.2. Konfokale Mikroskopie ........................................................................... 54 2.8.3. Lebendzell-Mikroskopie ......................................................................... 54 2.9. Messung der Genexpression ................................................................ 54 2.9.1. RNA-Isolation und reverse Transkription ............................................. 54 2.9.2. Quantitative PCR .................................................................................... 55 2.10. Statistik .................................................................................................... 55 Ergebnisse ....................................................................................................... 57 3.1. Nachweis der Phagozytose ................................................................... 57 3.2. Induktion von Nekrose und Phagozytose............................................. 59 3.2.1. Hyperthermie........................................................................................... 59 3.2.2. Bestrahlung ............................................................................................. 61 3.3. Phagozytose von hyperthermierten Zellen .......................................... 63 3.3.1. Quantifizierung der homotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen...................................................................................... 63 3.3.2. Quantifizierung der heterotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen...................................................................................... 65 3.3.3. Protein-Verlust und Freisetzung von HSP70 durch Hyperthermie .... 66 3.3.4. Einfluss von freigesetzten DAMPs und FBS auf die Phagozytose .... 67 3.3.5. Aufnahme von nekrotischen Zellen durch angewachsene Zellen ..... 68 3.4. Phagozytose von bestrahlten Zellen und nekrotischer Debris ........... 69 3.4.1. Quantifizierung der homotypischen und heterotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen............................................. 70 3 3.4.2. Aufnahme nekrotischer Debris .............................................................. 71 3.5. Einfluss von Hyperthermie auf die Zelladhäsion und Phagozytose .. 72 3.5.1. Mikroskopischer Nachweis der Adhäsion ............................................ 72 3.5.2. Nachweis der Hyperthermie-induzierten Adhäsion mittels Durchflusszytometrie ........................................................................................... 73 3.5.3. Phagozytose-Raten in Abhängigkeit der induzierten Adhäsion ......... 75 3.6. Lokalisation von Zell-in-Zell-assoziierten Proteinen............................ 75 3.6.1. Lokalisation von E-Cadherin.................................................................. 76 3.6.2. Verdichtung von F-Aktin......................................................................... 76 3.6.3. Akkumulation von LAMP1 und LC3 ...................................................... 78 3.6.4. Quantifizierung der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine im Zeitverlauf . 79 3.6.5. Lokalisation der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine bei angewachsenen Zellen 80 3.7. Inhibition der molekularen Maschinerie der nicht-professionellen Phagozyten ........................................................................................................... 81 4. 3.7.1. Einfluss von Bestrahlung, Proteasen und Zytoskelett-Inhibitoren ..... 81 3.7.2. Blockade des E- und P-Cadherin vermittelten Zellkontakts ............... 83 3.7.3. Quantifizierung der Dosis-Relation von Annexin V ............................. 87 3.8. Expression von Phagozytose-assoziierten Genen.............................. 88 3.9. Degradation der inkorporierten Zelle .................................................... 90 3.10. Zell-in-Zell Strukturen im Gewebe ........................................................ 95 Diskussion...................................................................................................... 102 4.1. Phagozytose-Induktion durch Hyperthermie...................................... 102 4.2. Phagozytose-Induktion durch Röntgenstrahlung .............................. 105 4.3. Rekrutierung Phagozytose-assoziierter Proteine .............................. 106 4.4. Zelltod der inkorporierten Zelle ........................................................... 107 4.5. Nicht-professionelle Phagozytose versus professionelle Phagozytose 109 4 4.6. Nicht-professionelle Phagozytose versus Kannibalismus ................ 111 4.7. Nicht-professionelle Phagozytose versus Entose ............................. 112 4.8. Prognostischer Wert von Zell-in-Zell Strukturen bei Krebserkrankungen ............................................................................................ 113 4.9. Schlussfolgerung und Ausblick ........................................................... 115 5. Literaturverzeichnis ...................................................................................... 118 6. Anhang – Ergänzende Tabellen ................................................................. 128 7. Danksagung ................................................................................................... 132 8. Lebenslauf ...................................................................................................... 133 9. Publikationsliste............................................................................................ 134 5 Abkürzungsverzeichnis 7-AAD 7-Aminoactinomycin Aqua dest. Bidestilliertes Wasser ATP Adenosintriphosphat AnxA5 Annexin A5 BrdU 5-Brom-2’-desoxyuridin BSA Rinderserumalbumin c Konzentration CD cluster of differentiation cDNA copy DNA CIC Zell-in-Zell Struktur (cell-in-cell) CTFR celltrace far red CTOG celltrace oregon green DAMP damage-associated molecular pattern DAPI 4’,6-Diamidin-2-Phenylindol DCs Dendritische Zellen (dendritic cells) DMEM Dulbecco’s modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DNS Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat EdU 5-Ethynyl-2’-Desoxyuridin F-Aktin filamentöses Aktin, Aktinfilamente FBS Fötales Rinderserum (fetal bovine serum) FITC Fluoreszeinisothiocyanat GFP green fluorescent protein GTP Guanosintriphosphat H2B-RFP Histon H2B-red fluorescent protein HNSCC Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen (head and neck squamous cell carcinoma) HSP Hitzeschockprotein HT Hyperthermie Ig Immunglobulin IL Interleukin LAMP 1 lysosomal-associated membrane protein 1 6 LAP LC3 – assoziierte Phagozytose LC3 microtubule-associated protein 1 light chain 3 LSM laser scanning microscopy MeOH Methanol PAMP pathogen associated molecular patterns PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered sa- line) PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) p-Ezrin Ezrin, phosphoryliert PS Phosphatidylserin qRT-PCR quantitative Echtzeit-PCR RT Raumtemperatur RAGE receptor for advanced glycation end products RFP red fluorescent protein TAM Tumor-assoziierte Makrophagen TBS Tris-gepufferte Salzlösung (tris buffered saline) TLR toll like receptor TMA Tissue-Microarray TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan β-Me beta-Mercaptoethanol 7 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Punktewolkendiagramm zur Darstellung von Zellgröße und Granularität ....................................................................................................... 47 Abbildung 2: Durchflusszytometrische Messung zum Nachweis von Apoptose, Nekrose und Zellaggregaten ............................................................................. 48 Abbildung 3: Messung der Adhäsion ................................................................ 49 Abbildung 4: Nachweis der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie ........................................................... 58 Abbildung 5: Nachweis der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit Fluoreszenz- und Lebendzell-Mikroskopie ........................................................ 59 Abbildung 6: Analyse der Induktion der Zelltodesformen Apoptose und Nekrose nach Hyperthermie............................................................................................ 60 Abbildung 7: Koloniebildungspotenzial nach Hitze-Behandlung ....................... 61 Abbildung 8: Induktion von Zelltod bei mehreren Zelllinien durch Bestrahlung und Hitze-Behandlung ...................................................................................... 62 Abbildung 9: Phagozytose von apoptotischen Zellen nach Bestrahlung ........... 63 Abbildung 10: Homotypische Phagozytose-Raten von verschiedenen Zelllinien .......................................................................................................................... 64 Abbildung 11: Heterotypische Phagozytose-Raten von verschiedenen Zelllinien .......................................................................................................................... 65 Abbildung 12: Einfluss von Hyperthermie auf die Gesamt-Protein-Konzentration und die Freisetzung von HSP70 ....................................................................... 67 Abbildung 13: Phagozytose-Raten nach Entfernung von freigesetzten DAMPs durch Induktion primärer Nekrose und nach FBS-Mangel ................................ 68 Abbildung 14: Phagozytose-Ereignisse bei angewachsenen Zellen ................. 69 Abbildung 15: Vergleich der Phagozytose-Raten von hyperthermierten und bestrahlten Zellen bei verschiedenen Zelllinien ................................................ 70 Abbildung 16: Phagozytose von nekrotischer Debris ........................................ 72 Abbildung 17: Verstärktes adhäsives Verhalten gegenüber hyperthermierter Zellen ................................................................................................................ 73 Abbildung 18: Durchflusszytometrische Messung der Adhäsion bei mehreren Zelllinien ............................................................................................................ 74 Abbildung 19: Hyperthermie-Behandlung induziert eine verstärkte Bindung zwischen phagozytischen und hyperthermierten Zellen.................................... 74 8 Abbildung 20: Phagozytose-Raten in Abhängigkeit von HyperthermieBehandlung ....................................................................................................... 75 Abbildung 21: Verdichtung von E-Cadherin bei der Phagozytose..................... 76 Abbildung 22: Verdichtung von F-Aktin und p-Ezrin bei der Phagozytose ........ 77 Abbildung 23: Lokalisation von LAMP1 und LC3 .............................................. 79 Abbildung 24: Quantifizierung der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine................. 80 Abbildung 25: Lokalisation der Phagozytose-assoziierten Proteine bei angewachsenen Zell-in-Zell Strukturen............................................................. 81 Abbildung 26: Phagozytose-Raten nach Bestrahlung und Behandlung der phagozytiertenden Zellen mit Protease- und Zytoskelett-Inhibitoren ................ 82 Abbildung 27: Expression und Lokalisation von E-Cadherin auf vitalen, hyperthermierten Zellen und Phagozytose-Ereignissen.................................... 84 Abbildung 28: Expression und Lokalisation von P-Cadherin auf vitalen, hyperthermierten Zellen und Phagozytose-Ereignissen.................................... 85 Abbildung 29: Einfluss funktioneller Blockade von E- und P-Cadherin auf Adhäsion und Phagozytose .............................................................................. 87 Abbildung 30: Dosis-abhängige Inhibition der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit Annexin V ............................................................. 88 Abbildung 31: Relative mRNA-Konzentrationen von Phagozytose-relevanten Genen ............................................................................................................... 89 Abbildung 32: Beobachtung von Degradation nach Phagozytose, Teil 1.......... 92 Abbildung 33: Beobachtung von Degradation nach Phagozytose, Teil 2.......... 93 Abbildung 34: Nachweis von lysosomalem Zelltod der internalisierten Zelle .... 94 Abbildung 35: Nachweis von Zell-in-Zell Strukturen in Gewebeschnitten ......... 96 Abbildung 36: Zell-in-Zell Strukturen im Gewebeschnitt ................................... 97 Abbildung 37: Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen bei verschiedenen Krebserkrankungen........................................................................................... 98 Abbildung 38: Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen in verschiedenen Krebserkrankungen im Vergleich .................................................................... 100 Abbildung 39: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier ..................................... 101 Abbildung 40: Modell zur nicht-professionellen Phagozytose ......................... 116 9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Humane Zelllinien .................................................................................. 30 Tabelle 2: Oligonukleotide ....................................................................................... 30 Tabelle 3: Reagenzien ............................................................................................. 31 Tabelle 4: Antikörper ................................................................................................ 32 Tabelle 5: Sekundär-Antikörper .............................................................................. 33 Tabelle 6: Verbrauchsmaterial ................................................................................ 33 Tabelle 7: Geräte...................................................................................................... 34 Tabelle 8: Puffer und Lösungen.............................................................................. 35 Tabelle 9: Kulturmedien........................................................................................... 36 Tabelle 10: Kombination von Zelllinien bei der heterotypischen Phagozytose .. 40 Tabelle 11: Versuchsansätze zur Untersuchung des Zeitverlaufs nach Phagozytose ............................................................................................................. 44 Tabelle 12: Induktion von Zelltod durch Bestrahlung ........................................... 70 Tabelle 13: Klinische Daten der Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen, Teil 1 .. 128 Tabelle 14: Klinische Daten der Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen, Teil 2 .. 129 Tabelle 15: Klinische Daten der Rektum- und Analkarzinom Kohorten............ 130 Tabelle 16: Überleben der Patienten ................................................................... 131 10 Zusammenfassung Die zeitnahe Phagozytose von apoptotischen und nekrotischen Zellen verhindert den Eintritt von sekundärer Nekrose und die Induktion von Entzündungsreaktionen und Autoimmunerkrankungen. Die Phagozytose-Aktivität von benachbarten Zellen, welche sterbende Zellen aufnehmen, kommt dann zum Einsatz, wenn die effiziente Phagozytose-Kapazität von professionellen Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, nicht ausreicht bzw. zu wenige dieser Zellen in kürzester Zeit in das betroffene Gewebe einwandern können. Die Phagozytose-Fähigkeit verschiedener Zelltypen und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind noch nicht vollständig untersucht. Insbesondere für die Aufnahme nekrotischer Zellen durch benachbarte Zellen liegen nicht viele Studien vor. Phagozytose-Ereignisse von Tumorzellen in Tumorgewebeschnitten, sog. Zell-Kannibalismus, gleichen den Zell-in-Zell Strukturen, die bei der Beseitigung nekrotischer Zellen durch nicht-professionelle Phagozyten entstehen. Sie weisen ebenfalls einen sichelförmigen und an die Peripherie gedrängten Zellkern der äußeren Zelle und eine runde Form der aufgenommenen Zelle auf und stellen ein häufig dokumentiertes Ereignis in histologischen Untersuchungen dar. Studien über eine prognostische Relevanz von Zell-in-Zell Strukturen sind aber bislang aufgrund kleiner Kohorten-Größen weniger aussagekräftig und im Vergleich zudem widersprüchlich. In dieser Arbeit sollte die Phagozytose-Kapazität mehrerer Zelltypen getestet, molekulare Mechanismen sowie eine prognostische Rolle von Zell-in-Zell Strukturen in Tumorgewebeschnitten von 83 Patienten mit Rektumkarzinom und von 321 Patienten mit Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom untersucht werden. Um dies zu erreichen wurde zunächst die Fähigkeit zur homotypischen und heterotypischen Aufnahme nekrotischer Zellen bei verschiedenen Zelltypen getestet, inklusive Pankreaskarzinom-Zellen, mehrere morphologisch divergente Glioblastom-Zelllinien, eine primäre Kopf-Hals-Tumorzelllinie, primäre, gesunde Hautfibroblasten, semi-adhärente Nierenepithelzellen, T-Zell-Leukämiezellen sowie lymphoblastoide Zellen. Als Phagozytose-fähig wurden von diesen untersuchten Zelllinien alle adhärenten Zelllinien identifiziert. ImmunfluoreszenzFärbungen zeigten, dass die Phagozytose-Aktivität von einer Akkumulation des Adhäsionsmoleküls E-Cadherin, von phosphoryliertem Ezrin, dem Autophagie- 11 Marker Mikrotubuli-assoziierten Protein LC3 (light chain 3) sowie des Lysosomen-assoziierten Membranproteins LAMP1 begleitet wurde. Die Hitze-behandelten, nekrotischen Zellen wiesen einen Verlust der Integrität der Zellmembran sowie eine zytoplasmatische Anhäufung von LC3-positiven Vesikeln und eine Zunahme der intrazellulären HSP70-Konzentration auf und wurden von lebenden Zellen in Suspension oder wenn letztere angewachsen waren, phagozytiert. Funktionelle Analysen zeigten, dass die Phagozytose-Aktivität der nichtprofessionellen Phagozyten abhängig von einer dynamischen Reorganisation des Zellskeletts (Aktinfilamente und Mikrotubuli), der GTPase Aktivität von Dynamin II und der Erkennung von Phosphatidylserin ist. Durch histologische Untersuchungen anhand von Tumorgewebeschnitten von Patienten mit Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom oder Rektumkarzinom wurde eine prognostische Relevanz von Zell-in-Zell Strukturen nachgewiesen. Niedrige Häufigkeiten von Zell-in-Zell Strukturen korrelierten mit einem längeren Überleben. Das histologische Material von 23 Patienten mit Analkarzinom bestätigte ebenfalls das häufige Vorkommen von Zell-in-Zell Strukturen. Die Quantifizierung erfolgte nach immunhistologischer Färbung für E-Cadherin (Membran) und Gegenfärbung mit Hämatoxylin (Zellkerne). Zusätzlich wurde die Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen mit apoptotischen Zellen mittels Färbung von aktivierter Caspase 3 analysiert. Die Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen rangierte zwischen 0,7 und 17,3 Ereignissen pro mm2, wohingegen kaum Zell-in-Zell Strukturen mit apoptotischen Zellen nachgewiesen wurden. Der prognostischen Relevanz von Zell-in-Zell Ereignissen könnten eine veränderte Tumorimmunität und Immunzell-Infiltration sowie ein niedrigeres Metastasierungs-Risiko zugrunde liegen. Wenn Zell-in-Zell Strukturen in verschiedenen Tumorentitäten eine bedeutende Rolle im Tumormilieu spielen, wie es in dieser Arbeit für Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome und Rektumkarzinome gezeigt wurde, könnten sie auch bei der Erforschung neuer Behandlungsmodalitäten berücksichtigt werden. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die Phagozytose nekrotischer Zellen von verschiedenen Tumorzelllinien sowie gesunden Hautfibroblasten ausgeführt wird und dadurch die Phagozytose-Aktivität von professionellen Phagozyten unterstützt. Dieser Prozess verhindert die Freisetzung von proinflammatorischen Gefahrensignalen und verringert so Entzündungsreaktionen 12 und das Risiko für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Auch im Tumor werden ähnliche Zell-in-Zell Strukturen gefunden, deren Häufigkeit von prognostischer Relevanz ist. 13 Abstract Rapid removal of apoptotic and necrotic cells prevents secondary necrosis and the induction of autoimmune diseases and inflammation. The phagocytic activity of neighboring cells, which engulf dying cells, may occur if the amount of dying cells exceeds the phagocytic capacity of professional phagocytes such as dendritic cells and macrophages or if the number of immediately recruited phagocytes into the tissue is not sufficient. The scope of this study was the investigation of phagocytosis-capable cell types as well as the molecular background of the engulfment process of primary necrotic cells by neighboring tumor cells and normal skin fibroblasts. The removal of necrotic cells by non-professional phagocytes remains poorly characterized. Phagocytic events of tumor cells have frequently been observed in tumor tissue sections and were named cell cannibalism. These cell-in-cell structures resemble the phagocytic events that result from the clearance of necrotic cells by nonprofessional phagocytes studied herein: The round-shaped inner cell is totally encircled by the host cell membrane and the semilunar host cell nucleus is pushed to the periphery. It has been proposed that cell cannibalism could be used as prognostic factor but these studies are conflicting, postulating a tumorpromoting and metastasis-protecting role and restricted by the lack of large cohorts. In this study, we investigated the phagocytic capacity of several cell types, molecular mechanisms as well as the prognostic role of tumor cell cannibalism in tumor tissue sections of 83 patients with rectum carcinoma and 321 patients with head and neck squamous cell carcinoma. To achieve this the phagocytic activity regarding the homotypic and heterotypic engulfment of necrotic cells by several cell types including primary fibroblasts, pancreatic adenocarcinoma, glioblastoma and head and neck cancer cells, semi-adherent embryonic kidney cells, leukemic T-cells and lymphoblastoid cells was studied. Exclusively all adherent cell lines were capable for the engulfment of necrotic cells. Using immunofluorescence staining an accumulation of adhesion molecule E-cadherin, phosphorylated actin-linker protein ezrin, lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1) and microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) at the site of engulfment were observed. 14 Heat-treated, necrotic cells exhibited loss of cellular membrane integrity and increase of the intracellular level of heat-shock protein 70 and LC3-positive vesicles and were engulfed by untreated, phagocytic cells in suspension or if the phagocytic cells were adhered. Functional analyses revealed that nonprofessional phagocytes require dynamic rearrangement of the cytoskeleton (actin and microtubules), recognition of phosphatidylserine and GTPase activity of dynamin II, which normally mediates endocytosis. Histologic examination of tumor tissue sections of patients with head-and-neck cancer or rectal cancer revealed a prognostic relevance of cell-in-cell structures. Low frequencies of cell-in-cell structures correlated with better survival rates. Additionally, analysis of tumor tissues sections of 23 patients with anal carcinoma confirmed high abundance of these events in the tissue. Cell-in-cell structures were observed in all of the cohorts with a frequency ranging from 0.7 to 17.3 cell-in-cell events per mm2. Quantification was performed after immunohistochemically staining of the samples for E-cadherin (cell membranes) and counterstaining with hematoxylin (nuclei). Additionally, analysis of the frequency of cell-in-cell structures containing apoptotic cells after staining for cleaved caspase-3 showed that hardly any apoptotic cells were engulfed by tumor cells. These observations regarding the prognostic value of cell-in-cell structures raise the possibility that this process has a physiological relevance in tumors regarding tumor immunity, immune cell infiltration and metastatic disease. Future work will have to address whether cell-in-cell events render the tumor milieu in a way that affects patients’ outcome and if it might be used to guide treatment strategies. In conclusion, these study shows that removal of necrotic cells is a feature common to several types of tumor cells as well as normal skin fibroblasts. It is likely that the phagocytic activity by non-professional phagocytes contributes to the efficient dead cell clearance by macrophages and other professional phagocytes. This process diminishes the release of proinflammatory damageassociated molecular pattern molecules and therefore prevents inflammation and autoimmune disease. Moreover, similar cell-in-cell structures in tumor tissue are prognostic relevant. 15 1. Einleitung 1.1. Formen von Zelltod Der Zelltod ist ein essentieller Prozess, der zur Erhaltung der zellulären Homöostase in vielzelligen Organismen beiträgt. Es gibt verschiedene Modalitäten des Zelltodes, die durch extrinsische oder intrinsische Signale bzw. physikalische Einflüsse ausgelöst werden. Die einzelnen Zelltodesformen unterscheiden sich nicht nur in ihrer Morphologie sondern auch in ihrer Wirkung auf Zellen des Immunsystems. Nach Definition des Nomenklatur-Komitees für Zelltod gilt für die Identifizierung von toten Zellen, dass ein irreversibler Verlust der BarriereFunktion der Zellmembran vorliegen muss und zusätzlich die Auflösung der Zelle in Vesikel (apoptotische Körperchen) oder die Aufnahme von toten Zellen durch phagozytische Zellen stattfinden muss (Galluzzi, Maiuri et al. 2007, Kroemer, Galluzzi et al. 2009, Galluzzi, Vitale et al. 2012). Nachdem jedoch gezeigt werden konnte, dass aufgenommene Zellen unter bestimmten Umständen lebend den Phagosomen entkommen können (Overholtzer, Mailleux et al. 2007), wurde die Definition für Zelltod erweitert. Demzufolge gelten Zellen nur dann als tot, wenn entweder eine irreversible Permeabilität der Zellmembran oder eine vollständige Fragmentierung der Zelle vorliegt. Weiterhin werden die Zelltodes-Modalitäten in zwei Kategorien unterschieden, den passiven, nichtregulierten Zelltod (accidental cell death) und den regulierten Zelltod (regulated cell death). Zur Gruppe des regulierten Zelltods zählt auch der programmierte Zelltod (programmed cell death), der den eintretenden Zelltod bei der Embryonal-Entwicklung, bei der Erhaltung der Homöostase im Gewebe und der Immunantwort beschreibt (Lettre and Hengartner 2006, Taylor, Cullen et al. 2008, Fuchs and Steller 2011, Delbridge, Valente et al. 2012, Galluzzi, Bravo-San Pedro et al. 2015). Der passive, nicht-regulierte Zelltod wird durch Einflüsse, wie physikalische (erhöhte Temperaturen oder Druck), chemische (Detergenzien, Veränderungen des pH-Wertes) und mechanische (Scherkräfte) Stimuli verursacht und bedient sich keiner molekularen Maschinerie, sodass diese Form von Zelltod weder durch pharmakologische noch genetische Interventionen verhindert werden kann (Green and Kroemer 2005, Reed 2006, MacFarlane 2009, Long and Ryan 2012). Der regulierte Zelltod hingegen wird von einer genetisch kodierten, molekularen Maschinerie ausgeführt (Galluzzi, Vitale et al. 2012, Galluzzi, Kepp et al. 2014). 16 1.1.1. Apoptose Die Apoptose ist eine programmierte Form des Zelltods und stellt den am häufigsten eintretenden biologischen Mechanismus zur Erhaltung der Homöostase in vielzelligen Organismen dar und ist außerdem essentiell für die embryonale Entwicklung. Sie wird durch extrazelluläre oder intrazelluläre Signale induziert. Man spricht auch von der extrinsischen und intrinsischen Apoptose. Die extrinsische Apoptose wird durch extrazelluläre Stress-Signale ausgelöst, welche die Zelle via Transmembranrezeptoren empfängt. Beispiele für auslösende Signale sind die Bindung von Todesliganden (FasL/CD95L, TNFα, TRAIL) an Todesrezeptoren (Fas/CD95, TNFα-Rezeptor, TRAILR1-2) (Wajant 2002, Schutze, Tchikov et al. 2008). Eine andere Art von Rezeptoren (dependence receptors) leitet die Apoptose ein, wenn die Bindung an ihre spezifischen Liganden unter eine kritische Konzentration fällt (Mehlen and Bredesen 2011). Die extrinsische Apoptose resultiert immer in der Aktivierung von Caspase 3 und gilt somit als Caspase-abhängige Apoptose, wohingegen die intrinsische Apoptose zusätzlich auch Caspase-unabhängig vollzogen werden kann (Yuan and Horvitz 1990, Chautan, Chazal et al. 1999, Daish, Mills et al. 2004). Zu den intrazellulären Signalen, welche die Apoptose induzieren zählen u.a. DNA-Schäden, oxidativer Stress und Anhäufung von denaturierten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum. Eine weitere Kondition, welche Apoptose hervorruft, gilt speziell für adhärente Zellen. Diese gehen in Apoptose, wenn sie von der extrazellulären Matrix abgelöst werden (Frisch and Francis 1994). Die molekulare Maschinerie gleicht zumeist der intrinsischen Apoptose (Reginato, Mills et al. 2003). Apoptotische Zellen zeichnen sich durch Zell-Schrumpfung und ChromatinKondensation (Pyknose) aus (Kerr, Wyllie et al. 1972). In der späteren Phase des Zelltodes kommt es zur Bildung intrazellulärer Bläschen (membrane blebbing) und Fragmentierung des Zellkerns (Karyorrhexis). Zuletzt schnürt die Zelle apoptotische Körperchen ab (Elmore 2007). 1.1.2. Primäre und sekundäre Nekrose Der nekrotische Zelltod wird in die regulierte (siehe 1.1.3) und die nichtregulierte oder primäre Nekrose unterschieden. Die primäre Nekrose stellt eine passive Zelllyse dar, die durch extreme physikalische Einflüsse, welche die 17 Membranintegrität zerstören oder die intrazelluläre ATP-Konzentration reduzieren, hervorgerufen wird (Leist, Single et al. 1997). Des Weiteren kann nach induzierter Apoptose die sekundäre Nekrose eintreten, wenn die apoptotischen Körperchen nicht rechtzeitig durch professionelle Phagozyten beseitigt werden (Don, Ablett et al. 1977). Aufgrund der vorangegangenen Apoptose weisen sekundär nekrotische Zellen eine degradierte DNA auf, wohingegen primär nekrotische Zellen eine vollständig intakte DNA enthalten. Die übrigen morphologischen Charakteristika von nekrotischen Zellen sind eine permeable Zellmembran, vergrößerte Organellen, die Dissoziation der Ribosomen vom endoplasmatischen Retikulum und zuletzt der Zerfall der Kernmorphologie (Clarke 1990). 1.1.3. Regulierte Nekrose Die regulierte Nekrose gleicht morphologisch dem Erscheinungsbild der primären Nekrose und weist einen Verlust der Membran-Integrität sowie eine Größenzunahme der Organellen und eine intakte DNA auf. Es wurden inzwischen mehrere Zelltodes-Modalitäten von regulierter Nekrose identifiziert. Dazu zählen die Nekroptose, Parthanatos, Ferroptose oder Oxytose, MPT-abhängige Nekrose (mitochondrial permeability transition), Pyroptose und Pyronekrose und NETose. Letztere Todesform erhielt ihre Bezeichnung, weil sie den Zelltod beschreibt, der mit der Freisetzung neutrophiler extrazellulärer Fallen (neutrophil extracellular traps) aus Chromatin einhergeht. Bisher am besten erforscht ist die Nekroptose. Sie wird durch die Ligation von TNFα an den Rezeptor TNFR1 induziert und durch die Interaktion von RIPK3 (receptor interacting protein kinase 3) und seinem Substrat MLKL (mixed lineage kinase like pseudokinase) vermittelt (Cho, Challa et al. 2009, Zhang, Shao et al. 2009, Sun, Wang et al. 2012, Zhao, Jitkaew et al. 2012). Ähnlich der Induktion von Apoptose (siehe 1.1.1) kann die Nekroptose ebenfalls über die Bindung von anderen Todesliganden, wie FasL oder TRAIL, an Todesrezeptoren (Fas, TRAILR1, TRAILR2) induziert werden. Weil die Nekroptose ein Caspaseunabhängiger Zelltod-Mechanismus ist, geschieht dies vor allem dann, wenn die Apoptose aufgrund von Inhibition (vor allem von Caspase 8) oder Mutation nicht stattfinden kann (He, Wang et al. 2009, Kaiser, Upton et al. 2011). 18 1.1.4. Autophagischer Zelltod Die Autophagie beschreibt eine ausgeprägte Vakuolenbildung im Zytoplasma sterbender Zellen. Die Konversion von der zytoplasmatischen Form von LC3 (LC3-I, light chain 3) in ihre membranständige Form (LC3-II), die zur Membran der autophagischen Vesikel (Autophagosomen) rekrutiert wird, kann als Marker für die Induktion von Autophagie verwendet werden. Autophagosomen enthalten zytoplasmatisches Material oder sogar ganze Organellen. Bei der Verschmelzung dieser LC3-positiven autophagischen Vesikel mit Lysosomen kommt es zur autophagolysosomalen Degradation und damit schließlich zum Tod der Zelle. Doch nicht allein die Anzahl von Autophagosomen dient als Indikator für die autophagosomale Aktivität, sondern der dynamische Prozess von Autophagosomen-Bildung, Fusion mit Lysosomen und Abbau der autophagischen Substrate (autophagic flux). Es wurde gezeigt, dass Tumorzellen, die Apoptose-inkompetent sind, nach Behandlung mit Chemotherapeutika in den autophagischen Zelltod gehen (Fazi, Bursch et al. 2008). Die Funktion der Autophagie wurde aber zuerst als zytoprotektiv beschrieben. Sie wird in sterbenden Zellen als Stress-Antwort aktiviert und soll den Zelltod hinauszögern, sodass sich die Zelle regenerieren kann. Insbesondere bei Nährstoffmangel inhibiert die autophagische Maschinerie die Induktion von Apoptose, vermutlich durch die Bereitstellung zelleigener Metaboliten. Eine Hemmung der Autophagie verhindert dann nicht den Zelltod, sondern beschleunigt ihn stattdessen (Boya, Gonzalez-Polo et al. 2005). Daher ist der Begriff „autophagischer Zelltod“ nach Empfehlung des Nomenklatur-Komitees für Zelltod nur anzuwenden, wenn bei Inhibition von Autophagieassoziierten Proteinen, der Zelltod verhindert wird (Denton, Nicolson et al. 2012, Galluzzi, Vitale et al. 2012). 1.1.5. Immunogenität der Zelltodesformen Sterbende Zellen können durch die Freisetzung und Exposition von sog. Gefahrensignalen (DAMPs, damage associated molecular patterns) eine Entzündungsreaktion verursachen. DAMPs sind zelluläre Komponenten und Moleküle, die von sterbenden und gestressten Zellen exponiert oder freigesetzt werden und das Immunsystem alarmieren. Dazu zählen Zytokine und Alarmine, die vor allem von sterbenden Zellen produziert werden, wie IL-1α und IL-33, und die 19 S100 Proteine. Beispiele für intrazelluläre Komponenten, die als DAMPs wirken, sind u.a. Nukleinsäuren, Ribonukleoproteine, Histone, Proteine der HMGB Familie (high-mobility group box), Hitzeschockproteine, Calretikulin, filamentöses Aktin (F-Aktin) und ATP (Krysko, Garg et al. 2012). Nach der Bindung von DAMPs an spezifische Rezeptoren von Immunzellen (pattern recognition receptors), wird die Expression und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen in Gang gesetzt. Die Apoptose gilt dabei meist als nicht-inflammatorisch oder sogar antiinflammatorisch, da bei diesem Prozess keine oder nur sehr wenige intrazelluläre Bestandteile frei werden (Wickman, Julian et al. 2013). Die effiziente Beseitigung apoptotisch sterbender Zellen durch Makrophagen verhindert die Induktion von sekundärer Nekrose. Außerdem wird nach Phagozytose von apoptotischen Zellen nicht die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen angeregt (Savill and Fadok 2000). Makrophagen setzen sogar antiinflammatorische Zytokine wie IL-10 und TGFβ frei (Voll, Herrmann et al. 1997). Bei der Nekrose hingegen kommt es zur massiven Freisetzung von DAMPs, die immunstimulatorisch und proinflammatorisch wirken (Kaczmarek, Vandenabeele et al. 2013). Ein wichtiges Gefahrensignal aus der Proteinfamilie der Hitzeschockproteine ist HSP70. Hitzeschockproteine sind Chaperone, die für die korrekte Faltung von Peptidketten durch Stabilisierung sowie für die Ubiquitinierung von beschädigten Proteinen, was deren Abbau im Proteasom veranlasst, notwendig sind. Bei massiver Protein-Denaturierung aufgrund von zellulärem Stress, wie beispielsweise nach Hitzeschock, wird ihre Expression hochreguliert (Ashburner and Bonner 1979, Slater, Cato et al. 1981). Kommt es zum nekrotischen Zelltod und damit ihrer Freisetzung sind Hitzeschockproteine starke Aktivatoren von Antigen-präsentierenden Zellen, da sie durch ihre Funktion als Chaperone, gebundene Proteine an die phagozytischen Antigenpräsentierenden Zellen, wie dendritische Zellen (DCs), liefern. DCs, die diese HSP70-Peptidkomplexe phagozytiert haben, präsentieren sie auf MHC-II-Molekülen bzw. kreuzpräsentieren sie auf MHC-I-Molekülen. Aktivierte DCs wandern dann in die Lymphknoten ein und aktivieren in den T-ZellRegionen naive, Antigen-spezifische T-Zellen (Suto and Srivastava 1995). Die Aktivierung der zytotoxischen T-Zellen kann Entzündungsreaktionen und Nekrosen (Hodge, Guha et al. 2008) oder sogar autoreaktive Reaktionen hervorrufen (Silva, do Vale et al. 2008), da beim nekrotischen Zell-Zerfall viele Autoanti20 gene freiwerden. Außerdem können auf diese Weise zytotoxische T-Zellen, die gegen spezifische Tumorantigene gerichtet sind, aktiviert werden, wenn HSP70-Tumorantigen-Komplexe durch Rezeptor-vermittelte Endozytose von Antigen-präsentierenden Zellen aufgenommen und auf MHC-I-Molekülen kreuzpräsentiert werden (Huang, Golumbek et al. 1994, Arnold-Schild, Hanau et al. 1999). 1.2. Endozytose Die Endozytose beinhaltet die Einstülpung und Abschnürung der Zellmembran, sodass das gebundene Material vollständig von einer Vakuolenmembran umhüllt ist. Diese Vesikel werden als Endosomen bezeichnet. Man unterscheidet die Aufnahme von flüssigem, löslichem Material (Pinozytose) von der Aufnahme von größerem, festem Material (Phagozytose). Die bei der Pinozytose entstehenden Endosomen werden auch Makropinosomen genannt, die Endosomen der Phagozytose Phagosomen. Die Pinozytose wird meist mit der Endozytose gleichgesetzt und von der Phagozytose abgegrenzt, sodass in diesem Zusammenhang die Bezeichnung Endosom statt Makropinosom gebräuchlich ist. 1.2.1. Pinozytose Nach Abschnürung des Endosoms von der Zellmembran folgt die sequentielle Verschmelzung mit anderen Endosomen, sodass es zu einer fortschreitenden Azidifizierung innerhalb des Vesikels und zur Anreicherung von bestimmten Membranproteinen kommt. Frühe Endosomen weisen das Membranprotein RAB-5 auf, späte Endosomen RAB-7. Diese Proteine sind GTPasen und vermitteln die Fusion mit anderen Endosomen (Rink, Ghigo et al. 2005) und schließlich mit sauren Lysosomen, die positiv für die Membranproteine LAMP1 und LAMP2 sind (Luzio, Rous et al. 2000). Lysosomen enthalten Hydrolasen und Phosphatasen, die den enzymatischen Abbau des phagozytierten Materials herbeiführen und dadurch die Abtötung von aufgenommenen Pathogenen, die Beseitigung sterbender Zellen und die Bereitstellung von Nährstoffen für die Zelle bewirken. Über den Vorgang der Exozytose werden anschließend die zersetzten Partikel durch Fusion der Vesikel (Exosomen) mit der Zellmembran aus der Zelle ausgeschleust (Johnstone, Adam et al. 1987). 21 Wird die Endozytose durch Oberflächenrezeptoren induziert, handelt es sich um die Rezeptor-vermittelte Endozytose. Dabei entstehen membranöse Einstülpungen, die das Protein Clathrin enthalten (clathrin-coated pits) und zu Clathrinhaltigen Vesikeln (clathrin-coated vesicles) abgeschnürt werden. Daher wird diese Arte der Endozytose auch Clathrin-vermittelte Endozytose genannt (Pearse 1976, Goldstein, Anderson et al. 1979). Eine wichtige Rolle bei der Endozytose spielt das Protein Dynamin. Die Genvariante Dynamin II wird ubiquitär von allen Körperzellen exprimiert (Sontag, Fykse et al. 1994) und ermöglicht durch GTP-Bindung und -Hydrolyse die Abschnürung der Endosomen, insbesondere der Clathrin-haltigen Vesikel (Damke, Baba et al. 1994, Hinshaw 2000). 1.2.2. Phagozytose Die Erkennung von pro-phagozytischen Antigenen durch Oberflächenrezeptoren der Phagozyten induziert die Phagozytose. Ein Beispiel sind FcRezeptoren, die die Phagozytose von opsonisierten Partikeln stimulieren (siehe 1.3). Im Gegensatz zur Rezeptor-vermittelten Endozytose kommt es bei der Phagozytose nicht zum „Einsinken“ des aufzunehmenden Partikels in die Zelle, sondern zur Oberflächenvergrößerung der Zellmembran und zum Umschließen des aufzunehmenden Materials mit Zellfortsätzen (Lamellipodien). Das Material wird so in membranumhüllte Phagosomen ins Zytoplasma der Zelle aufgenommen. Die Reifung der Phagosomen erfolgt wie bei der Endozytose über RAB-5 und RAB-7 positive Stadien. Ein Unterschied liegt allerdings bei der GTPase Regulation vor, sodass die Aneignung der Endosomen-Marker weniger durch Fusion mit anderen Vesikeln zustande kommt, sondern mehr durch eigenständige Reifung der Phagosomen auftritt. Die zugrunde liegenden Mechanismen wurden bislang nicht bis ins Detail geklärt, jedoch wurde für die Rekrutierung von RAB-5 zum Phagosom eine Abhängigkeit von Dynamin identifiziert, das selbst bereits zum Beginn der Phagozytose zur Aufnahmestelle (phagocytic cup) transloziert wird (Kinchen, Doukoumetzidis et al. 2008). Zuletzt kommt es wie auch bei der Endozytose zur Fusion dieser Vesikel mit Lysosomen zu Phagolysosomen und das aufgenommene Material wird enzymatisch gespalten. Handelt es sich bei der phagozytischen Zelle um eine professionelle Antigenpräsentierende Zelle, insbesondere eine DC, werden anschließend einzelne 22 Antigene der abgebauten Partikel auf MHC-II-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert bzw. auf MHC-I-Molekülen kreuzpräsentiert, wodurch eine Antigenspezifische Immunantwort ausgelöst werden kann (den Haan, Lehar et al. 2000). Eine Voraussetzung für die Phagozytose ist ein dynamisches Aktin-Zytoskelett, das die Deformation der Zellmembran und die Formation der Lamellipodien ermöglicht (Pollard and Cooper 2009). Auch in diesem Zusammenhang wurde Dynamin eine Rolle als Verbindungsprotein zwischen Zellmembran und AktinZytoskelett zugeschrieben. Unter Ausbildung helikaler Polymere, die an Aktinbindende Proteine binden, sollen sie ein kontraktiles Gerüst zwischen Membran und Zellskelett bilden und damit einen wichtigen Faktor für die Phagozytose darstellen (Orth and McNiven 2003). Eine aktuellere Studie zeigte, dass bei Inhibition von Dynamin die Bildung von Lamellipodien bei Makrophagen mit einhergehender Destabilisierung der Aktinfilamente reduziert wurde (Yamada, Abe et al. 2009). Weitere Verbindungsproteine sind Proteine der Ezrin-Radixin-Moesin Familie. Sie sind an der Regulation der Adhäsion, Membran-Motilität und ZytoskelettReorganisation beteiligt. Die Phosphorylierung von Ezrin an Stelle T567 wird durch eine aktivierte Rho-Kinase ausgeführt, bevor Fibrillenbündel (stress fibers) und fokale Adhäsionen gebildet werden können (Matsui, Maeda et al. 1998). 1.3. Beseitigung sterbender Zellen durch Professionelle Phagozyten Professionelle Phagozyten werden Phagozytose-fähige Zellen genannt, die mit hoher Effizienz neben Mikroorganismen und Partikeln auch sterbende oder veränderte Zellen aufnehmen. Zu diesen zählen DCs, Makrophagen, Monozyten, Neutrophile und Mikroglia. Sie exprimieren verschiedene Rezeptoren (scavenger receptors), die Pathogen-spezifische Oberflächenmoleküle, opsonisierte Pathogene aber auch kommensale Bakterien und sterbende Zellen an spezifischen Oberflächenantigenen erkennen (Stuart and Ezekowitz 2005). Die Beseitigung apoptotischer Zellen verhindert den Eintritt der sekundären Nekrose (siehe 1.1.2). Die Phagozytose nekrotischer Zellen ist äußerst wichtig, da die freiwerdenden intrazellulären Moleküle bei der nekrotischen Zelllyse 23 schwere Erkrankungen, wie Autoimmunerkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen und Ischämie, hervorrufen können (Silva, do Vale et al. 2008). 1.3.1. Phagozytose apoptotischer Zellen Die Phagozytose von apoptotischen Zellen ist ein sehr häufiges Ereignis, da im menschlichen Körper täglich ca. 50 – 70 Mio Zellen apoptotisch sterben und ersetzt werden (Reed 2006). Durch die Ausschüttung von sogenannten “findme”-Signalen, wie geringe Konzentrationen von freigesetztem ATP und UTP, Fraktalkin, Lysophosphatidylcholin und Sphingosin-1-Phosphat induzieren apoptotische Zellen zunächst die Rekrutierung der professionellen Phagozyten (Gregory 2009). Danach erkennt der Phagozyt durch die Bindung an spezifische Rezeptoren pro-phagozytische Signale, die auf der Zellmembran der sterbenden Zelle exponiert werden, Diese Signale werden auch „eat-me“-Signale genannt und stimulieren die Phagozytose. Ein wichtiges pro-phagozytisches Signal, das die Phagozytose von apoptotischen Zellen induziert, ist die Exposition von Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Zellmembran. Die Asymmetrie von Zellmembranen geht bei der Apoptose aufgrund von fehlender Enzymaktivität der Phospholipid-Flippasen, welche in gesunden Zellen für die Lokalisation von PS auf der Innenseite der Membran sorgen, verloren (Fadok, Bratton et al. 1998). Die Erkennung von PS durch verschiedene PS-Rezeptoren stimuliert die Phagozytose der apoptotischen Zellen bzw. der apoptotischen Körperchen durch Makrophagen (Fadok, Voelker et al. 1992). Ein weiteres pro-phagozytisches Signal stellt eine modifizierte Glykosylierung der Zellmembran dar, die durch Lektine von phagozytischen Zellen erkannt werden (Dini, Carla et al. 1999). Die Bindung und Phagozytose von apoptotischen Körperchen durch Makrophagen wird außerdem durch den LPS-Rezeptor CD14, Scavenger-Rezeptor der Klasse A, Thrombospondin-Rezeptor CD36, dem Vitronektin-Rezeptor αvβ3, dem ABC1 Transporter und dem Makrophagen 61D3 Antigen induziert (Savill, Hogg et al. 1992, Flora and Gregory 1994, Luciani and Chimini 1996, Platt, Suzuki et al. 1996, Devitt, Moffatt et al. 1998). 24 1.3.2. Phagozytose nekrotischer Zellen Die Aufnahme von nekrotischen Zellen durch professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und Mikroglia-Zellen, wurde ebenfalls durch seine Abhängigkeit von der Erkennung von exponiertem PS charakterisiert (Hirt and Leist 2003). Die Tatsache, dass neben apoptotischen auch nekrotische Zellen PS auf der Zelloberfläche exponieren können, war zuvor unbekannt. Die genannte Studie lieferte den Beweis, indem die Zellen mit Biotin-gekoppeltem Annexin gefärbt und anschließend mit Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen inkubiert wurden. Dabei verhinderte die Größe dieser Kügelchen die Färbung von PS auf der Innenseite der Zellmembran, selbst bei geschädigter, perforierter Zellmembran. Ein weiteres pro-phagozytisches Signal für die Erkennung von nekrotischen Zellen ist F-Aktin. Dendritische Zellen exprimieren den Rezeptor DNGR-1, der an F-Aktin bindet und die Induktion der T-Zell-vermittelten Immunität gegen Antigene von sterbenden Zellen in Gang setzt (Ahrens, Zelenay et al. 2012). Als Rezeptor für Hitzeschockproteine, gp96 und Calretikulin gilt das von Makrophagen exprimierte Membranprotein CD91, das ebenfalls die Phagozytose von nekrotischen Zellen stimuliert (Basu, Binder et al. 2001). 1.4. Nicht-professionelle Phagozyten und Zell-in-Zell Phänomene Aber auch der Phagozytose-Aktivität von nicht-professionellen Phagozyten wird inzwischen eine wichtige Rolle zugeschrieben. Nicht-professionelle Phagozyten sind benachbarte Zellen, die sterbende Zellen aufnehmen, dabei aber in ihrer Effizienz und dem exprimierten Rezeptor-Repertoire von den professionellen Phagozyten abweichen. Im Zusammenhang mit der Aktivität von nichtprofessionellen Phagozyten steht der Mechanismus, der zur Internalisation von einer Zelle in eine andere Zell führt und den Begriff „Zell-in-Zell Formation“ (cellin-cell formation oder CIC formation) definiert (Medicine 2014). Diese Zell-inZell Phänomene wurden in Tumormaterial als Zell-Kannibalismus dokumentiert. Außerdem kommen diese Zell-in-Zell Strukturen neben der nicht- professionellen Phagozytose zur Aufnahme sterbender Zellen auch durch Internalisation von Lymphozyten in andere Zellen (Emperipolese) und der Invasion von einer Tumorzelle in eine andere Tumorzelle (Entose) zustande. 25 1.4.1. Nicht-professionelle Phagozyten und Zell-Kannibalismus Die Fähigkeit zur Beseitigung von apoptotischen, autophagischen oder nekrotischen Zellen wurde inzwischen bei verschiedenen Zelltypen wie vaskulären Myozyten (Kolb, Vranckx et al. 2007), Nierenepithelzellen (Ichimura, Asseldonk et al. 2008), Mesenchymzellen (Wood, Turmaine et al. 2000) und epithelialen Brustkarzinom-Zellen (Petrovski, Zahuczky et al. 2007) nachgewiesen. Als molekularer Mechanismus wurde in den erwähnten Studien die Bindung von exponiertem PS an PSRs, die von den nicht-professionellen Phagozyten exprimiert werden, nachgewiesen. Außerdem wurde die Aufnahme von Mikroorganismen durch nicht-professionelle Phagozyten auf die Expression von Fibronektin- und Laminin-Rezeptoren oder der Exposition von Heparan-Sulfaten zurückgeführt (Herrera, Ming et al. 1994). Ein großer Unterschied zwischen der PhagozytoseAktivität von professionellen und nicht-professionellen Phagozyten besteht darin, dass den nicht-professionellen Phagozyten die Expression von Fc- und Komplement-Rezeptoren fehlt. Die Phagozytose-Aktivität durch benachbarte Zellen, sogenannte nicht-professionelle Phagozyten, stellt kein Merkmal für bestimmte Tumorzelltypen dar, sondern dient vielmehr der Unterstützung professioneller Phagozyten in verschiedenen Geweben. Der Begriff “Zell-Kannibalismus” hingegen entstand bei der Beobachtung von Zell-in-Zell Phänomenen in Tumorgewebeschnitten und Ergüssen. Diese Art der Phagozytose wurde exklusive malignen Tumorzellen zugeschrieben und beschreibt die Aufnahme von lebenden und apoptotischen Tumorzellen sowie Lymphozyten durch andere Tumorzellen (Caruso, Muda et al. 2002, Lugini, Lozupone et al. 2003, Fais 2007). In Gewebe-Studien wurde einerseits eine Tumorfördernde Wirkung durch den Zell-Kannibalismus publiziert, andererseits wurde der Beseitigung von Tumorzellen, die sich von der extrazellulären Matrix abgelöst haben, eine Schutzfunktion vor Metastasierung zugesprochen (Kumar, Hosseinzadeh et al. 2001, Abodief, Dey et al. 2006, Cano, Sandi et al. 2012). Die Tumorfördernde Wirkung wurde auf einen möglichen Überlebensvorteil von phagozytierenden Tumorzellen bei Nährstoffmangel zurückgeführt. So wurde eine Zunahme der Phagozytose-Rate von lebenden CD8+-T-Lymphozyten durch metastatische Melanom-Zellen bei Serummangel festgestellt (Lugini, Matarrese et al. 2006). Daher wurde Zell-Kannibalismus als Marker für Malignität von Tumoren vorgeschlagen (Gupta and Dey 2003). Wegen der widersprüchlichen Publikationen, 26 die zum einen eine Tumor-fördernde Wirkung aber auch eine Schutzfunktion vor Metastasierung vorschlagen, kann die Anzahl von Zell-in-Zell Phänomenen in Tumorgewebeschnitten nicht als prognostischer Faktor herangezogen werden. Die Ursache für die gegensätzlichen Forschungsergebnisse liegt möglicherweise in spezifischen Unterschieden zwischen den betroffenen Geweben und Krebsarten. 1.4.2. Emperipolese Der Begriff „Emperipolese“ benennt die invasive Aktivität von Lymphozyten in das Zytoplasma größerer Zellen und wurde bereits 1956 von Humble et al. definiert. Dieses Verhalten der Lymphozyten wurde bei Tumorzellen (Humble, Jayne et al. 1956) und Makrophagen beobachtet (Berman 1966). Der Mechanismus dieses Vorgangs beruht auf einer aktiven Invasion und Aufnahme der Lymphozyten in Vakuolen innerhalb des Zytoplasmas einer größeren Wirtszelle, wobei beide Zellen zu Beginn des Prozesses keine Anzeichen von Zelltod zeigen. Emperipolese ist nicht mit der transendothelialen Migration von Leukozyten, die im Rahmen einer Entzündungsreaktion auftritt, zu verwechseln. Diese findet zwar hauptsächlich parazellulär an Zell-Zell-Verbindungen des Endothels statt, kann aber auch transzellulär durch die Bildung von Kanälen aus Vesikeln (vesiculo-vacuolar organelles) geschehen (Feng, Nagy et al. 1998, Dvorak and Feng 2001). Der ausschlagegebende Unterschied zur Emperipolese bleibt jedoch die Tatsache, dass die Lymphozyten lebend die Wirtszelle verlassen. Eine aktuellere Studie belegte die Internalisation von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) in verschiedene epitheliale Tumorzelllinien, die entweder im apoptotischen Zelltod der NK-Zellen oder in der Lyse der Tumorzellen resultierte (Wang 1987, Wang, Guo et al. 2009). Ebenso wurde die Tumorzytotoxizität einer T-Zelllinie auf den Vorgang der Emperipolese zurückgeführt, indem die invasiven T-Zellen im Zytoplasma der Tumorzelle ihre toxische Granula freisetzten (Takeuchi, Inoue et al. 2010). Da NK-Zellen und T-Zellen durch ihre Fähigkeit zur Zelltod-Induktion in Tumorzellen eine wichtige Rolle im Rahmen der Tumorimmunität spielen (Dunn, Bruce et al. 2002, Stinchcombe and Griffiths 2007, Vesely, Kershaw et al. 27 2011), kann die Emperipolese eine Immunevasion und Tumorprogression fördern. Eine weitere Studie zeigte das invasive Verhalten von autoreaktiven CD8+-TZellen in Hepatozyten, wobei es bei Inhibition der Emperipolese zur Hepatitis kommt (Benseler, Warren et al. 2011). In diesem besonderen Fall dient die Emperipolese also der Verhinderung von Autoimmunerkrankungen. 1.4.3. Entose Als weiterer Mechanismus zur Bildung von Zell-in-Zell Phänomenen beinhaltet die Entose die invasive Aktivität von Zellen, bei welcher Adhäsionsmoleküle von der eindringenden Zelle, sowie der sogenannten Wirts-Zelle beteiligt und notwendig sind. Als Auslöser für die Entose gilt das Ablösen von lebenden Zellen von der extrazellulären Matrix. Die Interaktion von E-Cadherinen und PCadherinen sowie die Rho-ROCK Aktivität der aufzunehmenden Zellen spielen dabei eine essentielle Rolle. Die internalisierten Zellen werden anschließend entweder durch die Wirtszelle lysosomal abgebaut, durchlaufen eine Zellteilung oder entkommen der Wirtszelle sogar lebend (Overholtzer, Mailleux et al. 2007). Als mögliche Folge der Entose gilt die Induktion von Aneuploidie in Tumorzellen (Krajcovic, Johnson et al. 2011). 1.5. Zielsetzung Die Beseitigung nekrotisch sterbender Zellen ist essentiell für die Vermeidung von Entzündungsreaktionen und Autoimmunerkrankungen. Die Beteiligung von benachbarten, nicht-professionellen Zellen, die professionelle Phagozyten unterstützen ist bekannt, aber deren physiologische Rolle und molekulare Hintergründe noch nicht bis ins Detail geklärt. In dieser Dissertation sollte die Phagozytose von Tumor- und Normalgewebezellen durch nicht-professionelle Phagozyten charakterisiert und deren Effizienz studiert werden. Dabei stand insbesondere die Beseitigung von primär nekrotischen Zellen nach Hitze-Behandlung im Fokus dieser Arbeit. Zunächst sollten die Effekte von Hyperthermie aber auch von ionisierender Strahlung zur Induktion von Nekrose näher untersucht werden. Des Weiteren sollte die Frage beantwortet werden, ob die Phagozytose-Aktivität ein weit verbreitetes Phänomen oder nur wenigen Zelltypen eigen ist. Daher 28 wurden verschiedene Zelltypen verwendet, inklusive Pankreaskarzinom-Zellen, mehrere morphologisch divergente Glioblastom-Zelllinien, eine primäre KopfHals-Tumorzelllinie, primäre, gesunde Hautfibroblasten, semi-adhärente Nierenepithelzellen, T-Zell-Leukämiezellen sowie lymphoblastoide Zellen. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung sollten Phagozytose-assoziierte Proteine identifiziert und eine mögliche Akkumulation bestimmter Proteine, wie Adhäsionsmoleküle, lokalisiert sowie das Schicksal der aufgenommenen Zelle dokumentiert werden. Funktionelle Analysen zur Beteiligung der Zytoskelett-Reorganisation, GTPase Aktivität von Dynamin II, der Cadherin-vermittelten Adhäsion und der Erkennung von PS sollten die molekularen Mechanismen charakterisieren. Da die resultierenden Phagozytose-Ereignisse als transiente Zell-in-Zell Strukturen dem Zell-Kannibalismus in Tumorgewebeschnitten morphologisch ähnelten, sollte außerdem das Vorhandensein von Zell-in-Zell Strukturen in Tumorgewebeschnitten von Patienten mit HNSCC, Rektumkarzinom und Analkarzinom quantifiziert werden und eine mögliche prognostische Relevanz überprüft werden. 29 2. Material und Methoden 2.1. Verwendete Zelllinien, Reagenzien, Geräte und Verbrauchsmaterial Tabelle 1: Humane Zelllinien Kurzbezeichnung Quelle/Bezug Pathologie/Quelle Morphologie BxPC-3 ECACC, 93120816 ATCC, CRL-1690 ATCC, HTB-14 ATCC, HTB-16 CLS, 300385 ATCC, TIB-152 ATCC, CRL-1573 Biopsie Spender Spender Spender Adenokarzinom, Pankreas Glioblastom Glioblastom Glioblastom Astrozytom T-Zell-Leukämie Embryonale Niere Kopf-Hals-Tumor Hautstanze Hautstanze Blut T98G U-87 MG U-138 MG U-251 MG Jurkat HEK293 p26 MZF16 SBLF5 SBL1 epithelial Fibroblasten epithelial polygonal epithelial T-lymphoblastisch epithelial Epithel-ähnlich Fibroblasten Fibroblasten B-lymphoblastoid Tabelle 2: Oligonukleotide Zielgen Referenzsequenz VorwärtsOligonukleotid RückwärtsOligonukleotid Amplikon [bp] CD36 NM_00112 7444.1 NM_00104 0059.1 NM_00110 3148 NM_00221 3.4 NM_03148 8 TGCAAAGAAGGGAGACCTGTG TTCTCTCATTCCCCTATGGACAC GTGCACTAGATGATGAAAGATTGG TGCATCCAACCAGATGGACTA GAAGGTATACGAGCAGTCTACA CAGA AAGACTCTCAGTCACTTTCGTGTG GCACGGAGACTCAAAGTGAAAAG GTTGACCTGCAGCCGTTTTG GCCATGTAGCTCAGGTAGACAAC TGTAATACCACTTCTGCATTGCTT CTCCACCGTTGTTCCAGGTA TCCAGGAGAACCTTACAGACAGTT 174 CCTGTAGTTGACTGGAGAACACTG CGGCTTTCTCCAGTGCCAAT 94 CD68 GIGYF2 ITGB5 L3MBTL2 RPUSD3 TIM1 NM_00114 2547.1 NM_00543 5.3 30 82 102 148 120 156 Tabelle 3: Reagenzien Bezeichnung Hersteller 7-AAD BD Becton, Dickinson and Company Millipore Carl Roth Carl Roth Invitrogen GmbH BD Becton, Dickinson and Company Millipore Thermo scientific Merck KGaA Sigma-Aldrich Serva Electrophoresis GmbH Innovatis AG Roche Heidelberg, D Invitrogen GmbH Invitrogen GmbH Invitrogen GmbH Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Invitrogen GmbH Darmstadt, D Sigma-Aldrich Invitrogen GmbH Roche PAN Biotech Carl Roth Merck KGaA Invitrogen GmbH Merck KGaA Merck KGaA Life Technologies GmbH Biochrom AG Merck KGaA Molecular Probes R&D Systems Beckman Coulter Merck KGaA Life Technologies GmbH Merck KGaA Sigma-Aldrich Merck KGaA Merck KGaA Carl Roth Biochrom AG Taufkirchen, D Darmstadt, D Grenzach-Wyhlen, D Aidenbach, D Karlsruhe, D Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Berlin, D Darmstadt, D Frankfurt, D Wiesbaden, D Krefeld, D Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Taufkirchen, D Darmstadt, D Darmstadt, D Karlsruhe, D Berlin, D Accutase Aceton Agarose Annexin V Annexin V-APC Bafilomycin A1 BCA kit β-Mercaptoethanol BrdU BSA CASY Ton CC1-Puffer (Benchmark ULTRA) CellLight Aktin-GFP CellLight H2B-RFP CellTrace Far Red, DDAOSE CellTrace Oregon Green, carboxy-DFFDA SE Chloroquin Colcemid DAPI Dulbecco’s DMEM-Medium DMSO Dynasore EdU imaging kit EDTA Eisessig F12-Medium FBS Formaldehyd Hoechst 33342 HSP70-ELISA Duoset IC Isoton II Latrunculin B L-Glutamin Methanol Methylenblau-Färbelösung Natriumazid Natriumcitrat Natriumchlorid Nicht-essentielle Aminosäu- 31 Darmstadt, D Karlsruhe, D Karlsruhe, D Darmstadt, D Heidelberg, D Darmstadt, D Rockford, USA Darmstadt, D Taufkirchen, D Heidelberg, D Reutlingen, D Grenzach-Wyhlen, D ren Paclitaxel PBS Penicillin/Streptomycin QIA shredder qPCR Kit DyNAmo Flash SYBR Green Reverse Transkription Kit QuantiTect Rhodamin phalloidin Ringerlösung RNeasy Kit Roti Safe Gel Stain RPMI 1640 Medium Salzsäure Streptavidin-biotinylierter alkalische PhosphataseKomplex SYBR-DNA-Farbstoff TRIS Triton X-100 Trypsin Tween Vectashield Wasser für Molekularbiologie Universitätsklinikum Erlangen Life Technologies GmbH Life Technologies GmbH Qiagen Thermo Scientific Erlangen, D Qiagen Hilden, D Invitrogen GmbH B. Braun Melsungen AG Qiagen Carl Roth Sigma-Aldrich Merck KGaA DakoCytomation Darmstadt, D Melsungen, D Hilden, D Karlsruhe, D Taufkirchen, D Darmstadt, D Glostrup, DK Lonza Carl Roth Merck KGaA Life Technologies GmbH Carl Roth Vector Laboratories AppliChem Basel, CH Karlsruhe, D Darmstadt, D Darmstadt, D Karlsruhe, D Peterborough, UK Darmstadt, D Darmstadt, D Darmstadt, D Hilden, D Waltham, MA, USA Tabelle 4: Antikörper Antikörper Spezies Verdünnung Hersteller BrdU CD2 Cleaved caspase 3 Maus Maus Kaninchen 1:6 1:20 1:100 Maus Maus Ratte 1:100 1:200 1:6,6 Millipore, Temecula, CA eBioscience, Frankfurt, D Cell signaling, Danvers MA, USA BD, Heidelberg, D BD, Heidelberg, D BD, Heidelberg, D Millipore, Temecula, CA Kaninchen 1:100 HSP70 Maus 1:100 Isotypkontrolle IgG1 Isotypkontrolle IgG2b Isotypkontrolle IgG1 Isotypkontrolle, IgG1κ, Funktions-blockierend Maus Maus Ratte Ratte Entsprechend Entsprechend Entsprechend Entsprechend Ezrin pT567Ezrin E-Cadherin E-Cadherin, Funktionsblockierend HSP70 32 Cell signaling, Danvers MA, USA BD bioscience, Heidelberg, D eBioscience, Frankfurt, D eBioscience, Frankfurt, D eBioscience, Frankfurt, D eBiocience, Frankfurt, D Isotypkontrolle, IgG1κ, Funktions-blockierend LAMP1 LC3B Maus Entsprechend eBiocience, Frankfurt, D Maus Kaninchen 1:100 1:400 P-Cadherin Kaninchen 1:100 P-Cadherin, Funktionsblockierend Maus 1:10 eBiocience, Frankfurt, D Cell Signaling, Danvers MA, USA Cell Signaling, Danvers MA, USA Abcam, Cambridge, UK Tabelle 5: Sekundär-Antikörper Antikörper Spezies Verdünnung Hersteller Alexa Fluor 594 gegen Kaninchen Alexa Fluor 488 gegen Maus Alexa Fluor 555 gegen Maus Alexa Fluor 647 gegen Kaninchen Rhodamin gegen Maus Hühnchen 1:200 Invitrogen Darmstadt, D Ziege 1:400 Invitrogen Darmstadt, D Ziege 1:200 Invitrogen Darmstadt, D Ziege 1:200 Invitrogen Darmstadt, D Ziege 1:100 Merck Millipore, Billerica, MA, USA Tabelle 6: Verbrauchsmaterial Bezeichnung Hersteller CASY-Röhrchen Deckgläser Einfrierröhrchen NUNC Fettstift Super PAP Pen PCR-Platten, Hartschale Mikrotiterplatten Cellstar Multiwellplatten, 96 Well Objektträger Parafilm Petrischalen Pipetten Pipettenspitzen Pipettenspitzen mit Filter Quadriperm-Schalen Reaktionsgefäße Reaktionsgefäße für PCR Rundbodenröhrchen Zellkulturflaschen Zentrifugenröhrchen Cellstar, Polypropylen Innovatis AG Gerhard Menzel GmbH Thermo Fisher Scientific Science Services Bio-Rad Greiner Bio-One GmbH Thermo Scientific Gerhard Menzel GmbH Pechiney Plastic Packaging Thermo Fisher Scientific nerbeplus Sarstedt Greiner Bio-One GmbH Greiner Bio-One GmbH Eppendorf AG Sarstedt Becton, Dickinson GmbH Greiner Bio-One GmbH Greiner Bio-One GmbH 33 Reutlingen, D Braunschweig, D Langenselbold, D München, D München, D Frickenhausen, D Waltham, MA, USA Braunschweig, D Greenwitch, USA Langenselbold, D Winsen/Luhe, D Nümbrecht, D Frickenhausen, D Frickenhausen, D Hamburg, D Nümbrecht, D Heidelberg, D Frickenhausen, D Frickenhausen, D Tabelle 7: Geräte Gerät Hersteller Analysewaage Mettler AC 100 Analysewaage P1200N CASY TT Zellzähler CFX96 Real-Time System CO2-Inkubator DNA/RNA UV-cleaner UVC/T-M-AR Durchflusszytometer Gallios TM Elektrophoresesystem Power Pac HC Fluoreszenzmikroskop Axioplan 2 Imaging Fluoreszenzmikroskop Leica DM6000B Konvokales Mikroskop LSM 710 Lebendzell-Mikroskop Axioplan 200 Lichtmikroskop PrimoVert Magnetrührer MR2002 Nanophotometer P330 pH-Meter C761 Calimatic Plattformschüttler Rotamax 120 Plattenlesegerät HTS 7000 Röntgenröhre Isovolt Titan Tischzentrifuge 1-15 Tischzentrifuge Mikro 200 R UV-Tisch UVT-28M Ventana BenchMark Ultra stainer Vortex MR2000 Wasserbad METTLER-TOLEDO Giessen, D METTLER-TOLEDO Innovatis AG Bio-Rad HERAEUS Instruments GmbH Biosan Giessen, D Reutlingen, D München, D Hanau, D Riga, LV Beckman Coulter Brea, USA Bio-Rad München, D Carl Zeiss Microscopy GmbH Göttingen, D Werkbank Hera Safe Werkbank Laminar-Flow Zentrifuge Megafuge 1.0RS Zentrifuge Rotina 420 R Zytofuge 2 Stat Spin Leica Microsystems Ltd. Carl Zeiss Microscopy GmbH Göttingen, D Carl Zeiss Microscopy GmbH Göttingen, D Carl Zeiss Microscopy GmbH Heidolph Instruments GmbH Implen GmbH KNICK Heidolph Instruments GmbH Göttingen, D Schwabach, D München, D Berlin, D Schwabach, D Perkin Elmer GE Inspection Technologies Sigma Laborzentrifugen GmbH Hettich AG Waltham, MA, USA Hürth, D Osterode am Harz, D Bäch, CH Herolab GmbH Roche Wiesloch, D Grenzach-Wyhlen, D Heidolph Instruments GmbH GFL Gesellschaft für Labortechnik GmbH HERAEUS Instruments GmbH HERAEUS Instruments GmbH Thermo Scientific Hettich AG StatSpin Inc. Iris Sample Processing Schwabach, D Burgwedel, D 34 Hanau, D Hanau, D Waltham, MA, USA Bäch, CH Westwood, MA, USA Tabelle 8: Puffer und Lösungen Name Reagenz Volumen/Gewicht/Konzentration Blockier-Lösung FBS BSA PBS Natriumazid (1 M) 4x SSC Tween DAPI-Stammlösung (1 mg/ml) PBS, 1x Formaldehyd (37 %) Triton X Methylenblau KOH (1 %) Aqua dest. TRIS pH=8,0 Natriumchlorid Deoxycholat NP40 SDS HALT PMSF NaF Ortho-Vanadat Beta-Glycero-Phosphat Natriumchlorid Natriumcitrat Aqua dest. Salzsäure (5 M) SSC (20x) Aqua dest. Tween Salzsäure (1 M) Tris Eisessig EDTA (0,5 M, pH 8,0) Aqua dest. Tris Natriumchlorid Aqua dest. Salzsäure (5 M) 10 ml 1g 90 ml 0,3 ml 1 ml 0,3 µl DAPI-Gebrauchslösung Fixier-Lösung MethylenblauFärbelösung RIPA-Puffer SSC (20x), autoklaviert SSC (4x)/Tween TAE (50x) TBS (10x) 35 89,2 ml 10,8 ml 100 µl 30 ml 1 ml 100 ml 50 mM 150 mM 0,5 % 1,0 % 1,0 % 1:100 1:100, 0,1 M 1:1000, 1 M 1:1000, 200 mM 1:1000, 1 M 525,9 g 264,6 g Auf 3 L auffüllen pH-Wert von 7,0 einstellen 130 ml 520 ml 1,3 ml pH-Wert von 7,0 einstellen 242 g 57,1 ml 100 ml Auf 1 L auffüllen 12,114 g 87,66 g Auf 1 L auffüllen pH-Wert von 8,0 einstellen 2.2. Zellkultur Das Arbeiten mit den Zelllinien fand unter sterilen Bedingungen in einer sterilen Werkbank statt. 2.2.1. Kultivierungsbedingungen Die Zellen wurden in einem Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 % inkubiert. Für die Kultivierung wurden Zellkulturflaschen aus Polystyrol mit Filterschraubverschluss benutzt. Je nach Zelllinie wurden komplementierte Kulturmedien basierend auf F12, RPMI 1640 oder Dulbecco‘s DMEM verwendet. Tabelle 9 zeigt, welche Zusätze zu den Medien gegeben wurden. Tabelle 9: Kulturmedien BxPC-3, HEK293 T98G, U87, U138 U251, HEK293 p26, SBLF5 MZF16 Jurkat, SBL1 RPMI 1640 10 % FBS 100 u/ Penicillin ml DMEM 10 % 100 u/ ml FBS Penicillin F12 15 % 100 u/ ml RPMI 1640 20 % FBS 100 u/ Penicillin ml 100 µg/ ml 2% 100 µg/ ml Streptomycin Streptomycin LGlutamin 100 µg/ ml 2% 1% FBS Penicillin Streptomycin LGlutamin Nichtessentielle Aminosäuren 100 µg/ ml 2% Streptomycin LGlutamin 2.2.2. Passage und Konservierung von Zellen Die Suspensionszelllinien (Jurkat und SBL1) wurden mit einer Zelldichte von 0,2 – 1*106 Zellen/ml kultiviert. Um diese Zelldichte für optimale Wachstumsbedingungen zu erhalten, wurden die Zellen ein- bis zweimal wöchentlich gezählt und entsprechend ein Teil der Zellen entfernt bevor anschließend frisches Medium zugegeben wurde. Alle adhärent wachsenden Zelllinien wurden ein- bis zweimal wöchentlich nach Erreichen einer Konfluenz von 90 – 100 % abgelöst. Hautfibroblasten wurden im Verhältnis 1 zu 1, alle anderen adhärenten Zelllinien im Verhältnis 1 zu 10 36 passagiert. Dazu wurde das Medium komplett entfernt, der Zellrasen mit PBS gespült und mit Trypsin überschichtet. Nach einer Einwirkzeit von 1 – 2 min wurde das Trypsin abgenommen und die Zellkulturflasche für weitere 1 – 5 min in den CO2-Inkubator gegeben. Das Ablösen und gegebenenfalls Vereinzeln der Zellen wurde im Lichtmikroskop überprüft bevor die Zellen in Medium aufgenommen und auf die Kulturflaschen verteilt wurden. Zuletzt wurde ausreichend frisches Medium zugegeben. Für die Konservierung wurden Zellen genutzt, die eine maximale Konfluenz von 80 % erreicht hatten. Nach Trypsin-Behandlung wurden die Zellen in 10 ml Medium aufgenommen und in Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 300 g für 5 min wurde der Überstand verworfen und das Zellsediment in sterilfiltriertem RPMI 1640 Medium mit 11 % Glycerin resuspendiert. Je Kryoröhrchen wurde eine Zellsuspension mit 1 – 5*106 Zellen überführt, die Röhrchen in einen mit Isopropanol gefüllten Einfrierbehälter gegeben und bei −80 °C eingefroren. Nach 24 h wurden die Röhrchen dem Einfrierbehälter entnommen und in Kisten gelagert. 2.2.3. Transfektion BxPC-3 Zellen wurden mit den Transfektions-Reagenzien CellLight Aktin-GFP und CellLight Histon H2B-RFP transfiziert. Es wurden 0,85*105 Zellen je Näpfchen einer Kulturplatte mit zwölf Näpfchen eingesät. Nach 24 Stunden Inkubation im CO2-Brutschrank wurde das Medium restlos entfernt, bevor 720 µl Medium und 80 µl des CellLight-Reagenz‘ (entspricht 95 Partikeln pro Zelle) zugegeben wurden. Die Platten wurden kurz geschwenkt und für weitere 26 h inkubiert. Anschließend wurde das Medium entfernt, der Zellrasen mit PBS gewaschen und die Zellen mit Trypsin abgelöst. Nach Aufnahme in frisches Medium wurden die Zellen entweder zur Analyse der Transfektions-Effizienz auf Objektträger aufgebracht oder im Phagozytose-Versuch verwendet. 2.2.4. Nukleosid-Inkorporation Der Einbau von Nukleosiden zur Markierung der Zellkerne vor Hitzebehandlung und Internalisierung in phagozytische Zellen erfolgte mit EdU bzw. BrdU. Es wurden 1*105 Zellen in Kulturplatten mit sechs Näpfchen eingesät. Nach 24 h wurde 30 µM EdU bzw. 100 µM BrdU zugegeben. Nach weiteren 72 h wurden 37 die Zellen abgelöst und im Phagozytose-Versuch verwendet. Inkorporiertes BrdU wurde mit einem Primärantikörper gegen BrdU und einem Fluorochrommarkierten Sekundärantikörper nachgewiesen (siehe 2.6). EdU wurde mithilfe des EdU imaging kit nach Herstellerangaben sichtbar gemacht. 2.3. Induktion und Inhibition von nicht-professioneller Phagozytose Zur Untersuchung der nicht-professionellen Phagozytose wurde ein Standardprotokoll etabliert. Zwei Tage vor dem Versuch wurden die Zellen in Flaschen eingesät, wobei die Zellzahl je nach Zelllinie variierte. Entscheidend dabei war, dass zum Versuchstag eine Konfluenz von maximal 90 % erreicht wurde. Am Versuchstag wurden die Zellen mit Lebendfarbstoffen grün und rot gefärbt, anschließend abgelöst, gezählt und im Verhältnis 1 zu 1 für eine Dauer von 4 – 72 h koinkubiert. Je nach Versuchsbedingung erfolgte die Behandlung zur Induktion bzw. Inhibition der Phagozytose vor oder nach dem Ablösen der Zellen. Zum Beginn und nach 60 min wurde mittels Durchflusszytometrie die Adhäsion von grünen und roten Zellen gemessen. Nach Ablauf der Koinkubation wurden die Zellen auf Objektträger zentrifugiert, fixiert und mikroskopiert. 2.3.1. Inaktivierung von Zellen durch Hitzeeinwirkung Die Effekte von Hitzeeinwirkung auf Pankreaskarzinom-Zellen wurden untersucht, indem die Zellen 45 min im Wasserbad bei Temperaturen von 46 – 56 °C (2 °C-Unterschiede) inkubiert wurden und anschließend zu den Zeitpunkten 0 h, 4 h und 24 h für eine Analyse mit dem Durchflusszytometer mit Annexin V-APC und 7-AAD gefärbt wurden (siehe 2.4.1). Die Inkubation der Zellen für die Zeitpunkte 4 h und 24 h erfolgte in Suspensionswellplatten im CO2-Inkubator. Für alle weiteren Versuche zur Phagozytose von Hitze-behandelten Zellen wurde in dieser Arbeit die Inkubation bei 56 °C für 45 min gewählt. 2.3.2. Proliferationspotenzial von Hitze-behandelten Zellen Zur Untersuchung der Auswirkung von Hitze-Behandlung auf die Proliferationsfähigkeit der Zellen wurde ein Koloniebildungstest durchgeführt. Dabei wurden Pankreaskarzinom-Zellen abgelöst und mit der Neubauer Zählkammer gezählt. 38 Dabei wurde darauf geachtet, dass die Zellen zuvor vereinzelt wurden. Die Einzelzellsuspension wurde auf vier Zentrifugenröhrchen verteilt. Für die Kontrolle wurden die Zellen sofort und in definierter Menge (400 Zellen) in Petrischalen (Ø 6 cm) eingesät. Die übrigen drei Röhrchen wurden für 45 min bei 40, 45 oder 56 °C im Wasserbad inkubiert. Nach der Hyperthermie-Behandlung wurden ebenfalls jeweils 400 Zellen in Petrischalen eingesät. Es wurden für jede Bedingung und die Kontrolle jeweils Triplikate angefertigt. Beim Einsäen wurde 3 ml Medium auf die Zellen pipettiert, nach drei und zehn Tagen wurde jeweils 1 ml Medium zugegeben. Nach 14 Tagen wurden die Kolonien mit einer Methylenblau-haltigen Lösung 30 min gefärbt, mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und gezählt. 2.3.3. Vitalfärbung Die phagozytierenden und die aufzunehmenden Zellen wurden mittels Vitalfärbung grün bzw. rot gefärbt. Dafür wurden Celltrace Vitalfarbstoffe verwendet, die durch die intakte Zellmembran diffundieren und kovalent an Amingruppen intrazellulärer Proteine binden. Der grüne Farbstoff entwickelt seine Fluoreszenz erst nach Entfernung der Azetatgruppen durch zelleigene Esterasen, der rote Farbstoff hingegen muss nicht mehr enzymatisch umgesetzt werden. Die Vitalfarbstoffe bleiben in den gefärbten Zellen und können nicht auf andere Zellen übertragen werden, sodass unterschiedlich behandelte Zellen verlässlich unterschieden werden können. Zunächst wurde durch Zugabe von 19,8 µl DMSO zum lyophilisierten Sediment von CTOG (grün) eine 4,255 mM Stocklösung hergestellt. CTFR (rot) wurde mit 16,8 µl DMSO gelöst, um eine 5,88 mM Stocklösung zu erhalten. Für die Vitalfärbung wurden die Farbstoffe in je nach Kulturflaschengröße in 5 – 15 ml PBS verdünnt, sodass die Endkonzentration für CTOG 0,596 µM und für CTFR 1,882 µM betrug. Bei der Färbung von adhärenten Zellen wurde das Medium verworfen und der Zellrasen mit PBS gewaschen. In eine T-25 Kulturflasche wurden 5 ml Färbelösung pipettiert, in eine T75 Kulturflasche 10 ml und in eine T-225 15 ml. Die Zellen wurden mit der Färbelösung 20 min bei 37 °C im CO2-Schrank inkubiert. Anschließend wurde die Färbelösung entfernt, der Zellrasen mit Medium gewaschen und zuletzt mit Medium überschichtet. Für die Umwandlung des grünen Farbstoffs wurden die Zellen weitere 10 min im CO2-Schrank inkubiert. Suspensionszellen wurden in ein 39 Zentrifugenröhrchen überführt, mit dem Zellzähler CASY TT gezählt und bei 300 g 5 min zentrifugiert. Die Zellen wurden in 5 ml Färbelösung resuspendiert und 15 min im CO2-Inkubator inkubiert. Anschließend wurden die Zellen nach Zentrifugation (5 min, 300 g) in Medium resuspendiert und dabei die Zellkonzentration von 106 Zellen pro ml eingestellt. Die grün gefärbten Zellen wurden für weitere 10 min bei 37 °C inkubiert. 2.3.4. Phagozytose von hyperthermierten Zellen Die Phagozytose wurde durch die vierstündige Koinkubation von unbehandelten mit Hitze-behandelten, nekrotischen Zellen in Suspension induziert. Es wurde einerseits die homotypische Phagozytose untersucht, indem verschiedene Tumorzelllinien (Pankreaskarzinom-, Glioblastom-, primäre Kopf-Hals- Tumorzellen, T-Zell-Leukämiezellen), primäre, gesunde Hautfibroblasten, embryonale Nierenepithelzellen und lymphoblastoide Zellen mit Hitze-behandelten Zellen derselben Zelllinie inkubiert wurden. Zum anderen wurden heterotypische Aufnahmen von Hitze-behandelten Zellen durch andere Zelllinien getestet (Tabelle 10). Tabelle 10: Kombination von Zelllinien bei der heterotypischen Phagozytose Vital BxPC-3 SBLF5 Hitze-behandelt SBL1 SBLF5 T98G T98G SBL1 SBL1 BxPC-3 SBLF5 T98G BxPC-3 Nach der Vitalfärbung wurden die adhärenten Zellen abgelöst, mit dem automatischen Zellzähler CASY TT gezählt und 5 min bei 300 g zentrifugiert. Die Zellkonzentration von 106 Zellen pro ml wurde eingestellt, indem das Zellsediment in einer entsprechenden Menge Medium resuspendiert wurde. Ein Teil der roten Zellen wurde im Wasserbad bei 56 °C 45 min inkubiert und dadurch nekrotisiert. Anschließend wurden 300 µl dieser Zellen, ohne zusätzlichen Waschschritt in 1 ml Rundbodenröhrchen mit grünen unbehandelten Zellen im Verhältnis 1 zu 1 bei 37 °C im CO2-Schrank koinkubiert. Als Kontrolle wurden zusätzlich unbehandelte rote Zellen mit unbehandelten grünen Zellen koinkubiert. Zum Beginn und nach 60 min der Koinkubation erfolgte eine Messung der Adhäsion am Durchflusszytometer (siehe 2.4.2). Anschließend wurden die Zellsu40 spensionen in Suspensionskulturplatten mit 24 Näpfchen überführt, mit 2 µl Hoechst 33342 versetzt und für die restliche Inkubationsdauer von weiteren 3 h im CO2-Schrank inkubiert. Erste Phagozytose-Ereignisse entstanden unter den beschriebenen Bedingungen 2,5 h nach Beginn der Koinkubation. Anschließend erfolgte die Zentrifugation der Zellen auf Objektträger und deren Fixierung. Zur Überprüfung der vollständigen Aufnahme von hyperthermierten durch unbehandelte Zellen, wurden CTOG-gefärbte vitale Zellen mit ungefärbten Hitzebehandelten Zellen 4 h in Suspensionskulturplatten koinkubiert. Anschließend wurden die Zellen bei 300 g für 5 min zentrifugiert und das Sediment in 200 µl Ringerlösung resuspendiert, sodass die Zellkonzentration 5*106 Zellen/ml entsprach. Die Zellen wurden 30 min auf Eis im Dunkeln mit 4,5 µl 7-AAD gefärbt und nach erneuter Zentrifugation bei 300 g für 5 min und Suspension in Ringerlösung auf Objektträger zentrifugiert und mikroskopiert. Zur Untersuchung der Phagozytose unter Zelltyp-gerechten Bedingungen der adhärenten Zellen wurden 1,5*105 Pankreaskarzinom-Zellen auf Objektträger eingesät, nach 24 h mit 1 ml der Zellsuspension von hyperthermierten Zellen (c=106/ml) für 4 h bei 37 °C im CO2-Brutschrank überschichtet und anschließend fixiert. 2.3.5. Inhibition der Phagozytose von Hitze-behandelten Zellen Zur Untersuchung der notwendigen molekularen Mechanismen der nichtprofessionellen Phagozytose wurden Pankreaskarzinom-Zellen unmittelbar vor der Koinkubation mit Hitze-behandelten Zellen mit unterschiedlichen Noxen behandelt. Der Phagozytose-Versuch zur Aufnahme von Hitze-behandelten Zellen (siehe 2.3.4) wurde zu diesem Zweck modifiziert. Ein Teil der vitalen, grünen Zellen wurde mit 50 Gy bestrahlt. Des Weiteren wurden grüne Zellen mit den proteolytischen Enzymen Trypsin und Accutase, welche Moleküle von der Zelloberfläche abspalten, behandelt. Für diese Behandlung wurde der Zellrasen einer T25 Flasche mit je 1 ml 0,05 % Trypsin oder Accutase versetzt und 45 min bei 37 °C im CO2-Inkubator inkubiert. Außerdem wurden grün gefärbte Zellen mit den Zytoskelett-Inhibitoren Latrunculin B (0,5 µg/ml in Serum-freiem Medium), Colcemid (90 ng/ml) oder Paclitaxel (0,5 µg/ml) versetzt und 1 h im CO241 Schrank vorbehandelt. Zur Hemmung der GTPase Aktivität wurden grün gefärbte Zellen mit Dynasore (26 µg/ml) 1 h bei 37 °C inkubiert. Während der anschließenden Koinkubation mit Hitze-behandelten Zellen wurde die Konzentration der Inhibitoren aufrechterhalten. Als Kontrollen wurden grüne Zellen mit den Lösungsmitteln DMSO und PBS in den entsprechenden Konzentrationen versetzt (1 µl bzw. 5 µl DMSO oder 90 µl PBS auf 5 ml Medium bzw. 1 ml PBS auf eine T-25 Flasche als Kontrolle für Trypsin/Accutase) und mit roten Hitze-behandelten Zellen inkubiert. Für die Behandlung mit Latrunculin B wurde die Kontrolle mit dem Lösungsmittel in Serum-freiem Medium durchgeführt. Des Weiteren wurden unbehandelte grüne Zellen mit Hitze-behandelten bzw. unbehandelten roten Zellen inkubiert. Nach Ende der Koinkubationsdauer von 4 h wurden die Zellsuspensionen auf Objektträger aufgebracht, fixiert und mikroskopiert, um die Phagozytose-Raten zu bestimmen. 2.3.6. Funktionale Blockade von E-und P-Cadherin Als weiterer Ansatz sollte der E- und P-Cadherin-vermittelte Zellkontakt mit Funktions-blockierenden Antikörpern unterbunden und der Effekt auf Adhäsionund Phagozytose-Raten untersucht werden. Für diesen Versuch wurde die Pankreaskarzinom-Zelllinie BxPC-3 verwendet, die beide Zellmembran-Proteine exprimiert. Der Phagozytose-Versuch zur Aufnahme von Hitze-behandelten Zellen (siehe 2.3.4) wurde insofern abgewandelt, als dass zum Beginn der Koinkubation die blockierenden Antikörper zugegeben wurden. Die verwendeten Konzentrationen waren 150 µg/ml für E-Cadherin und 100 µg/ml für PCadherin. Eine Isotypkontrolle mit den entsprechenden Konzentrationen für beide Antikörper wurde ebenfalls mitgeführt. Außerdem wurden Proben ohne Hyperthermie-Behandlung angesetzt, um den Effekt der blockierenden Antikörper auf die Adhäsion zwischen vitalen Zellen zu untersuchen. Nach Ende der Koinkubation von 4 h wurden die Zellsuspensionen auf Objektträger aufgebracht, fixiert und mikroskopiert, um die Phagozytose-Raten zu quantifizieren. 2.3.7. Behandlung mit Annexin V zur Blockade von Phosphatidylserin Für die Blockade von Phosphatidylserin wurde Annexin V (AnxA5) in Konzentrationen von 10 – 40 µg/ml (entspricht 280 nM – 1,1 µM) verwendet. Rot42 gefärbte Hautfibroblasten, Pankreaskarzinom- und Glioblastom-Zellen wurden nach der Hitzebehandlung (56 °C, 45 min) zentrifugiert und in Medium mit zugesetztem AnxA5 1 h bei 37 °C inkubiert. Bei der Koinkubation mit unbehandelten grünen Zellen wurden die Konzentrationen von AnxA5 aufrechterhalten. Als Kontrollen wurden wiederum grüne Zellen mit Hitze-behandelten roten Zellen ohne AnxA5 und unbehandelte grüne mit unbehandelten roten Zellen inkubiert. Eine Kontrolle mit dem Lösungsmittel war nicht notwendig, da das AnxA5 in Medium gelöst worden war. Nach Ende der Koinkubationszeit von 4 h wurden die Zellsuspensionen auf Objektträger aufgebracht, fixiert und mikroskopiert, um die Phagozytose-Raten zu ermitteln. 2.3.8. Phagozytose von bestrahlten Zellen Als weitere Methode zur Induktion von Nekrose wurden mehrere der Zelllinien, die nach Hitze-Behandlung von nicht-professionellen Phagozyten aufgenommen wurden, mit unterschiedlichen Dosen Röntgenstrahlung bestrahlt. T-ZellLeukämiezellen erhielten eine Dosis von 8 Gy mit anschließender Inkubationszeit von drei Tagen im CO2-Inkubator. Pankreaskarzinom-Zellen wurden mit 20 Gy bestrahlt und für weitere sechs Tage inkubiert. Die primäre Kopf-HalsTumorzelllinie wurde mit der Einzeldosis von 2 Gy an fünf aufeinanderfolgenden Tagen fraktioniert bestrahlt (Gesamtdosis: 10 Gy) und drei Wochen im CO2Inkubator inkubiert. Die Induktion von Nekrose und Apoptose wurde durch 7AAD/AnxA5-APC (Allophycocyanin) Färbung am Durchflusszytometer gemessen (siehe 2.4.1). Außerdem wurden die homotypischen und heterotypischen Phagozytose-Raten nach Vitalfärbung und 4 h Koinkubation von unbehandelten mit bestrahlten Zellen in Suspension bestimmt. Bei der Vitalfärbung der bestrahlten Zellen wurden das Medium mit den schwimmenden Zellen und der nekrotischen Debris nicht verworfen, sondern zentrifugiert und wie Suspensionszellen gefärbt (siehe 2.3.3). Für die mikroskopische Auswertung wurden die Zellsuspensionen auf Objektträger zentrifugiert und fixiert. Sowohl für die durchflusszytometrische Messung als auch für den Phagozytose-Versuch wurden als Positivkontrolle für die Induktion von Nekrose und Phagozytose hyperthermierte Zellen (56 °C, 45 min) mitgeführt. 43 Außerdem wurde mittels Immunfluoreszenz-Färbung getestet, ob in bestrahlten und hyperthermierten Zellen die aktivierte Caspase-3 (cleaved caspase-3) nachgewiesen werden kann und somit die Induktion von Apoptose. Zu diesem Zweck wurde die Vitalfärbung auf die CTOG-Färbung der phagozytierenden Zellen beschränkt, um einer Signalüberlagerung der CTFR-Färbung mit der Caspase-3 Färbung vorzubeugen. Die Zellsuspensionen wurden 4 h und 15 h nach Beginn der Koinkubation auf Objektträger zentrifugiert, fixiert und mit einem Antikörper gegen die aktivierte Caspase-3 gefärbt (siehe 2.6). 2.3.9. Beobachtung der Phagozytose-Ereignisse über die Zeit Für die Beobachtung von zellulären Prozessen nach Aufnahme von hyperthermierten Zellen wurden vier Ansätze gewählt (Tabelle 11). Tabelle 11: Versuchsansätze zur Untersuchung des Zeitverlaufs nach Phagozytose Unbehandelt Hitzebehandelt BxPC-3 (CTOG, grün) Jurkat (CD2, rot) BxPC-3 (H2BRFP, rot) BxPC-3 (EdU, rot) BxPC-3 (HSP70, rot LAMP1, gelb) Der Versuchsablauf entspricht der Phagozytose von Hitze-behandelten Zellen (siehe 2.3.4) mit der Modifikation einer verlängerten Inkubationsdauer von bis zu drei Tagen und einer Kernfärbung mit DAPI statt Hoechst. Außerdem wurde auf die durchflusszytometrische Messung verzichtet. Die heterotypische Phagozytose wurde anhand von unbehandelten CTOG-gefärbten Pankreaskarzinom-Zellen (BxPC-3), die mit Hitze-behandelten ungefärbten T-Zell- Leukämiezellen (Jurkat) koinkubiert wurden, untersucht. T-Zell-Leukämiezellen wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung des T-Zell Antigens CD2 sichtbar gemacht (siehe 2.6). Zur Beobachtung der homotypischen Phagozytose wurden BxPC-3 Zellen verwendet. Unbehandelte CTOG-gefärbte BxPC-3 Zellen wurden mit hyperthermierten, mit Histon H2B-RFP transfizierten Zellen oder mit Zellen, die das Nukleosid EdU inkorporiert hatten (siehe 2.2.3 – 4), koinkubiert. Zur Untersuchung der Verteilung von HSP70 und LAMP1 mittels Immunfluoreszenz wurde zusätzlich ein Ansatz mit vitalen, CTOG-gefärbten und ungefärbten, hyperthermierten Pankreaskarzinom-Zellen mitgeführt. Nach 4 – 72 h nach Beginn der Koinkubation wurden die Zellsuspensionen auf Objektträger zentrifu44 giert und fixiert. Zur Färbung der Nuklei wurden 50 µl der DAPIGebrauchslösung auf die Objektträger pipettiert, diese mit Parafilm bedeckt und im Dunkeln 1 min inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger in bidestilliertes Wasser getaucht, getrocknet und mit Vectashield-Medium eingedeckt. 2.3.10. Erstellung der Objektträger nach der Koinkubation Nach Beendigung der Koinkubation der Phagozytose-Versuche in Suspension wurden die Zellsuspensionen in Eppendorf Reaktionsgefäße überführt, in der Tischzentrifuge bei 300 g für 5 min zentrifugiert und die Sedimente im Ausgangsvolumen Ringerlösung resuspendiert, sodass die Zellkonzentration von 106/ml erhalten blieb. Je 50 µl der Suspensionen wurden pro Kammer eines vorbereiteten Zytozentrifugationsschlittens mit Dreifach-Kammer pipettiert und auf Objektträger bei 1000 rpm 6 min in einer Zytofuge zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Objektträger wurden während des Trocknens mit Alufolie abgedeckt. Auf den trockenen Objektträgern wurden die Zellbereiche mit Fettstift umrandet bevor die Objektträger in Quadripermschalen vorsichtig mit Fixierlösung überschichtet wurden. Die Objektträger mit angewachsenen Pankreaskarzinom-Zellen wurden vorsichtig mit PBS gespült, um die nicht phagozytierten hyperthermierten Zellen zu entfernen und anschließend fixiert. Die Fixierung und Permeabilisierung fand jeweils 10 min bei Raumtemperatur (RT) im Abzug statt. Anschließend wurden die Objektträger dreimal 3 min auf dem Rüttler bei 50 rpm mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen und im Dunkeln getrocknet. Die trockenen Objektträger wurden mit Vectashield eingedeckt und im Kühlschrank bei 6 – 8 °C aufbewahrt. 2.3.11. Quantifizierung der Phagozytose-Raten Zur vergleichenden Analyse der Effizienz der phagozytischen Aktivität von verschiedenen Zelllinien und der Einflüsse von Inhibitoren wurden die erstellten Objektträger mikroskopisch ausgewertet. Dafür wurden Rasteraufnahmen mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen, um anschließend den Prozentsatz an Zell-in-Zell Strukturen mit dem Bild-Analyse-Programm Biomas zu ermitteln. Diese Prozentangaben geben die Anzahl von Phagozytose-Ereignissen dividiert durch die Anzahl aller grünen, vitalen Zellen wieder. Es wurden 1000 bis 3000 grüne Zellen ausgewertet, abhängig davon, ob insgesamt eher viele oder nur 45 sehr wenige Zell-in-Zell Strukturen vorhanden waren. Dabei wurden nur vollständig abgeschlossene Phagozytose-Ereignisse, die einen umschließenden Zellmembransaum um die aufgenommene Zelle zeigten, gewertet. 2.4. Durchflusszytometrie Die durchflusszytometrischen Messungen wurden mit einem Gallios von Beckman Coulter durchgeführt. Die gewonnenen Daten wurden als LMD-Dateien gespeichert und mit der Software Kaluza 1.2 ausgewertet. Das Gerät misst die Eigenschaften von einzelnen Zellen anhand der von ihnen erzeugten Lichtstreuung und Fluoreszenzemission. Die Zellen werden durch eine Kapillare gesaugt und passieren im sogenannten Probenstrom die Durchflusszelle, welche umgeben ist von Mantelflüssigkeit. Dadurch kommt es zum Prozess der hydrodynamischen Fokussierung. Zusätzlich vibriert die Öffnung der Durchflusszelle, sodass einzelne Tropfen entstehen, die jeweils nur eine einzelne Zelle enthalten. Die Zellen werden einzeln von einem fokussierten Laserstrahl getroffen und streuen das Licht im flachen Winkel (Vorwärtsstreuung) und im rechten Winkel (Seitwärtsstreuung). Das Vorwärtsstreulicht gibt Auskunft über die Größe der Zelle, das Seitwärtsstreulicht über die Granularität der Zelle. Außerdem können intrazelluläre und extrazelluläre Moleküle mit Fluorochromen markiert werden, sodass die Zellen bei Passage des Laserstrahls zusätzlich Fluoreszenzsignale emittieren. Diese Methode erlaubt eine Bestimmung der Expression von bestimmten Molekülen und ebenso eine Aussage über die Integrität der Zellmembran und den Zellzyklus anhand des DNA-Gehalts. 2.4.1. Bestimmung der Zellmorphologie und Zellviabilität Anhand der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung können lebende und tote Zellen einer Zelllinie unterschieden werden. Im Allgemeinen zeichnen sich sterbende Zellen durch eine starke Zunahme der Granularität und eine Abnahme der Zellgröße aus. Dadurch erscheinen sie in einem Punktewolkendiagramm, bei dem die Granularität (Seitwärtsstreuung) gegen die Zellgröße (Vorwärtsstreuung) aufgetragen wird, als distinkte Zellpopulation, die oberhalb der vitalen Zellpopulation liegt. Nach Hitze-Behandlung (45 min bei 56 °C) nimmt die Zellgranularität erheblich zu (Abbildung 1). Zur Überprüfung des eingesetzten Mengenverhältnisses von 1 zu 1 zwischen vitalen und aufzunehmenden Zellen wurden die 46 Parameter Zellgröße und Granularität während des Phagozytose-Versuchs zum Beginn der Koinkubation durchflusszytometrisch bestimmt. Abbildung 1: Punktewolkendiagramm zur Darstellung von Zellgröße und Granularität Durchflusszytometrische Messung von hyperthermierten und vitalen Zellen zum Beginn der Koinkubation. Im Punktewolkendiagramm ist die Vorwärtsstreuung (FS INT), welche die Zellgröße beschreibt, gegen die Seitwärtsstreung (SS INT), die eine Aussage über die Granularität gibt, aufgetragen. Zur genaueren Analyse der Form des Zelltods nach Hitzebehandlung und Bestrahlung wurden die Zellen mit 7-AAD und AnxA5-APC gefärbt. AnxA5-APC färbt Phosphatidylserin an, ein Membranlipid, das bei der Apoptose auf die Außenseite der Zellwand gelangt. 7-AAD diffundiert in Zellen mit insuffizienter Zellmembran und lagert sich dort an die DNA an. Intakte Zellen bleiben sowohl für 7-AAD als auch für AnxA5-APC negativ (Abbildung 2A). Apoptotische Zellen sind AnxA5-APC positiv und 7-AAD negativ, da sich die apoptotische Zelle in Membran-umschlossene Vesikel verpackt, sodass die DNA nicht für 7-AAD zugänglich wird. Nekrotische Zellen werden für beide Farbstoffe positiv, weil die Zellmembran durchlässig wird (Abbildung 2B). Bei der durchflusszytometrischen Messung wurde darauf Wert gelegt, dass nur Einzelzellen gewertet wurden. Adhärente Zellen neigen zur Bildung von Zellaggregaten, die die Auswertung verfälschen können. Deshalb wurden die Zellaggregate ausgeschlossen, indem in einem Punktewolkendiagramm die Zellgröße (FS INT) gegen die Zeit, welche die Zelle zur Passage des Laserstrahls benötigt (FL9 TOF), aufgetragen wurden (Abbildung 2C). 47 Abbildung 2: Durchflusszytometrische Messung zum Nachweis von Apoptose, Nekrose und Zellaggregaten Punktewolkendiagramm zum Nachweis von Apoptose und Nekrose nach AnxA5 und 7AAD-Färbung von unbehandelten (A) und hyperthermierten (56 °C für 45 min) Pankreaskarzinom-Zellen (B). Zum Ausschluss von Zellaggregaten wurden Punktewolkendiagramme von Zellgröße (FS INT) gegenüber Passage-Zeit (FL9 TOF) erstellt (C). Für diese Färbung wurden die Zellen zunächst durch Zugabe von Trypsin abgelöst. Dabei galt für die bestrahlten Zellen die Änderung, dass zu Beginn das Medium, sowie anschließend die Waschlösung und das Trypsin in Zentrifugenröhrchen überführt werden mussten, damit keine schwimmenden, toten Zellen verloren gingen. Die Zellen wurden bei 300 g für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellsediment in 1 ml Medium resuspendiert. Zur Messung von Duplikaten je Bedingung wurden je 500 µl in zwei RundbodenRöhrchen überführt. Pro Röhrchen wurden 2 µl Höchst pipettiert und diese 1,5 h im Brutschrank inkubiert. Nach anschließender Zentrifugation (10 min bei 300 g) wurden die Sedimente in je 200 µl Ringerlösung resuspendiert und auf Eis gestellt. Daraufhin wurden je Röhrchen jeweils 5 µl 7-AAD und AnxA5-APC zugegeben und nach vorsichtigem Mischen für 30 min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden weitere 200 µl Ringerlösung in jedes Röhrchen pipettiert und die Proben sofort mit dem Durchflusszytometer gemessen. 2.4.2. Messung der Zell-Adhäsion Während des Phagozytose-Versuchs wurde nach 60 min Koinkubation die Adhäsion zwischen unbehandelten, CTOG- gefärbten und behandelten CTFRgefärbten Zellen durchflusszytometrisch quantifiziert. Grüne, CTOG-gefärbte phagozytische Zellen (FL1 positiv) binden, im Vergleich zur Adhäsions-Rate mit roten, CTFR-gefärbten unbehandelten Zellen, verstärkt an nekrotische Zellen. Mit einem Punktewolkendiagramm wurden die Zellpopulationen dargestellt, in48 dem die Signale des grünen Fluoreszenzkanals (FL1) gegen die Signale des roten Fluoreszenzkanals (Fl6) aufgetragen wurden (Abbildung 3). Die Adhäsion wurde als der Anteil doppelt-positiver Zellen dividiert durch den Anteil aller grüngefärbten Zellen kalkuliert. Abbildung 3: Messung der Adhäsion Durchflusszytometrische Messung von CTFR-gefärbten, hyperthermierten und CTOGgefärbten, vitalen Zellen nach 60 min Koinkubation in Suspension. Im Punktewolkendiagramm sind die Signale des grünen Fluoreszenzkanals (FL1 INT) gegen die Signale des roten Fluoreszenzkanals (FL6 INT) aufgetragen. CTFR: Celltrace Far Red; CTOG: Celltrace Oregon Green. Mikroskopisch wurde bestätigt, dass zum Messzeitpunkt nach 60 min noch keine Phagozytose-Ereignisse stattgefunden hatten. Diese Messung stellt also lediglich die Adhäsion zwischen grünen, vitalen und roten, nekrotischen Zellen dar und nicht die Phagozytose. 2.5. Messung der Konzentration der zellulären Proteine aus Zelllysaten und von freigesetztem HSP70 nach Hyperthermie Zur genaueren Charakterisierung der hyperthermierten Zellen wurde der Effekt von Hitze-Behandlung (45 min bei 56 °C) in Bezug auf den Gesamt-ProteinGehalt von Zellen und die Freisetzung von HSP70 untersucht. Für die Protein-Isolierung wurden die Zellen trypsiniert und mit kaltem PBS gewaschen. Zusätzlich wurde eine Probe mit hyperthermierten Zellen vorbereitet. Eine definierte Anzahl von Zellen wurde mit Verwendung des RIPA-Puffers (radioimmunoprecipitation assay) 30 min auf Eis lysiert, wobei 50 µl Puffer pro 106 Zellen pipettiert wurden. Anschließend wurden die Zelllysate 8 min bei 13000 g 49 zentrifugiert und die Überstände gesammelt. Die Protein-Konzentration wurde mit dem bicinchoninic acid assay kit (BCA kit) bestimmt. Um die Freisetzung von HSP70 nach Hitzeschock nachzuweisen, wurde ein Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) verwendet. Dazu wurden Überstände von einer definierten Anzahl unbehandelter und Hitze-behandelter Zellen verwendet, die 4 h und 24 h in Suspensionskulturplatten inkubiert wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 300 g für 5 min entfernt und die Überstände 1 zu 10 verdünnt. Der HSP70 DuoSet IC ELISA (R&D Systems) wurde nach Herstellerangaben durchgeführt, die Signalstärke nach Farbumschlag mit einem Photometer bei 450 nm und 570 nm gemessen und mit der HTSoft Software ausgewertet. 2.6. Immunfluoreszenz-Färbung Die Immunfluoreszenz-Färbung ist eine geeignete Methode, um spezifisch intrazelluläre, Transmembran- oder Oberflächenproteine zu markieren und durch Fluoreszenz sichtbar zu machen. Bei der in dieser Arbeit verwendeten indirekten Immunzytochemie wird zuerst ein Primär-Antikörper, der gegen das zu färbende Protein gerichtet ist, auf die Probe gebracht und anschließend ein Sekundär-Antikörper, der mit einem Fluorochrom gekoppelt ist und an das FcFragment des Primär-Antikörpers bindet. Zur Überprüfung einer möglichen Induktion von aktivierter Caspase-3abhängiger Apoptose wurde eine Immunfluoreszenz-Färbung nach 4 h und 15 h Koinkubation von vitalen mit hyperthermierten (56 °C, 45 min) Pankreaskarzinom-Zellen durchgeführt. Des Weiteren wurden mittels ImmunfluoreszenzFärbung T-Zell-Leukämiezellen anhand des CD2 T-Zell-Antigens im Phagozytose-Versuch sichtbar gemacht. Außerdem wurde die Lokalisation von LC3, LAMP1, F-Aktin, phosphoryliertem Ezrin und E-Cadherin in Zell-in-Zell Strukturen, ausgebildet von Pankreaskarzinom-Zellen nach Hitzebehandlung, zu den Zeitpunkten 2,5 h, 3,5 h und 5 h quantifiziert. Diese Lokalisation wurde auch bei angewachsenen Pankreaskarzinom-Zellen, auf die hyperthermierte Zellen zentrifugiert wurden, untersucht. Weiterhin wurde die Akkumulation von HSP70 in den hyperthermierten Pankreaskarzinom-Zellen nach 4 h, 8 h und 22 h Koinkubation und die Expression von P-Cadherin bei unbehandelten BxPC-3-Zellen nachgewiesen. 50 2.6.1. Färbe-Verfahren Die in den Phagozytose-Versuchen hergestellten Objektträger wurden nach dem dritten Waschschritt nach der Fixierung in Quadripermschalen mit jeweils 7 ml Blockier-Lösung überschichtet und 1 h bei RT in einer Feuchtkammer inkubiert. Es folgten drei Waschschritte mit 1x TBS und die Überschichtung mit dem in 1 %-BSA in 1x TBS verdünnten Primär-Antikörper. Zur vollständigen Benetzung der Zellen wurde Parafilm aufgebracht. Die Objektträger wurden über Nacht in einer Feuchtkammer im Kühlschrank inkubiert. Nach Wiederholung der Waschschritte wurde der verdünnte SekundärAntikörper mit Parafilm aufgebracht und die Objektträger wurden 2 h bei RT in der Feuchtkammer inkubiert. Nach drei weiteren Waschschritten wurden die Objektträger in der Feuchtkammer mit 50 µl DAPI-Lösung und Parafilm benetzt, um die Nuklei blau zu färben. Nach 1 min wurden die Objektträger kurz in bidestilliertes Wasser getaucht und zum Trocknen im Dunkeln aufgestellt. Nach dem Eindecken mit VectashieldMedium und Auflegen eines Deckglases wurden die Objektträger im Kühlschrank bei 6 – 8 °C gelagert. Alle verwendeten Antikörper und Lösungen sind in den Tabellen 4, 5 und 8 aufgeführt. 2.6.2. Quantifizierung der Lokalisation von Phagozytose-assoziierten Proteinen Die Häufigkeit der gerichteten Akkumulation von LC3, LAMP1, F-Aktin, phosphoryliertem Ezrin und E-Cadherin an Zell-Zell Kontakten sowie in Zell-in-Zell Strukturen, wurde im engen Zeitrahmen (2,5 h, 3,5 h und 5 h Koinkubation) quantifiziert. Dabei wurde untersucht, ob eine sichtbare Verdichtung der untersuchten Proteine während des Phagozytose-Prozesses an der Kontaktstelle zur hyperthermierten Zelle vorzufinden war und, ob die Proteine ringförmig um die aufgenommen Zelle innerhalb der Zell-in-Zell Struktur vorlagen. Um dies zu erreichen, wurden je Bedingung und Färbung sechs Rasterbilder mit dem Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Es wurde der Anteil aller gerichteten Lokalisationen von allen in jeweils sechs Rasteraufnahmen zu erkennenden Adhäsions- und Phagozytose-Ereignissen mit dem Bild-Analyse Programm Biomas ermittelt. 51 2.7. Immunhistochemie Neben den Versuchen mit Zelllinien wurden außerdem histologische Schnitte von Tumorgewebe-Proben auf die Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen untersucht. Zur Identifizierung von aufgenommenen, apoptotischen Zellen wurde eine Färbung für die aktivierte Caspase 3 durchgeführt. 2.7.1. Auswahl von Gewebeproben Tumorgewebe-Proben von 416 Patienten aus sieben verschiedenen Kohorten (Tabellen 13 – 15) wurden auf das Vorhandensein von Zell-in-Zell Strukturen hin untersucht. Die Phagozytose-Ereignisse in fünf Kohorten von Kopf-HalsPlattenepithelkarzinomen (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) und in je einer Kohorte von Rektum-und Analkarzinomen wurden quantifiziert. Alle Proben wurden zu Tissue-Microarrays (TMAs) mit Gewebestanzen von 1,6 – 2 mm Durchmesser verarbeitet. Die zugehörigen klinischen Daten wurden von der Datenbank des Tumorzentrums der Universität Erlangen-Nürnberg zur Verfügung gestellt. Alle Patienten hatten eine Einverständniserklärung für die Nutzung der Gewebeproben und der klinischen Daten unterschrieben. Die Studie wurde von dem Ethikkomitee des Universitätsklinikums Erlangen bewilligt. 2.7.2. Färbung von histologischen Schnitten Zur Färbung von aktivierter Caspase 3 wurden die Schnitte zunächst über Nacht mit dem Primär-Antikörper und anschließend zur Amplifikation des Signals mit einem Biotin-gekoppelten Sekundär-Antikörper inkubiert. Mit einem Streptavidin-biotinylierten alkalische Phosphatase-Komplex und einem Chromogen (Fast Red) wurde das Caspase 3 Signal sichtbar gemacht. Die Färbung von E-Cadherin erfolgte mit einem automatischen Ventana BenchMark Ultra stainer unter Verwendung von CC1-Puffer (Cell Conditioning Solution 1). Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin oder DAPI gefärbt. 52 2.7.3. Quantifizierung von Phagozytose-Raten in histologischen Präparaten Die Phagozytose-Raten wurden mithilfe der Bildbearbeitungs-Software Biomas bestimmt. Pro Patient wurden mindestens zwei TMA Gewebestanzen mit einer Fläche von 0,75 mm2 ausgewertet. Mit der Software wurden die aufeinanderfolgenden Schnitte, die mit E-Cadherin bzw. aktivierter Caspase 3 gefärbt worden waren, zusammengefügt, sodass eine Auswertung der Häufigkeit von Zell-inZell Strukturen und von Apoptose in demselben Gebiet möglich war. 2.8. Mikroskopie Zur Beobachtung und molekularen Charakterisierung von PhagozytoseEreignissen, sowie deren Quantifizierung, wurden die in den Versuchen hergestellten Objektträger, sowie die histologischen Präparate, mikroskopisch untersucht. Dabei fanden neben Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie ebenso konfokale und Lebendzell-Mikroskopie Anwendung. 2.8.1. Fluoreszenz- und Phasenkontrastmikroskopie Für die Quantifizierung der Phagozytose-Raten und der qualitativen sowie quantitativen Auswertung nach Immunfluoreszenz-Färbung wurde entweder das Leica DM6000B (Leica Microsystems Ltd.) Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer Kamera (DFC350FX, Leica), oder das Zeiss Axioplan 2 Imaging (Zeiss) Fluoreszenmikroskop, ausgestattet mit einer Kamera (Cool Cube 1, Zeiss), verwendet. Die Objektive mit 40-, 63- und 100-facher Vergrößerung wurden genutzt (HCX PL APO, 40x, NA: 1,25, Leica; Plan-Neofluar, 40x, NA: 0,75, Zeiss; Plan-Apochromat, 63x, NA: 1,4, Zeiss). Mithilfe der Mikroskop-Software Metafer 4 (MetaSystems) und Leica Application Suite V3 (Leica) wurden Einzelbilder für die qualitative Untersuchung und Rasteraufnahmen (8*8 Bilder) für die quantitative Untersuchung aufgenommen. Die gefärbten TMAs wurden mit einem Hochdurchsatz Scanner (Mirax MIDI Scan, Zeiss), ausgestattet mit einem Plan-Apochromat Objektiv (20x; NA: 0,8, Zeiss) und einer Kamera (Stingray F146C, AVT), mikroskopiert. Die Bildbearbeitung und Auswertung wurde mit den Programmen Biomas und Photoshop und durchgeführt. 53 2.8.2. Konfokale Mikroskopie Mithilfe von konfokaler Mikroskopie wurde der vollständige Membranumschluss um die aufgenommene, hyperthermierte Zelle verifiziert. Dafür wurden Zytozentrifugation-Präparate aus den Phagozytose-Versuchen (siehe 2.3.4) verwendet. Die Aufnahmen wurden mit einem Zeiss LSM710 (Zeiss) LaserScanning-Mikroskop, ausgestattet mit einem Plan-Apochromat Objektiv (63x; NA: 1,4; Zeiss), gemacht. Die Bildaufnahme und –Verarbeitung wurde mit der Mikroskop-Software ZEN (Zeiss) durchgeführt. Alle 3D-Projektionen wurden mit dem Bildbearbeitungs-Programm ImageJ erstellt. 2.8.3. Lebendzell-Mikroskopie Zur Verfolgung des zeitlichen Ablaufs von Phagozytose-Ereignissen wurden primäre Kopf-Hals-Tumorzellen (p26) mittels Lebendzell-Mikroskopie bis zu 24 h beobachtet. Dafür wurde ein Phagozytose-Versuch mit hyperthermierten Zellen vorbereitet, wobei auf die Vital- sowie die Kern-Färbung verzichtet wurde. Anschließend wurden 3 ml der Zellsuspension in eine SuspensionsKulturplatte mit sechs Näpfchen überführt. Zur Beobachtung wurde ein Zeiss Axioplan 200 Mikroskop, ausgestattet mit einem Plan-Neofluar Objektiv (20x; NA: 0,5; Zeiss) und einer Digitalkamera (C4742-95, Hamamatsu), verwendet. Die Zellen befanden sich während der Aufnahmen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2. Die aufgenommenen Bilder wurden mit den Programmen Volocity (PerkinElmer) und ImageJ (NIH) zu einem Film zusammengesetzt. 2.9. Messung der Genexpression Zur Bestimmung der Expression von Phagozytose-assoziierten Genen wurde aus Phagozytose –kompetenten und –inkompetenten Zellen RNA isoliert. Nach anschließender Herstellung der copy DNA (cDNA) wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) die Expression der zu studierenden Gene (CD36, CD68, ITGB5 und TIM1) untersucht. 2.9.1. RNA-Isolation und reverse Transkription Die Isolation von RNA für die qRT-PCR wurde unter Verwendung des Qia shedder und RNeasy mini kit nach Herstellerangaben ausgeführt. Die Integrität 54 der extrahierten RNA wurde durch Messung der 260 zu 280 nm und 260 zu 230 nm Verhältnisse mit einem Spektrophotometer verifiziert. Mit dem QuantiTect reverse transcription kit wurden jeweils 2 µg RNA in cDNA umgeschrieben und für die Nicht-Reverse-Transkriptase Kontrolle zusätzlich 0,5 µg RNA mitgeführt. 2.9.2. Quantitative PCR Für die Durchführung der PCR wurden das DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit und das Bio-Rad CFX Real-Time System verwendet. Die gemessenen mRNA Mengen von CD36, CD68, ITGB5 und TIM1 wurden auf den Mittelwert von drei Referenzgenen (L3MBTL2, GIGYF2 und RPUSD3) normiert, um eine Aussage über die relative Quantität der untersuchten Gene treffen zu können. Die Auswahl der am besten geeigneten Referenzgene wurde zusammen mit der Stabilität von Referenz- und Zielgenen mit Hilfe des Programms qbase und dem darin verwendeten Algorithmus geNorm bestimmt. Die GenexpressionsAnalysen wurden mit der CFX Manager Software berechnet. Die verwendeten Oligonukleotide (Tabelle 2) wurden mithilfe von Primer3 input erstellt. Zunächst wurden einige Test-Reaktionen mit einem cDNA-Pool bestehend aus allen verwendeten cDNAs durchgeführt. Zuerst wurden die optimale Konzentration des jeweiligen Oligonukleotid-Paares (100 – 400 nM) und die optimale Temperatur der Hybridisierungsphase mithilfe eines Temperaturgradienten ermittelt. Entsprechend der vorangegangenen Tests, wurde die Amplifikationseffizienz eines jeden Oligonukleotid-Paares mit einer Standardkurve, bei welcher der cDNA-Pool in insgesamt 5 Schritten mit dem Faktor 1 zu 10 verdünnt wurde, getestet. Außerdem wurde das Reaktionsprodukt auf ein Agarosegel aufgetragen, um die Länge des gebildeten Amplikons und das Vorhandensein von Oligonukleotid-Dimeren zu überprüfen. 2.10. Statistik Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. IBM SPSS Statistics 19 wurde für die Berechnung von signifikanten Unterschieden zwischen unabhängigen Gruppen mithilfe des ungepaarten t-Tests verwendet. Für die histologischen Daten wurden der Kolmogorov–Smirnov und der Lilliefors Test angewandt, um die Normalverteilung zu überprüfen. Das Überleben ohne 55 lokales Therapieversagen, das Metastase-freie und das Gesamt-Überleben wurden nach Kaplan Meier kalkuliert. Mit Hilfe des log-rank Tests wurden die Überlebenszeiten zwischen Untergruppen von Patienten verglichen. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant erachtet. 56 3. Ergebnisse 3.1. Nachweis der Phagozytose Die Phagozytose-Aktivität von nicht-professionellen Phagozyten wurde anhand von Tumorzellen und normalen Hautfibroblasten mithilfe eines PhagozytoseVersuchs in einem Suspensionskultur-System studiert. Nach Induktion der primären Nekrose durch Hitze-Behandlung oder Bestrahlung mit Röntgenstrahlung folgte eine Koinkubation mit unbehandelten, lebenden Zellen, welche die sterbenden Zellen innerhalb weniger Stunden aufnahmen. Zur Unterscheidung der nekrotischen und vitalen Zellen wurden die Zellen zu Beginn des Versuchs mit Vital-Farbstoffen (Celltrace Oregon Green und Celltrace Far Red) grün und rot markiert. Die verwendeten Farbstoffe reichern sich im gesamten Zytoplasma an, indem sie an zelleigene Proteine kovalent binden und färben dadurch die gesamte Zelle mit Ausnahme des Zellkerns homogen an. Die rot-gefärbten Zellen wurden abgelöst und im Wasserbad bei 56 °C für 45 min hyperthermiert. Die Phagozytose-Versuche mit Bestrahlung wichen insofern von diesem Versuchsablauf ab, als dass die Bestrahlung vor der Vital-Färbung durchgeführt wurde. Die Koinkubation der behandelten, rot-gefärbten Zellen mit vitalen, grüngefärbten Zellen in Suspensions-Kulturplatten für 4 h resultierte in der Bildung von phagozytischen Strukturen. Diese waren durch das Vorhandensein eines an die Zell-Peripherie gedrängten sichelförmigen Zellkerns der phagozytischen Zelle, bedingt durch die Aufnahme einer nekrotischen Zelle, gekennzeichnet. Die vollständige Aufnahme von hyperthermierten Zellen bei einem Phagozytose-Versuch mit den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 wurde mit konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie nachgewiesen (Abbildung 4). 57 Abbildung 4: Nachweis der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie Die konfokalen Aufnahmen eines Phagozytose-Ereignisses aus einem PhagozytoseVersuch nach Hyperthermie mit den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 verifizieren den vollständigen Membranumschluss der grün-gefärbten (CTOG), vitalen Zelle um die rotgefärbte (CTFR), hyperthermierte Zelle. Gezeigt werden zehn Bild-Ebenen (A), eine 3D Projektion und jeweils fünf Ebenen der orthogonalen XZ- und YZ-Projektionsflächen (B). Die Zellkerne sind mit Hoechst 33342 blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Zur Überprüfung, ob nach Ablauf der Phagozytose die nekrotische Zelle vollständig von der intakten Zellmembran der phagozytischen Zelle umschlossen wurde, wurden die Zellen nach einem Phagozytose-Versuch mit 7-AAD gefärbt. Dabei blieben nur die lebenden und die hyperthermierten Zellen, die bereits vollständig aufgenommen worden waren, negativ für 7-AAD (Abbildung 5A). Der Ablauf eines Phagozytose-Ereignisses von Kopf-Hals-Tumorzellen wurde ebenfalls mithilfe von Lebendzellmikroskopie dokumentiert (Abbildung 5B). 58 Abbildung 5: Nachweis der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit Fluoreszenz- und Lebendzell-Mikroskopie Zur Überprüfung des vollständigen Membranumschlusses durch die phagozytische, grün-gefärbte (CTOG) Zelle um die hyperthermierte, ungefärbte Zelle wurden BxPC-3 Pankreaskarzinom-Zellen nach dem Phagozytose-Versuch mit den DNA-Farbstoffen DAPI (blau) und 7-AAD (rot) angefärbt. Freie, nekrotische Zellen wurden mit dem Membran-impermeablen Farbstoff 7-AAD gefärbt, wohingegen vitale sowie phagozytierte Zellen negativ für 7-AAD blieben (A). Ein charakteristisches PhagozytoseEreignis wurde mittels Lebend-Zell-Mikroskopie aufgenommen. Dargestellt ist der Aufnahme-Prozess einer hyperthermierten Zelle bei der primären Kopf-Hals-Tumorzelllinie p26 (B). CTOG: Celltrace Oregon Green; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.2. Induktion von Nekrose und Phagozytose Nach starker Schädigung der Zellmembran durch physikalische Einflüsse, wie zum Beispiel Hitze-Behandlung, tritt die primäre Nekrose ein. Als weitere Noxe wurde ionisierende Bestrahlung verwendet. Der Anteil von nekrotischen Zellen wurde mithilfe des Zellmembran-impermeablen DNA-Farbstoffs 7- Aminoactinomycin (7-AAD) durchflusszytometrisch bestimmt. Außerdem wurde eine Induktion der Caspase-3-abhängigen Apoptose durch ImmunfluoreszenzFärbung untersucht. Dabei wurde insbesondere der Fragestellung nachgegangen, ob bestrahlte Zellen in Apoptose gehen können, nachdem sie phagozytiert wurden. 3.2.1. Hyperthermie Die Behandlung mit Hyperthermie im Wasserbad bei 56 °C für 45 min induzierte in 100 % der behandelten Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 unmittelbar nach der Behandlung den nekrotischen Zelltod. Wurden die Zellen mit niedrigeren Temperaturen (48 °C) behandelt, trat die Membranpermeabilität für 7-AAD erst 59 24 h nach Behandlung ein (Abbildung 6A). Alle in dieser Doktorarbeit beschriebenen Experimente zur Phagozytose von hyperthermierten, nekrotischen Zellen, wurden mit einer Behandlung bei 56 °C für 45 min durchgeführt. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde untersucht, ob durch die Behandlung mit Hyperthermie der Caspase-3-abhängige, apoptotische Zelltod induziert wurde. Die Aktivierung und Spaltung von Procaspase-3 zur aktivierten Caspase-3 stellt ein spätes Ereignis in der Apoptose dar und variiert abhängig von der Behandlung und der Zelllinie, sodass die Dauer zur messbaren Aktivierung von Caspase 3 in der Regel innerhalb weniger Stunden nach Stimulus auftritt, aber auch verzögert eintreten kann (Jessel, Haertel et al. 2002, Hartel, Zorn-Kruppa et al. 2003). Um eine spätere Aktivierung von Caspase 3 erfassen zu können, wurde die Koinkubation von 4 h zusätzlich auf eine Dauer von 15 h nach Behandlung verlängert. Auf diese Weise konnte außerdem sichergestellt werden, dass die durch die Hitze-Behandlung denaturierten Caspase-3 Enzyme bei einer Induktion von Apoptose erneut exprimiert und aktiviert worden wären. Alle mikroskopierten Phagozytose-Ereignisse waren negativ für die Färbung von aktivierter Caspase-3 (Abbildung 6B). Die Induktion von Caspase-3abhängiger Apoptose durch Hyperthermie konnte dadurch ausgeschlossen werden. Abbildung 6: Analyse der Induktion der Zelltodesformen Apoptose und Nekrose nach Hyperthermie Die Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 wurden bei verschiedenen Temperaturen für 45 min inkubiert. Zur Unterscheidung der induzierten Zelltodesform wurden die Zellen unmittelbar nach Behandlung, 4 h oder 24 h nach Behandlung mit 7-AAD und AnxA5APC gefärbt und durchflusszytometrisch gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei voneinander unabhängigen Versuchen (A). Die Aktivierung von Caspase 3 (rot) wurde in Phagozytose-Ereignissen von hyperthermierten BxPC-3-Zellen nach 4 h und 20 h Koinkubation mit CTOG-gefärbten, vitalen Zellen 60 (grün) untersucht (B). Die Zellkerne sind mit DAPI blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Im nächsten Schritt wurden die Überlebensraten nach HyperthermieBehandlung mit verschiedenen Temperaturen mit einem Koloniebildungstest eruiert (Abbildung 7). Vergleichsweise milder Hitzeschock bei 40 °C resultierte in Überlebensraten von 75 % bei den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3, nach Hitze-Behandlung bei 45 °C hingegen schrumpfte die Überlebensrate auf 6 %. Bei Behandlung mit 56 °C fand keine Proliferation statt. Abbildung 7: Koloniebildungspotenzial nach Hitze-Behandlung Dargestellt sind die relativen Werte in Bezug zur unbehandelten Kontrolle (Kontrolle=100 %). Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen, in Triplikaten durchgeführten, Versuchen. **p < 0,01, ***p ≤ 0,001. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.2.2. Bestrahlung Ionisierende Strahlung wurde als weitere Methode zur Induktion von Zelltod, der eine Phagozytose stimuliert, gewählt. Verschiedene Dosen und Inkubationszeiten nach Bestrahlung wurden mit drei verschiedenen Zelllinien getestet (Abbildung 8). Bei Jurkat T-Zell-Leukämiezellen konnte eine Nekrose-Induktions-Rate von 41 % nach einer Bestrahlung mit 8 Gy und drei Tagen Inkubationszeit bei 37 °C im CO2-Inkubator erzielt werden. Zugleich wurde ein Anteil apoptotischer Zellen von 19 % gemessen. Aufgrund der notwendigen Inkubationsdauer nach Bestrahlung und des Anteils apoptotischer Zellen ist es möglich, dass es sich bei der hier beobachteten Membrandurchlässigkeit für 7-AAD um sekundäre Nekrose handelt. Ein Anteil von 75 % der Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 wurde durch Bestrahlung mit 20 Gy und anschließender Inkubationsdauer von sechs Tagen nekrotisiert. Apoptotischer Zelltod wurde dabei in 14 % der bestrahlten Zellen induziert. Die primäre Kopf-Hals-Tumorzelllinie p26 wurde mit fünf Fraktionen von je 2 Gy im Abstand von 24 h bestrahlt. Nach der anschließenden Inkubationsdauer von 61 drei Wochen waren 40 % der Zellen nekrotisch und 44 % der Zellen apoptotisch. Abbildung 8: Induktion von Zelltod bei mehreren Zelllinien durch Bestrahlung und Hitze-Behandlung Die Induktion von Apoptose (AnxA5/7-AAD + −) und Nekrose (AnxA5/7-AAD + +) nach Bestrahlung (IR), Hitze-Behandlung (HT) und in unbehandelten Zellen (K) wurde durchflusszytometrisch bestimmt. Die dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten und Standardabweichungen aus drei voneinander unabhängigen Versuchen. K: Kontrolle; IR: bestrahlt; HT: hyperthermiert; Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Die durchflusszytometrische Messung hat gezeigt, dass durch Bestrahlung auch Apoptose ausgelöst wurde. Deshalb wurde mittels ImmunfluoreszenzFärbung von aktivierter Caspase-3 überprüft, ob neben den bestrahlten, nekrotischen Zellen auch apoptotische Zellen aufgenommen werden konnten. Die mikroskopische Analyse verdeutlichte, dass ein kleiner Anteil der internalisierten bestrahlten Jurkat Zellen positiv für die aktivierte Caspase-3 und damit apoptotisch war (Abbildung 9). Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass nichtprofessionelle Phagozyten wie Pankreaskarzinom-Zellen auch apoptotische Zellen beseitigen können. Zudem wird dadurch klar, dass die apoptotischen Zellen viele Stunden nach Internalisierung noch enzymatisch aktiv sind anstatt sofort von der phagozytischen Zelle lysosomal abgebaut zu werden. 62 Abbildung 9: Phagozytose von apoptotischen Zellen nach Bestrahlung Die Aktivierung von Caspase 3 (rot) wurde in Phagozytose-Ereignissen von bestrahlten Jurkat T-Zellen nach 4 h (A) und 20 h (B) Koinkubation mit CTOG-gefärbten (grün), vitalen Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 untersucht. Die Isotypkontrolle (rot) bestätigt die Spezifität des verwendeten Antikörpers gegen aktivierte Caspase 3 (C). Die Zellkerne sind mit DAPI blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; IR: bestrahlt; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.3. Phagozytose von hyperthermierten Zellen Der Versuchsablauf beinhaltete die Vitalfärbung, Hitze-Behandlung einer Probe und die homotypische (eine Zelllinie) sowie heterotypische (zwei Zelllinien) Koinkubation mit der unbehandelten Probe in Suspension für 4 h. Anschließend wurden die Zellen auf Objektträger zentrifugiert, mikroskopiert und die Phagozytose-Ereignisse mit einem Bildanalyse-Programm quantifiziert. Außerdem wurden der Hyperthermie-induzierte Protein-Verlust und die HSP70-Freisetzung nachgewiesen. Zudem wurde der Einfluss von freigesetzten DAMPs durch die Behandlung mit Hyperthermie sowie die Rolle von FBS bei der Phagozytose betrachtet. Darüber hinaus wurden angewachsene Zellen mit hyperthermierten Zellen für 4 h überschichtet, um die Phagozytose-Aktivität im Zellverband, der für adhärente Zelllinien eine natürlichere Bedingung darstellt als das Suspensionssystem, untersucht. 3.3.1. Quantifizierung der homotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen Der Phagozytose-Versuch zur Aufnahme von hyperthermierten Zellen wurde mit elf Zelllinien durchgeführt. Damit sollte untersucht werden, ob es sich um ein Zelltyp-selektives Phänomen handeln könnte. Zu den verwendeten Zelllinien 63 zählten die Pankreaskarzinom-Zelllinie BxPC-3, die Glioblastom-Zelllinien U87, U138, U251 und T98G, die primäre Kopf-Hals-Tumorzelllinie p26, die primären Hautfibroblasten-Zelllinien MZF16 und SBLF5, embryonale NierenepithelZelllinie HEK293, Epstein-Barr-Virus-transformierte lymphoblastoide Zellen SBL1 eines gesunden Spenders und Jurkat T-Zell-Leukämiezellen. Es stellte sich heraus, dass nur adhärente Zelllinien fähig waren, nekrotische Zellen aufzunehmen. Die Phagozytose-Raten schwankten zwischen 0,5 % und 2,8 % (Abbildung 10). Die Suspensionszellen SBL1 und Jurkat sowie die semiadhärente Zelllinie HEK293 zeigten keine Phagozytose-Aktivität. In drei Zelllinien (U87, p26 und SBLF5) wurden außerdem wenige Phagozytose-Ereignisse, in denen unbehandelte Zellen aufgenommen wurden, nachgewiesen. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass diese Zellen, bedingt durch die Kultur in Suspension oder das vorherige Trypsinieren, geschädigte oder sterbende Zellen repräsentieren. Abbildung 10: Homotypische Phagozytose-Raten von verschiedenen Zelllinien Das phagozytische Potenzial von sechs verschiedenen Tumorzelllinien, zwei primären, gesunden Hautfibroblasten-Zelllinien, HEK293 Nierenepithel-Zellen, Jurkat T-Zellen und einer EBV-transformierten lymphoblastoiden Zelllinie eines gesunden Spenders (SBL1) wurde mikroskopisch quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus mindestens drei voneinander unabhängigen PhagozytoseVersuchen nach Hitze-Behandlung (A). Gezeigt werden charakteristische homotypische Phagozytose-Ereignisse der Zelllinien BxPC-3 (Ba), U87 (Bb), U251 (Bc), p26 (Bd), SBLF5(Be) und MZF16 (Bf). Vitale Zellen wurden mit CTOG grün, hyperthermierte Zellen mit CTFR rot gefärbt. Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red. Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 64 3.3.2. Quantifizierung der heterotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen Im nächsten Schritt wurde der Frage nachgegangen, ob die untersuchte nichtprofessionelle Phagozytose von nekrotischen Zellen auf die homotypische Interaktion beschränkt ist oder, ob auch nekrotische Zellen anderer Zelllinien internalisiert werden können. Durch kombinatorische Koinkubation von primären Hautfibroblasten, epithelialen Pankreaskarzinom- und Glioblastom-Zellen mit hyperthermierten primären Hautfibroblasten, Pankreaskarzinom-, Glioblastomund lymphoblastoiden Zellen wurden die heterotypischen PhagozytoseEreignisse quantifiziert. Dabei wurden stark voneinander abweichende Phagozytose-Raten ermittelt (Abbildung 11). Es zeigte sich, dass alle drei phagozytischen Zelllinien die höchsten Phagozytose-Raten bei der Koinkubation mit hyperthermierten, lymphoblastoiden Zellen (SBL1) erzielten, nämlich 3,0 % für BxPC-3, 2,5 % für SBLF5 und 4,8 % für T98G. Es wurden ebenfalls epitheliale Pankreaskarzinom-Zellen mit internalisierten primären Fibroblasten und Glioblastom-Zellen und vice versa ausgemacht. Die nächst-höchsten Phagozytose-Raten wurden mit hyperthermierten BxPC-3-Zellen, welche morphologisch deutlich kleiner sind als die übrigen untersuchten adhärenten Zellen, beobachtet. Dies lässt darauf schließen, dass kleinere Zellen schneller und effizienter aufgenommen werden als Zellen, die größer sind als der Phagozyt selbst. Abbildung 11: Heterotypische Phagozytose-Raten von verschiedenen Zelllinien Die Bildung von Phagozytose-Ereignissen nach Koinkubation von hyperthermierten Zellen mit vitalen Zellen verschiedener Zelllinien wurde mikroskopisch quantifiziert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen je Kombination (A). Abgebildet sind typische phagozytische Strukturen von vitalen BxPC-3-Zellen und hyperthermierten SBL1-Zellen (Ba), vitalen BxPC-3-Zellen und hyperthermierten SBLF5-Zellen (Bb), vitalen SBLF5-Zellen und hyperthermierten SBL1-Zellen (Bc), lebenden SBLF5-Zellen und hyperthermierten BxPC-3-Zellen (Bd), vitalen T98G und hyperthermierten SBL1-Zellen (Be) und vitalen T98G-Zellen und hy- 65 perthermierten BxPC-3-Zellen (Bf); Vitale Zellen wurden mit CTOG grün, hyperthermierte Zellen mit CTFR rot gefärbt. Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.3.3. Protein-Verlust und Freisetzung von HSP70 durch Hyperthermie Professionelle Antigen-präsentierende Zellen, wie dendritische Zellen, Makrophagen und B-Lymphozyten werden durch DAMPs, die von sterbenden Zellen freigesetzt werden, aktiviert (Matzinger 2002). Dieses intrazelluläre Material kann aber auch vorerst an der Zellmembran gebunden bleiben und dadurch Immunzellen aktivieren, wie es für F-Aktin gezeigt wurde (Ahrens, Zelenay et al. 2012). Zur Exposition und Freisetzung von DAMPs in die Umgebung zählen auch pro-phagozytische Signale, die auf sterbenden Zellen exponiert oder von ihnen abgeben werden (Grimsley and Ravichandran 2003). Nekrotische Zellen geben passiv intrazelluläres Material in ihre Umgebung ab. Daher wurde mit einem bicinchoninic acid assay (BCA) überprüft, ob auch die Hitze-behandelten Zellen einen Verlust von intrazellulärem Material aufweisen. Dafür wurden Pankreaskarzinom- Zellen (BxPC-3), Kopf-Hals-Tumorzellen (p26) und gesunden Hautfibroblasten (SBLF5) trypsiniert und eine Probe je Zelllinie hyperthermiert (45 min bei 56 °C). Anschließend wurden aus den Zelllysaten einer definierten Anzahl Zellen der jeweiligen Zelllinie die zellulären Proteine isoliert. Die photometrische Messung zeigte eine starke Reduktion der GesamtProtein-Konzentration bzw. einen vollständigen Verlust der Proteine nach Hyperthermie (Abbildung 12A). Dies verdeutlicht, dass die Behandlung primäre Nekrose induzierte. Im nächsten Versuch wurde die Freisetzung von HSP70 in den Überstand nach Hyperthermie bei Pankreaskarzinom-Zellen mit einem ELISA gemessen. Wie im Phagozytose-Versuch wurden die Zellen nach Behandlung 4 h in Suspension inkubiert. Zusätzlich wurden Proben für einen 24 h Wert hergestellt. Zur Kontrolle wurden unbehandelte Zellen mitgeführt. Es wurde keine signifikante Erhöhung der HSP70-Konzentration nach Hitze-Behandlung gemessen. Gegensätzlich zur Annahme, dass hyperthermierte Zellen eine erhöhte HSP70-Freisetzung zeigen würden, wurde eine vermehrte Sekretion von HSP70 bei den Proben mit vitalen Zellen gemessen. In diesen Proben war nach 4 h eine Konzentration von ca. 1250 pg/105 festzustellen, nach 24 h stieg 66 die HSP70-Konzentration auf ca. 2450 pg/105 an. Bei den hyperthermierten Zellen wurde eine vergleichsweise niedrige Konzentration von ca. 500 pg/105 Zellen nach 4 h in Suspension und von ca. 1000 pg/105 nach 24 h in Suspension nachgewiesen. Unabhängig von der Behandlung wurden in beiden Proben eine Verdopplung der HSP70-Freisetzung nach 4 h zum 24 h Wert gemessen (Abbildung 12B). Abbildung 12: Einfluss von Hyperthermie auf die Gesamt-Protein-Konzentration und die Freisetzung von HSP70 Die Gesamt-Protein-Konzentration der unbehandelten (K) und hyperthermierten (HT) Zelllysate mehrerer Zelllinien wurde nach Durchführung eines BCA-Versuchs photometrisch gemessen (A). Die Konzentration von HSP70 in den Überständen von vitalen und hyperthermierten (HT) Zellen wurde nach 4 h und 24 h in Suspensionskultur mit einem ELISA bestimmt (B). Dargestellt sind die Mittelwerte und Standabweichungen eines repräsentativen Versuchs von zwei, in Duplikaten durchgeführten Versuchen. 3.3.4. Einfluss von freigesetzten DAMPs und FBS auf die Phagozytose Zur Überprüfung, ob nicht-professionelle Phagozyten durch freigesetzte DAMPs zur Phagozytose angeregt werden, wurde in einem Versuch der Einfluss von DAMPs auf die Phagozytose untersucht. Um dies zu erreichen, wurden eine primäre Hautfibroblasten-Zelllinie, eine Glioblastom-Zelllinie und die Pankreaskarzinom-Zelllinie gewählt und nach Hitze-Behandlung zweimal mit PBS gewaschen bevor sie mit den unbehandelten Zellen koinkubiert wurden. Die Entfernung des Mediums stellte sicher, dass die Menge an bei der Hitze-Behandlung freigesetzten, intrazellulären Molekülen reduziert wurde. Obwohl die Konzentration während der Koinkubation wieder ansteigen würde, würde dennoch eine verringerte Phagozytose-Rate erwartet, da die Aktivierung anfangs schwächer ausfallen oder sogar erst später eintreten würde. 67 Es zeigte sich aber, dass bei keiner der verwendeten nicht-professionellen Phagozyten eine Inhibition der Phagozytose festzustellen war (Abbildung 13A). Als weiterer Faktor, der die Zell-Aufnahme beeinflusst, wurde FBS untersucht. Studien zum Zell-Kannibalismus berichten über den fördernden Einfluss von FBS-Mangel auf die Phagozytose-Rate (Lugini, Matarrese et al. 2006). Um eine mögliche Übereinstimmung zu prüfen, wurden PankreaskarzinomZellen zunächst ohne Passage der Zellen für eine Woche bis zum Erreichen 100 %iger Konfluenz und vor dem Versuch 24 h in Medium ohne FBS kultiviert. Bei der anschließenden Durchführung des Phagozytose-Versuches mit hyperthermierten Zellen wurde jedoch im Gegenzug eine deutliche Hemmung der Phagozytose-Aktivität festgestellt (Abbildung 13B). Abbildung 13: Phagozytose-Raten nach Entfernung von freigesetzten DAMPs durch Induktion primärer Nekrose und nach FBS-Mangel Die Phagozytose-Raten nach Erneuerung des Mediums nach Hitze-Behandlung wurden mit den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3, den primären Fibroblasten SBLF5 und den Glioblastom-Zellen T98G mikroskopisch quantifiziert (A). Die Phagozytose-Raten von konfluent gewachsenen BxPC-3-Zellen, die zuvor 24 h in Medium ohne FBS kultiviert worden waren, wurden bei Phagozytose-Versuchen mit hyperthermierten Zellen in Abwesenheit von FBS im Medium mikroskopisch ermittelt (B). Abgebildet sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen. DAMP-Red.: Reduktion von damage-associated molecular pattern molecules im Medium durch Waschen; FBS: fötales Rinderserum; K: Kontrolle. 3.3.5. Aufnahme von nekrotischen Zellen durch angewachsene Zellen Das im Phagozytose-Versuch verwendete Suspensions-System stellt für adhärente Zellen eine unnatürliche, abnorme Bedingung dar, die das Zellverhalten beeinflussen kann. Um festzustellen, ob die Phagozytose von nekrotischen Zellen auch stattfindet, wenn die phagozytischen Zellen im Zellverband vorliegen, wurde ein Versuch mit angewachsenen Zellen 68 durchgeführt. Dafür wurden Pankreaskarzinom-Zellen auf Objektträger eingesät, nach 24 h mit dem Vitalfarbstoff CTOG grün gefärbt und mit CTFRgefärbten, hyperthermierten Zellen überschichtet. Nach 4 h bei 37 °C im CO2Inkubator wurden die Zellen fixiert und mikroskopiert (Abbildung 14). Die Bilder beweisen, dass die Aufnahme von hyperthermierten Zellen auch von angewachsenen Zellen ausgeführt werden kann und die Phagozytose in Suspensionskultur damit kein künstlich erzeugtes Zellverhalten darstellt. Abbildung 14: Phagozytose-Ereignisse bei angewachsenen Zellen Gezeigt sind typische Phagozytose-Ereignisse von auf Objektträger angewachsenen, CTOG-gefärbten BxPC-3 Pankreaskarzinom-Zellen (grün), die CTFR-gefärbte, Hitzebehandelte BxPC-3-Zellen (rot) aufgenommen haben. Zellkerne sind mit DAPI blau gefärbt; CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red; Maßstab: 10 µm. 3.4. Phagozytose von bestrahlten Zellen und nekrotischer Debris Bei den Versuchen zur Induktion von Zelltod durch Bestrahlung wurde der Eintritt von Apoptose und Nekrose nach Bestrahlung und folgender Inkubationszeit bei BxPC-3 Pankreaskarzinom-Zellen, Jurkat T-Zell-Leukämiezellen und p26 Kopf-Hals-Tumorzellen beobachtet. Des Weiteren wurde die Aufnahme von wenigen apoptotischen Zellen nachgewiesen (siehe 3.2.2). In nächsten Schritt sollte die Phagozytose von bestrahlten Zellen quantifiziert und die Effizienz mit den Phagozytose-Raten von hyperthermierten Zellen verglichen werden. Bei der mikroskopischen Auswertung dieser Versuche wurde eine große Menge von nekrotischer Debris nach Bestrahlung ausgemacht. Die Anhäufung von nekrotischer Debris, welche pro-phagozytische eat-meSignale präsentiert und DAMPs freisetzt, gehört zum nekrotischen Zelluntergang dazu. Diese zellulären Bestandteile werden im Gewebe von professionellen Phagozyten effizient entfernt. Nachdem gezeigt werden konnte, dass nekrotische Zellen von nicht-professionellen Phagozyten aufgenommen werden kön69 nen, sollte untersucht werden, ob sich diese Phagozytose-Aktivität nur auf ganze Zellen beschränkt oder, ob ebenso Bruchstücke aufgenommen werden. 3.4.1. Quantifizierung der homotypischen und heterotypischen Phagozytose-Raten bei verschiedenen Zelltypen Für die Induktion von Apoptose und Nekrose wurden die Zellen mit unterschiedlichen Dosen Röntgenstrahlung bestrahlt und anschließend inkubiert (Tabelle 12). Tabelle 12: Induktion von Zelltod durch Bestrahlung Zelllinie Dosis [Gy] Inkubationszeit [d] Jurkat BxPC-3 P26 8 20 5*2 (alle 24 h) 3 6 21 Beim Phagozytose-Versuch mit bestrahlten Zellen konnten ebenfalls Phagozytose-Ereignisse nachgewiesen werden (Abbildung 15). Die Häufigkeiten beliefen sich auf niedrige Werte für die homotypische Aufnahme von bestrahlten BxPC-3 (0,5 %) und p26 (0,9 %) Zellen und vergleichsweise hohe Werte für die heterotypische Aufnahme von bestrahlten Jurkat-Zellen durch BxPC-3-Zellen (4,2 %) und SBLF5-Zellen (5,7 %). Es wurden keine signifikanten Unterschiede bei den Phagozytose-Raten mit bestrahlten Zellen im Vergleich mit den Phagozytose-Raten mit hyperthermierten (45 min bei 56 °C) Zellen festgestellt. Abbildung 15: Vergleich der Phagozytose-Raten von hyperthermierten und bestrahlten Zellen bei verschiedenen Zelllinien Die phagozytische Effizienz der Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3, der primären, gesunden Hautfibroblasten SBLF5 und der p26 Kopf-Hals-Tumorzellen wurde nach homotypischer und heterotypischer Koinkubation mit hyperthermierten und bestrahlten Zellen mikroskopisch quantifiziert (A). Abgebildet sind die Mittelwerte und Standardab- 70 weichungen von drei unabhängigen Versuchen. Gezeigt werden zwei charakteristische Phagozytose-Ereignisse nach Koinkubation von vitalen, CTOG-gefärbten BxPC-3Zellen mit bestrahlten Jurkat T-Zellen (Ba) und vitalen und bestrahlten Kopf-HalsTumorzellen P26 (Bb). Die Zellkerne sind mit Hoechst 33342 blau gefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red; HT: hyperthermiert; IR: bestrahlt; v: vital; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.4.2. Aufnahme nekrotischer Debris Für die Untersuchung der Phagozytose von nekrotischer Debris wurden Versuche mit nekrotischen Zellen nach Hyperthermie und Bestrahlung durchgeführt. Nach Hitze-Behandlung wurden auf den mikroskopischen Präparaten nur wenige freie Zellfragmente von nekrotischen Zellen ausgemacht. Dementsprechend wurden auch nur sehr wenige phagozytische Strukturen mit nekrotischer Debris beobachtet und zwar nicht mehr als ein oder zwei Ereignisse pro Experiment (Abbildung 16A). Wegen dieser niedrigen Häufigkeit wurden diese Phagozytose-Ereignisse von der Quantifizierung ausgeschlossen. Durch Bestrahlung mit anschließender langer Inkubationszeit hingegen, wurden große Mengen nekrotischer Debris angehäuft. Zellfragmente unterschiedlicher Größen sowie intakt erscheinende Zellen wurden auf den mikroskopischen Präparaten beobachtet. Die Auswertung erlaubte nicht immer eine verlässliche Aussage darüber, ob das Zellfragment tatsächlich aufgenommen war oder lediglich auf die Oberfläche der phagozytischen Zelle zentrifugiert worden war. Um das Risiko für die Quantifizierung von falsch-positiven Artefakten zu verringern, wurden per Definition phagozytische Strukturen auf solche beschränkt, die intakt erscheinende Zellen mit Zellkern (Abbildung 16Ba) oder große Zellfragmente enthielten, welche eine deutliche Verformung des phagozytischen Nukleus verursachten (Abbildung 16Bb). Alle weiteren ähnlichen Zell-in-Zell Strukturen wurden bei der Zählung nicht berücksichtigt (Abbildung 16Bc). 71 Abbildung 16: Phagozytose von nekrotischer Debris Abgebildet sind homotypische, phagozytische Strukturen nach Aufnahme von nekrotischer Debris nach Hyperthermie von BxPC-3- (Aa) und SBLF5-Zellen (Ab, c) und nach Bestrahlung von p26-Zellen die Phagozytose einer bestrahlten Zelle (Ba) und der nekrotischen Debris (Bb, c). Vitale Zellen wurden mit CTOG grün gefärbt, hyperthermierte oder bestrahlte Zellen mit CTFR rot. Die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 blau angefärbt. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.5. Einfluss von Hyperthermie auf die Zelladhäsion und Phagozytose Der erste Schritt bei der Phagozytose ist eine starke Adhäsion zwischen phagozytischer und aufzunehmender Zelle. Es wurde gezeigt, dass nekrotische Zellen, aber nicht lebende Zellen, von nicht-professionellen Phagozyten aufgenommen werden können. Daher sollte untersucht werden, ob Unterschiede bei der Adhäsion zwischen lebenden Zellen im Vergleich zur Adhäsion zwischen vitalen und hyperthermierten (45 min bei 56 °C) Zellen bestehen. In weiteren Versuchen wurden sowohl die Adhäsions-Rate als auch die Phagozytose-Rate unter Verwendung verschiedener Behandlungs-Temperaturen bestimmt. 3.5.1. Mikroskopischer Nachweis der Adhäsion Für die Visualisierung der zielgerichteten Membran-Ausstülpungen der phagozytierenden Zellen bei der Bindung an Hitze-behandelte Zellen wurde der 72 Phagozytose-Prozess mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und Lebendzell-Mikroskopie aufgenommen (Abbildung 17). Abbildung 17: Verstärktes adhäsives Verhalten gegenüber hyperthermierter Zellen Gezeigt wird der Zustand verstärkter Adhäsion während des Aufnahme-Prozesses von hyperthermierten, CTFR-gefärbten (rot) Pankreaskarzinom-Zellen von Aktin-GFPtransfizierten (grün) Pankreaskarzinom-Zellen (A, B), oder ungefärbten Zellen, beobachtet mit dem Lebendzellmikroskop (C, D). Die Zellkerne wurden mit DAPI blau gefärbt. CTFR: Celltrace Far Red; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.5.2. Nachweis der Hyperthermie-induzierten Adhäsion mittels Durchflusszytometrie Im nächsten Schritt wurde ermittelt, inwiefern Hyperthermie-induzierte Membran-Veränderungen die Bindung zwischen phagozytischer und aufzunehmender Zelle beeinflussen. Um dies zu untersuchen, wurden durchflusszytometrische Messungen durchgeführt. Die Adhäsion wurde als Anteil der lebenden Zellen, die an hyperthermierte Zellen gebunden hatten, berechnet. Dabei wurde in allen verwendeten Zelllinien, mit Ausnahme der HEK293-, der Jurkat- und der SBL1Zellen, die keine hyperthermierten Zellen phagozytierten, eine Erhöhung der Adhäsions-Rate festgestellt, wenn vitale mit Hitze-behandelten Zellen koinkubiert wurden, im Vergleich zur Koinkubation von nur vitalen Zellen (Abbildung 18). 73 Abbildung 18: Durchflusszytometrische Messung der Adhäsion bei mehreren Zelllinien Mit einem Durchflusszytometer wurde die Adhäsion nach 60 min Koinkubation von vitalen mit nekrotischen und nur vitalen CTOG- und CTFR-gefärbten Zellen mehrerer Zelllinien in Suspension bestimmt. Die Nekrose wurde mit Hitze-Behandlung (56 °C, 45 min) induziert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei Versuchen je Zelllinie. CTOG: Celltrace Oregon Green; CTFR: Celltrace Far Red. Als nächstes wurde die Adhäsions-Rate bei BxPC-3-Zellen in Abhängigkeit von der Behandlungs-Temperatur untersucht. Dabei wurde eine signifikante Zunahme der Adhäsion innerhalb von 45 min Koinkubation nach HitzeBehandlung mit 54 °C und 56 °C im Vergleich zur Kontrolle (37 °C) und den bei niedrigeren Temperaturen hyperthermierten Zellen (42 – 52 °C) beobachtet (Abbildung 19). Abbildung 19: Hyperthermie-Behandlung induziert eine verstärkte Bindung zwischen phagozytischen und hyperthermierten Zellen Unbehandelte, CTOG-gefärbte Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 wurden mit bei verschiedenen Temperaturen hyperthermierten, CTFR-gefärbten BxPC-3-Zellen koinkubiert. Die Bindung von grünen an rote Zellen wurde mit dem Durchflusszytometer bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von mind. drei unabhängigen Versuchen mit Ausnahme für jeweils zwei Versuche bei 42 °C und 44 °C. 74 ***P ≤ 0,001 in Bezug zum 52 °C Wert. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015) 3.5.3. Phagozytose-Raten in Abhängigkeit der induzierten Adhäsion Im nächsten Schritt wurde überprüft, ob sich die zunehmende Adhäsion bei erhöhter Temperatur-Behandlung auf die Phagozytose-Raten auswirkt. Dafür wurden die Phagozytose-Raten nach Hyperthermie-Behandlung mit 52 – 54 °C bestimmt. Diese Temperaturen wurden gewählt, weil die Adhäsion in diesem Temperatur-Bereich signifikant zunahm. Nach 4 h Koinkubation wurde bei den Zellen, die mit der höchsten Temperatur behandelt worden waren, eine 2,5 – 3-fach erhöhte Phagozytose-Rate (2,9 %) im Vergleich zu den bei 52 °C und 53 °C hyperthermierten Zellen (0,9-1,2 %), festgestellt. Zur Kontrolle wurde eine Zellsuspension mit CTFR-gefärbten, unbehandelten Zellen mitgeführt. Bei dieser Mischung war im vorherigen Versuch (siehe 3.5.2) eine Adhäsionsrate von 10 % ermittelt worden. Phagozytose-Ereignisse von lebenden Zellen traten nicht auf (Abbildung 20). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Membranveränderungen von geschädigten Zellen die Zelladhäsion erhöhen und damit gleichzeitig die Phagozytose anregen. Abbildung 20: Behandlung Phagozytose-Raten in Abhängigkeit von Hyperthermie- Die Phagozytose-Raten bei den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3 wurden mit bei verschiedenen Temperaturen behandelten Zellen mikroskopisch ermittelt. *P < 0,05 in Bezug zu den Werten bei 37, 52 und 53 °C. 3.6. Lokalisation von Zell-in-Zell-assoziierten Proteinen Zur Untersuchung von spezifischen Proteinen, die entweder Phagozytose- oder Zelltod-assoziiert sein können, wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie die 75 Lokalisation von E-Cadherin, LAMP1, F-Aktin, Ezrin, phosphoryliertem Ezrin (pEzrin) und LC3 sichtbar gemacht. 3.6.1. Lokalisation von E-Cadherin Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde eine Akkumulation von E-Cadherin auf der phagozytischen Plasmamembran an den Kontaktstellen zu nekrotischen Zellen beobachtet. Nach vollendeter Phagozytose wurde die internalisierte Zelle von einer E-Cadherin-positiven Vakuole umschlossen (Abbildung 21). Abbildung 21: Verdichtung von E-Cadherin bei der Phagozytose Gezeigt werden der phagozytische Prozess mit ausgeprägten MembranAusstülpungen um die hyperthermierte Zelle herum am Beginn der Phagozytose und zwei abgeschlossene Phagozytose-Ereignisse von Pankreaskarzinom-Zellen. Zur Unterscheidung der ungefärbten vitalen und hyperthermierten Zellen, wurden die Zellkerne vor der Fixierung dem Membran-impermeablen DNA-Farbstoff 7-AAD gefärbt. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde die Akkumulation von E-Cadherin an der Kontaktstelle zur hyperthermierten Zelle und auf der phagozytischen Vakuole sichtbar gemacht. Die Zellkerne wurden mit DAPI blau angefärbt. DIC: Differential-InterferenzKontrast; Maßstab: 10 µm. 3.6.2. Verdichtung von F-Aktin Die gerichtete Polymerisierung von F-Aktin und die Bildung von MembranFortsätzen ermöglichen die Phagozytose und sind von der Aktivität von Proteinen der Ezrin-Radixin-Moesin-Familie abhängig. Bei der Aufnahme von hyperthermierten Zellen waren nur bei den phagozytischen Zellen, nicht bei den nekrotischen Zellen, Aktinfilamente vorhanden. 76 Abbildung 22: Verdichtung von F-Aktin und p-Ezrin bei der Phagozytose Mit Immunfluoreszenz-Färbung wurde die Fähigkeit zur Ausbildung von Aktinfilamenten (Aa) und zur Phosphorylierung von Ezrin nach Hitze-Behandlung untersucht (Ab, c). Zur Unterscheidung von vitalen und hyperthermierten Zellen, wurden die Zellkerne vor der Hitze-Behandlung mit BrdU markiert (Aa) bzw. wurden die vitalen Zellen mit CTOG grün gefärbt (Ab, c). Gezeigt werden der phagozytische Prozess mit ausgepräg- 77 ten Membran-Ausstülpungen um die hyperthermierte Zelle herum am Beginn der Phagozytose und zwei abgeschlossene Phagozytose-Ereignisse von PankreaskarzinomZellen. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde die Akkumulation von F-Aktin (Ba – c) und p-Ezrin (Ca – c) an der Kontaktstelle zur hyperthermierten Zelle und auf der phagozytischen Vakuole sichtbar gemacht. Das p-Ezrin Signal verringert sich auf der Vakuole in kurzer Zeit nach Phagozytose (Cc). Pfeile deuten auf das Vorhandensein bzw. das Fehlen der Proteine (A) und Protein-Akkumulationen (B, C). DIC: DifferentialInterferenz-Kontrast; CTOG: Celltrace Oregon Green; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Durch Immunfluoreszenz-Färbung von Ezrin und p-Ezrin wurde erkannt, dass hyperthermierte Zellen Ezrin in ähnlicher Menge exprimieren wie unbehandelte Zellen, aber nicht in der Lage sind, es zu phosphorylieren. Das Fehlen von pEzrin und F-Aktin deutet darauf hin, dass Hitze-behandelte Zellen ihre Zellmembran und ihren Zellkörper nicht aktiv bewegen und verformen können und stattdessen passiv phagozytiert werden (Abbildung 22A). Nach der Formation von Zellmembranfortsätzen mit F-Aktin wurden nekrotische Zellen in F-Aktin positive Vakuolen aufgenommen (Abbildung 22B). Außerdem wurden verschiedene Stadien der Phagozytose aufgenommen, welche die Bildung von p-Ezrin-positiven Membran-Ausstülpungen, die Aufnahme in p-Ezrinpositive Vakuolen, gefolgt von einem Verlust von p-Ezrin von den Vakuolen zeigen (Abbildung 22C). 3.6.3. Akkumulation von LAMP1 und LC3 Unmittelbar nach der Phagozytose wurde eine Ringbildung aus LAMP1positiven Vesikeln um die nekrotische Zelle herum sichtbar. Im Zytoplasma von Hitze-behandelten Zellen waren insgesamt viel mehr LAMP1-positive Vesikel zu erkennen als in den lebenden Zellen (Abbildung 23A). Ebenso wurden viele LC3-positive Vesikel im Zytoplasma der Hitzebehandelten Zellen gefunden. Dies könnte auf eine mögliche Induktion von Autophagie hindeuten. In den phagozytierenden, vitalen Zellen waren die LC3Signale sehr viel schwächer und akkumulierten vor allem an der Kontaktstelle zu nekrotischen Zellen. Des Weiteren konnte eine ringförmige Lokalisation von LC-3 positiven Vesikeln, welche die aufgenommene Zelle umschließen, beobachtet werden (Abbildung 23B). Mittels Phasenkontrastmikroskopie wurden außerdem granuläre Strukturen in den hyperthermierten Zellen sichtbar gemacht. Zusammen mit der großen 78 Menge von LAMP1- und LC3- positiven Vesikeln deutet die Erhöhung der Granularität auf lysosomalen Zelltod der hyperthermierten Zellen hin. Abbildung 23: Lokalisation von LAMP1 und LC3 Gezeigt werden der phagozytische Prozess am Beginn der Phagozytose mit ausgeprägten Membran-Ausstülpungen um die hyperthermierte Zelle herum und zwei abgeschlossene Phagozytose-Ereignisse von Pankreaskarzinom-Zellen. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde die Akkumulation von LAMP1 (Aa, b) und LC3 (Ba, b) an der Kontaktstelle zur hyperthermierten Zelle und auf der phagozytischen Vakuole sichtbar gemacht. Pfeile deuten auf Protein-Akkumulationen. DIC: Differential-InterferenzKontrast; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.6.4. Quantifizierung der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine im Zeitverlauf Die charakteristische Akkumulation der Proteine an der Kontaktstelle zur nekrotischen Zelle sowie die Ringbildung um die aufgenommene Zelle wurde zusätzlich in kurzen Zeitabständen (2,5, 3,5 und 5 h Koinkubation) quantifiziert (Abbildung 24). Nach 2,5 h zeigten beinahe alle Phagozytose-Ereignisse E-Cadherinund F-Aktin-positive Vakuolen, in welche die nekrotische Zelle aufgenommen worden war. Diese Ring-Bildung wurde in 90 % der Ereignisse ebenfalls für LAMP1 und in 70 % der Zell-in-Zell Strukturen für p-Ezrin festgestellt. Die Akkumulation von LC3 um die aufgenommenen Zellen war zu diesem Zeitpunkt in 79 70 % der Fälle vorhanden. Zu den späteren Zeitpunkten von 3,5 und 5 h wurde für alle Proteine ein Rückgang der Signale beobachtet. Dabei blieben jedoch die Akkumulation von E-Cadherin und F-Aktin am längsten stabil im Vergleich zum schnellen Verschwinden der lokalisierten LC3-positiven Vesikel. Abbildung 24: Quantifizierung der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine Der Phagozytose-Versuch mit Hyperthermie zur Quantifizierung der Lokalisation von FAktin, E-Cadherin, LAMP1, LC3 und p-Ezrin wurde mit Pankreaskarzinom-Zellen durchgeführt. Nach 2,5, 3,5 und 5 h Koinkubationszeit wurden die Zellen fixiert und die Proteine mittels Immunfluoreszenz-Färbung sichtbar gemacht und mikroskopisch analysiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.6.5. Lokalisation der Zell-in-Zell-assoziierten Proteine bei angewachsenen Zellen Die verwendeten phagozytischen Zellen sind allesamt adhärente Zelllinien. Daher musste überprüft werden, ob das charakteristische Färbemuster der untersuchten Proteine auf die Bedingungen in Suspensionskultur zurückzuführen ist, oder ob die Beobachtungen den Protein-Lokalisationen unter natürlichen Bedingungen, das heißt im angewachsenen Zustand, entsprechen. Zu diesem Zweck wurden Pankreaskarzinom-Zellen auf Objektträger eingesät und zu den gleichen Zeitpunkten (2,5, 3,5 und 5 h Koinkubation) mittels ImmunfluoreszenzFärbung angefärbt. Dabei konnte beobachtet werden, dass die Färbung von ECadherin, F-Aktin und p-Ezrin nicht von den Präparaten, die von der Suspensionskultur hergestellt wurden, abwich, Einzige Ausnahme war die intensive Färbung an den Zell-Zell-Kontaktstellen zwischen phagozytischen, unbehandelten Zellen. Auch für die Proteine LC3 und LAMP1 konnte eine Akkumulation ähnlich dem Suspensions-System festgestellt werden (Abbildung 25). 80 Abbildung 25: Lokalisation der Phagozytose-assoziierten Proteine bei angewachsenen Zell-in-Zell Strukturen Gezeigt werden der phagozytische Prozess am Beginn der Phagozytose mit ausgeprägten Membran-Ausstülpungen um die hyperthermierte Zelle herum und abgeschlossene Phagozytose-Ereignisse von Pankreaskarzinom-Zellen. Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurde die Akkumulation von E-Cadherin (A), p-Ezrin (B), LAMP1 (C), LC3 (D) und F-Aktin (E, F) an der Kontaktstelle zur hyperthermierten Zelle und auf der phagozytischen Vakuole sichtbar gemacht. Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.7. Inhibition der molekularen Maschinerie der nichtprofessionellen Phagozyten Die Untersuchungen zur Phagozytose von nekrotischen Zellen wurden bis auf wenige Ausnahmen (siehe 3.3.5 und 3.6.5) im Suspensions-System durchgeführt, wobei gezeigt werden konnte, dass auch angewachsene Zellen zur Aufnahme fähig sind. Die Zelltodes-Form Entose findet statt, wenn sich Zellen von der extrazellulären Matrix ablösen, sich also ebenfalls in Suspension befinden. Um die Unterschiede zwischen Entose und nicht-professioneller Phagozytose von nekrotischen Zellen anhand von molekularen Mechanismen beider Ereignisse zu charakterisieren, wurden Versuche zur Inhibition der Phagozytose durchgeführt. 3.7.1. Einfluss von Bestrahlung, Proteasen und Zytoskelett-Inhibitoren Die phagozytischen Zellen wurden vor der Koinkubation mit hyperthermierten Zellen mit verschiedenen Noxen behandelt. Dazu zählten die Behandlung mit hohen Dosen von Röntgenstrahlung, Proteasen, Zytoskelett- und GTPaseInhibitoren (Abbildung 26). Die Bestrahlung mit 50 Gy verringerte die Phagozytose-Raten nicht. Die Zellen wurden solange mit proteolytischen Enzymen (Accutase oder Trypsin) behandelt bis die sich die Zellen ohne zusätzliche mechanische Reize (Abklopfen vom 81 Flaschenboden) ablösten. Dadurch konnte davon ausgegangen werden, dass eine große Anzahl der Membranmoleküle, inklusive Adhäsionsmoleküle, proteolytisch entfernt worden war. Tatsächlich zeigten die phagozytischen Zellen eine Verringerung der Phagozytose-Rate auf 22 % bei Trypsin-Behandlung und auf 33 % bei Accutase-Behandlung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (=100 %). Dies deutet auf eine Notwendigkeit der Adhäsionsmoleküle auf der phagozytischen Zelle hin und stimmt den Versuchen zur Hyperthermieabhängigen Adhäsion und Phagozytose überein (siehe 3.5.2 und 3.5.3). Alle verwendeten Zytoskelett-Inhibitoren (Colcemid, Paclitaxel und Latrunculin B) verringerten ebenfalls signifikant die Phagozytose-Raten. Insbesondere Latrunculin B, das die Polymerisierung der Aktin-Monomere in Filamente hemmt, verhinderte die Phagozytose vollständig. Die durch Colcemid und Paclitaxel induzierte Hemmung der Mikrotubuli resultierte in relativen PhagoztyoseRaten von 13 % bei Colcemid-Behandlung und 26 % bei PaclitaxelBehandlung. Dynasore hemmt die Aktivität von GTPasen inklusive der ubiquitös exprimierten GTPase Dynamin II. Dynamin II ist essentiell an der Abschnürung von Stachelsaumbläschen (clathrin-coated vesicles) von der Zellmembran bei der Endozytose beteiligt. Die Behandlung mit Dynasore bewirkte ebenso eine drastische Verringerung der relativen Phagozytose-Rate auf 7 %. Für jede Behandlung wurden Kontrollen mit den entsprechenden Konzentrationen der Lösungsmittel DMSO oder PBS mitgeführt. Diese bestätigten die spezifische Hemmung der verwendeten Reagenzien, die in DMSO oder PBS rekonstituiert worden waren. Abbildung 26: Phagozytose-Raten nach Bestrahlung und Behandlung der phagozytiertenden Zellen mit Protease- und Zytoskelett-Inhibitoren Pankreaskarzinom-Zellen wurden nach verschiedenen Behandlungen mit hyperthermierten Zellen 4 h koinkubiert. Die relativen Phagozytose-Raten in Bezug zur Phagozytose-Rate von unbehandelten Zellen (K=100 %) wurden mikroskopisch ermittelt. Als 82 weitere Kontrollen für die verwendeten Inhibitoren (rekonstituiert in PBS, DMSO oder Medium) wurden entsprechende Konzentrationen (ci und cii) von PBS und DMSO mitgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Experimenten. K: Kontrolle; Gy: Gray; Acc: Accutase; Tryp: Trypsin; Dyn: Dynasore; Col: Colcemid; Pac: Paclitaxel; LatB: Latrunculin B; *p < 0,05, **p ≤ 0,01; Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.7.2. Blockade des E- und P-Cadherin vermittelten Zellkontakts Bei der beschriebenen Zelltodes-Form Entose wurde von einer Inhibition der Entose nach Blockade von E- und P-Cadherin bei MCF-10A nicht-tumorigenen Brustepithelzellen berichtet (Overholtzer, Mailleux et al. 2007). Nachdem mittels Immunfluoreszenz-Färbung eine Akkumulation von E-Cadherin an der Kontaktstelle zur nekrotischen Zelle bei der Phagozytose festgestellt worden war (siehe 3.6.1), sollte überprüft werden, ob eine Blockade von E-Cadherin zu einer Reduktion der Phagozytose-Rate führt. Da für Pankreaskarzinom-Zellen zusätzlich die Expression von P-Cadherin gezeigt wurde (Imai, Hirata et al. 2008), wurde gleichzeitig dieses Transmembranprotein gehemmt. Zunächst wurde die Expression von E- und P-Cadherin von vitalen und hyperthermierten Zellen und die Lokalisation in Phagozytose-Ereignissen mittels Immunfluoreszenz-Färbung untersucht (Abbildungen 27, 28). E-Cadherin wurde auf den vitalen Zellen stark exprimiert, konnte nach HitzeBehandlung allerdings nicht mehr nachgewiesen werden (Abbildung 27A). In den Zell-in-Zell Strukturen nach Aufnahme von nekrotischen Zellen wurde wiederum eine Verdichtung des Signals um die aufgenommene Zelle herum, ausgemacht (Abbildung 27B). Zur Überprüfung der Spezifität des verwendeten Antikörpers wurde außerdem eine Isotypkontrolle mitgeführt (Abbildung 27C). P-Cadherin wurde nur sehr schwach angefärbt, was auf eine niedrige Expression hindeutet. Die Behandlung mit Hyperthermie bewirkte auch hier einen Verlust von P-Cadherin. Aufgrund des schwachen P-Cadherin Signals und der Signalüberlagerung von CTFR ist dieser Verlust nur schwer erkennbar (Abbildung 28A). Nach Phagozytose von hyperthermierten Zellen zeigen die Zell-in-Zell Strukturen ebenfalls eine Akkumulation von P-Cadherin um die aufgenommene Zelle herum (Abbildung 28B). Die mitgeführte Isotypkontrolle bestätigte die Spezifität des verwendeten Antikörpers (Abbildung 28C). 83 Abbildung 27: Expression und Lokalisation von E-Cadherin auf vitalen, hyperthermierten Zellen und Phagozytose-Ereignissen Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurden Expression und Akkumulation von ECadherin bei Pankreaskarzinom-Zellen untersucht. Zur Unterscheidung vitaler und nekrotischer Zellen wurden die hyperthermierten Zellen mit CTFR rot gefärbt. Die Expression von E-Cadherin nach Hitze-Behandlung wurde mikroskopisch untersucht. Als Kontrolle für eine mögliche Signalüberlagerung zwischen roter und grüner Fluoreszenz wurde eine Kontrolle mit vitalen, CTFR-gefärbten Zellen mitgeführt (A). Eine Akkumulation von E-Cadherin wurde auf der phagozytischen Vakuole nachgewiesen (B). Zur Überprüfung der Spezifität des verwendeten E-Cadherin-Antikörpers wurde eine Maus IgG2a Isotypkontrolle mitgeführt (C). Pfeile deuten auf das Vorhandensein bzw. das 84 Fehlen der Proteine (A) und Protein-Akkumulationen (B). CTFR: Celltrace Far Red; HT: Hitze-Behandlung. Maßstab: 10 µm. Abbildung 28: Expression und Lokalisation von P-Cadherin auf vitalen, hyperthermierten Zellen und Phagozytose-Ereignissen Mittels Immunfluoreszenz-Färbung wurden Expression und Akkumulation von PCadherin bei Pankreaskarzinom-Zellen untersucht. Zur Unterscheidung vitaler und nekrotischer Zellen wurden die hyperthermierten Zellen mit CTFR rot gefärbt. Die Expression von P-Cadherin auf vitalen Zellen und nach Hitze-Behandlung wurde mikroskopisch untersucht. Als Kontrolle für eine mögliche Signalüberlagerung zwischen roter und grüner Fluoreszenz wurde eine Kontrolle mit lebenden, CTFR-gefärbten Zellen mitgeführt (A). Auf der phagozytischen Vakuole wurde eine schwach ausgeprägte Ak- 85 kumulation von P-Cadherin nachgewiesen (B). Zur Überprüfung der Spezifität des verwendeten P-Cadherin-Antikörpers wurde eine Kaninchen IgG Isotypkontrolle mitgeführt (C). Pfeile deuten auf das Vorhandensein bzw. das Fehlen der Proteine (A) und Protein-Akkumulationen (B). CTFR: Celltrace Far Red; HT: Hitze-Behandlung. Maßstab: 10 µm. Der Verlust von E- und P-Cadherin durch Hyperthermie ist insofern brisant, als dass bisher lediglich homotypische Interaktionen von Cadherinen bzw. heterotypische Interaktionen zwischen verschiedenen Cadherin-Typen bekannt sind (Takeichi 1991, Geiger and Ayalon 1992, Omelchenko, Fetisova et al. 2001, Niessen and Gumbiner 2002). Demzufolge müssten auf phagozytischer und nekrotischer Zelle Cadherine vorhanden sein, damit eine Interaktion dieser Proteine bei der Phagozytose von Bedeutung sein könnte. Es wurde aber auch über mögliche heterotypische Interaktionen spekuliert, wie es für die Bindung zwischen Cadherinen und Integrinen gezeigt werden konnte (Whittard, Craig et al. 2002). Demnach wird eine Cadherin-vermittelte Bindung an einen Liganden auf der hyperthermierten Zelle, trotz deren Cadherin-Verlust, nicht ausgeschlossen. Um eine mögliche Funktion dieser Cadherine bei der Phagozytose zu testen und damit eine Übereinstimmung zur Entose zu prüfen, wurden funktionale, blockierende Antikörper gegen E- und P-Cadherin verwendet. Diese wurden während der Koinkubation von 4 h nach Hyperthermie-Behandlung in den gleichen Konzentrationen, die für die Entose publiziert wurden, mitgeführt. Als Kontrolle wurden außerdem Proben ohne Hitze-Behandlung mitgeführt. Die durchflusszytometrische Messung der Adhäsion zeigte keine Reduktion der Bindung von vitalen an nekrotische Zellen durch die verwendeten Antikörper. Bei der Quantifizierung der Phagozytose-Raten wurde eine signifikante Verringerung durch die blockierenden Antikörper festgestellt. Die mitgeführte Isotypkontrolle zeigte jedoch, dass der inhibierende Effekt unspezifisch war, da eine ähnlich starke Verringerung der Phagozytose-Rate auch bei diesen Proben zu beobachten war (Abbildung 29). Die spezifische Hemmung des E- und PCadherin-vermittelten Zellkontakts konnte demnach nicht erzielt werden, sodass keine Aussage über eine Beteiligung von Cadherin-Interaktionen bei der Phagozytose gemacht werden kann. Möglicherweise liegt die Ursache in der unspezifischen Hemmung bei der eingesetzten Konzentration der Antikörper und Isotypkontrollen. Diese entsprach der Konzentration, die für den Inhibitions86 Versuch bei der Entose veröffentlicht worden war und verlangte eine 1 zu 6,6 bzw. 1 zu 10 Verdünnung. Die Antikörper und Isotypkontrollen waren in PBShaltigen Puffern ohne Konservierungsmittel enthalten. Abbildung 29: Einfluss funktioneller Blockade von E- und P-Cadherin auf Adhäsion und Phagozytose Relative Adhäsion und relative Phagozytose-Raten von Pankreaskarzinom-Zellen beim Phagozytose-Versuch mit Hyperthermie nach Behandlung mit blockierenden Antikörpern gegen E-Cadherin und P-Cadherin in Bezug zur Kontrolle ohne AntikörperZugabe (K=100 %). Zur Untersuchung der Effekte der blockierenden Antikörper auf die Bindung zwischen lebenden Zellen wurde der Versuch auch ohne HyperthermieBehandlung durchgeführt. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen aus zwei Experimenten. K: Kontrolle; E-/P-Cad: E-/P- Cadherin; IgG K: Isotypkontrolle. 3.7.3. Quantifizierung der Dosis-Relation von Annexin V Die durchflusszytometrischen Messungen hatten bereits gezeigt, dass die hyperthermierten Zellen positiv für das an PS bindende AnxA5 wurden. Demzufolge bewirkte die Hitze-Behandlung eine Lyse der Zellmembran und eventuell sogar eine Exposition von PS. Die Bindung von Rezeptoren an ihren Liganden PS und die dadurch ausgelöste Signal-Kaskade spielen eine zentrale Rolle bei der Phagozytose von apoptotischen Zellen durch professionelle Phagozyten. Um eine mögliche Gemeinsamkeit diesbezüglich zu überprüfen, wurde getestet, ob eine funktionelle Blockade von PS mit rekombinanten AnxA5 die Aufnahme von hyperthermierten Zellen durch nicht-professionelle Phagozyten vermindert. Für diesen Versuch wurde drei phagozytische Zelllinien gewählt, nämlich die Pankreaskarzinom-Zelllinie BxPC-3, eine primäre Hautfibroblasten-Zelllinie SBLF5 und eine Glioblastom-Zelllinie T98G. Die Phagozytose-Raten wurden bei allen drei Zelllinien Dosis-abhängig verringert, wobei die stärkste Inhibition mit einer Reduktion um 60 – 67 % nach einer Behandlung mit 30 µg/ml AnxA5 ermittelt wurde. Die Phagozytose-Aktivität konnte allerdings nicht mit der höchs87 ten, eingesetzten Konzentration von 40 µg/ml zusätzlich reduziert werden (Abbildung 30), sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Aufnahme von hyperthermierten Zellen von nicht-professionellen Phagozyten nicht vollständig PS-abhängig ist. Abbildung 30: Dosis-abhängige Inhibition der Phagozytose von hyperthermierten Zellen mit Annexin V Die Phagozytose-Raten bei Phagozytose-Versuchen mit Hitze-Behandlung bei den Pankreaskarzinom-Zellen BxPC-3, den primären Hautfibroblasten SBLF5 und den Glioblastom-Zellen T98G wurden bei Zugabe verschiedener Dosen von AnxA5 mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. Dargestellt sind die relativen Mittelwerte und Standardabweichungen von drei unabhängigen Versuchen in Bezug zur Kontrolle ohne Zugabe von AnxA5 (Kontrolle=100 %). **p ≤ 0,01. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.8. Expression von Phagozytose-assoziierten Genen Nachdem eine PS-Abhängigkeit bei der Aufnahme von nekrotischen Zellen festgestellt worden war, wurde im nächsten Schritt die Expression von Phagozytose-assoziierten Genen inklusive PS-Rezeptoren untersucht. Weil die verwendeten Zelllinien Unterschiede in den Phagozytose-Raten gezeigt hatten, sollte der Vergleich relativer mRNA-Konzentrationen außerdem Rückschlüsse auf die mögliche Beteiligung bestimmter Phagozytose-assoziierter Gene geben. Zu diesem Zweck wurde die RNA der drei phagozytischen Zelllinien, die eine PS-Abhängigkeit beim AnxA5-Blockade-Versuch (siehe 3.7.3) gezeigt hatten (BxPC-3, T98G und SBLF5) und von den Phagozytose-inkompetenten Zelllinien SBL1 und HEK293 isoliert. Die relativen mRNA-Konzentrationen der PSRezeptor-Gene CD68 und T-cell immunoglobulin- and mucin domain-3containing molecule 1 (TIM1) und der Rezeptoren CD36 und Integrin beta 5 (ITGB5) wurden mittels qRT-PCR quantifiziert (Abbildung 31). Bei BxPC-3- und 88 SBLF5-Zellen wurde die Expression aller getesteten Gene nachgewiesen, allerdings mit stark abweichenden mRNA-Konzentrationen. Bei T98G-Zellen wurden eine moderate Expressionsaktivität für ITGB5 und niedrige mRNAKonzentrationen von CD36 und CD68 gemessen. Die Phagozytose-unfähigen HEK293-Zellen zeigten lediglich eine niedrige mRNA-Konzentration von CD36. Die ebenfalls Phagozytose-unfähigen SBL1-Zellen exprimierten nur relevante mRNA-Konzentrationen von CD36, was mit Studien zur Expression von CD36 auf B-Zell-Subgruppen übereinstimmt (Won, Bachmann et al. 2008). Abbildung 31: Relative mRNA-Konzentrationen von Phagozytose-relevanten Genen Zum Nachweis der relativen mRNA-Konzentrationen von CD68, TIM1, CD36 und ITGB5 wurde mit den Phagozytose-fähigen Zelllinien BxPC-3, T98G und SBLF5 und den nicht phagozytischen Zelllinien HEK293 und SBL1 eine quantitative Echt-Zeit-PCR Analyse durchgeführt. Die gemessenen mRNA-Konzentrationen wurden auf den Mittelwert der Referenzgene GIGYF2, L3MBTL2 und RPUSD3 normalisiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von zwei RNA-Extraktionen und qRTPCR Reaktionen pro Zelllinie. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 89 3.9. Degradation der inkorporierten Zelle Zur Beobachtung des Zelltod-Verlaufs nach Phagozytose der Hitze- behandelten Zelle wurde die Koinkubation in der Suspensions-Kulturplatte auf bei zu drei Tage verlängert. Zusätzlich zur Präparation nach 4 h, wurden außerdem nach 24, 48 und 72 h mikroskopische Präparate angefertigt. Dabei sollte nicht nur die homotypische Phagozytose sondern auch die heterotypische Interaktion untersucht werden. Zum einen wurden hyperthermierte Jurkat TZellen mit lebenden, CTOG-gefärbten BxPC-3 Pankreaskarzinom-Zellen inkubiert. Nach Zytozentrifugation und Fixierung wurden die T-Zellen mittels Immunfluoreszenz-Färbung durch Markierung des T-Zell-Antigens CD2 sichtbar gemacht. Die Zellkerne wurden mit dem DNA-Farbstoff DAPI gefärbt. Nach 4 h wurden die typischen phagozytischen Strukturen, welche einen sichelförmigen Zellkern der phagozytischen Zelle und einen runden Nukleus der aufgenommenen Zelle beinhalten, ausgemacht. Nach 24 h erschien der Zellkern des Phagozyten wieder seine ursprüngliche Form nahezu vollständig zurückerlangt zu haben, wohingegen der Nukleus der internalisierten Zelle nicht mehr vorhanden bzw. mit DAPI anzufärben war, was auf einen Verlust der DNA-Integrität hindeutet. Die CD2-positiven phagozytischen Vakuolen blieben bis zu 72 h erhalten, wobei in manchen Zell-in-Zell Strukturen auch kleine CD2-positive Vesikel im Zytoplasma des Phagozyten beobachtet werden konnten (Abbildung 32A). Der Verlauf von homotypischen Phagozytose-Ereignissen wurde anhand von hyperthermierten Pankreaskarzinom-Zellen, welche mit Histon H2B-RFP transfiziert worden waren bzw. das Nukleosid EdU inkorporiert hatten, studiert. Diese Markierung von Histonen bzw. der DNA ermöglichte die Beantwortung der Frage, ob Kernmaterial der internalisierten Zelle in zytoplasmatischen Vesikeln abgebaut wird oder auch in den phagozytischen Nukleus eingebaut werden könnte. Zusätzlich wurden die mikroskopischen Präparate mit DAPI angefärbt, wodurch die vorherige Beobachtung über den Verlust der DNA-Integrität der phagozytierten Zelle, innerhalb von 24 h, bestätigt wurde. Des Weiteren wurde eine Verteilung des H2B-RFP- und EdU-markierten DNA-Materials in der gesamten phagozytischen Vakuole nachgewiesen. Dies deutet auf eine Lyse der Kernmembran und demzufolge den unumkehrbaren Eintritt von Zelltod in der aufgenommenen Zelle hin. In Übereinstimmung mit dem Verlauf nach heteroty90 pischer Phagozytose, wurden phagozytische Strukturen mit einer stabilen Vakuole sowie mehreren, kleinen Vesikeln, welche die Bestandteile der hyperthermierten Zelle beinhalten, nachgewiesen. Ein Transfer von markiertem DNAMaterial in den Zellkern des Phagozyten wurde zu keinem Zeitpunkt festgestellt (Abbildung 32B, 33). 91 Abbildung 32: Beobachtung von Degradation nach Phagozytose, Teil 1 Die Stabilität der aufgenommenen Zellen wurde bis zu drei Tage nach Phagozytose mikroskopisch beobachtet. Zur Untersuchung heterotypischer Phagozytose wurden lebende, CTOG-gefärbte Pankreaskarzinom-Zellen mit hyperthermierten Jurkat-TZellen inkubiert. Der Abbau der internalisierten T-Zellen wurde mit ImmunfluoreszenzFärbung für das T-Zell Antigen CD2 untersucht (A). Zur Untersuchung homotypischer 92 Phagozytose wurden Aktin-GFP transfizierte, lebende Pankreaskarzinom-Zellen mit H2B-RFP transfizierten, hyperthermierten Zellen inkubiert (B). Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Abbildung 33: Beobachtung von Degradation nach Phagozytose, Teil 2 Lebende, CTOG-gefärbte Pankreaskarzinom-Zellen wurden mit hyperthermierten, EdU-inkorporierten Zellen koinkubiert. Die DNA-Integrität wurde durch DAPI-Färbung untersucht. Pfeile deuten auf das Vorhandensein bzw. das Fehlen der Zellkerne und auf die Verteilung des phagozytierten Materials in der phagozytischen Vakuole bzw. in zytoplasmatischen Vesikeln hin. Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Die gesammelten Daten weisen auf einen langsamen Prozess hin, der zum vollständigen Abbau der aufgenommenen Zelle führt. Um diesen Prozess genauer zu charakterisieren, wurden die phagozytischen Strukturen in weiteren Experimenten mit Antikörpern gegen das Lysosomen-assoziierte Membranprotein LAMP1 und das Hitzeschock-Protein HSP70 angefärbt. Zum Zeitpunkt nach 4 h erscheinen die internalisierten Zellen stark positiv für LAMP1 und HSP70 gefärbt. Die Menge LAMP1-positiver Vesikel verminderte sich zum Zeitpunkt nach 24 h, es waren aber selbst nach 48 h noch phagozytische Strukturen mit teilweise stark angefärbten LAMP1-positiven Vesikeln vorhanden (Abbildung 34A). Diese Ergebnisse deuten auf eine Lysosom-vermittelte Degradation der internalisierten Zelle hin. 93 Eine verstärkte Expression von HSP70 ist auf eine Stress-Reaktion, ausgelöst durch die Hitze-Behandlung, zurückzuführen. Zum Zeitpunkt nach 8 h war bereits eine Verringerung des HSP70-Signals festzustellen und nach 22 h war es nunmehr minimal (Abbildung 34B). Abbildung 34: Nachweis von lysosomalem Zelltod der internalisierten Zelle Die Menge von LAMP1-positiven Vesikeln (A) und die Expression von HSP70 (B) in aufgenommenen Zellen wurde bis zu zwei Tage nach Phagozytose mikroskopisch beobachtet. Dafür wurden lebende, CTOG-gefärbte Pankreaskarzinom-Zellen mit hyperthermierten, ungefärbten Pankreaskarzinom-Zellen koinkubiert. Die DNA-Integrität 94 wurde durch DAPI-Färbung untersucht. Pfeile deuten auf das Vorhandensein bzw. das Fehlen der Zellkerne und auf die Verteilung des phagozytierten Materials in der phagozytischen Vakuole hin. CTOG: Celltrace Oregon Green; Maßstab: 10 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). 3.10. Zell-in-Zell Strukturen im Gewebe Zur Untersuchung von nicht-professioneller Phagozytose im Gewebe wurden Tumorgewebeschnitte verwendet. Die Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen wurde in 416 Gewebeproben aus sieben verschiedenen Kohorten quantifiziert. Zu den Kohorten zählten fünf HNSCC Kohorten sowie eine Rektumkarzinom und eine Analkarzinom Kohorte (Tabellen 13 – 15). Die fünf HNSCC Kohorten wurden unterschieden als (i) Erkrankung im Frühstadium mit niedrigem Risiko, behandelt mit adjuvanter RCT, (ii) Fortgeschrittene Erkrankung mit hohem Risiko, behandelt mit definitiver RT, (iii) Metastasierung, behandelt mit adjuvanter RT oder RCT, (iv) ohne Fernmetastasen, behandelt mit neoadjuvanter RCT und (v) Tumore, behandelt mit adjuvanter RCT, mit Gewebeproben von Tumorzentrum und Invasionsfront. Das Gesamt Überleben für fünf Jahre entsprach 60,3 % in den HNSCC Kohorten, 75,0 % in der Rektumkarzinom Kohorte und 68,5 % in der Analkarzinom Kohorte (Tabelle 16). Um Zell-in-Zell Strukturen in den TMAs identifizieren zu können, wurde das Adhäsionsmolekül E-Cadherin angefärbt. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin gefärbt (Abbildung 35). Vollständiges Umschließen der internalisierten Zelle mit der Zellmembran der phagozytischen Zelle, ein sichelförmiger Nukleus der phagozytischen Zelle und eine runde Form der inneren Zelle waren Voraussetzung für die Wertung als Zell-in-Zell Struktur. 95 Abbildung 35: Nachweis von Zell-in-Zell Strukturen in Gewebeschnitten Gezeigt wird ein repräsentatives HNSCC TMA Feld, das viele Zell-in-Zell Strukturen aufweist. Die Zellmembranen wurden durch Färbung von E-Cadherin sichtbar gemacht, die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin angefärbt. Die Pfeile markieren Phagozytose-Ereignisse. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). Zur Überprüfung, ob die internalisierten Zellen apoptotisch waren, wurde mit Immunhistochemie das Vorhandensein von aktivierter Caspase 3 in Gewebeproben der HNSCC Kohorten analysiert (Abbildung 36). Es stellte sich heraus, dass von insgesamt 572 gezählten Zell-in-Zell Strukturen lediglich drei Ereignisse apoptotische Zellen enthielten. Somit waren 99,5 % der untersuchten Zellin-Zell Strukturen nicht-apoptotisch. 96 Abbildung 36: Zell-in-Zell Strukturen im Gewebeschnitt Gezeigt wird eine Immunfluoreszenz-Färbung für E-Cadherin (grün) und aktivierte Caspase 3 (rot) in einem Gewebeschnitt eines HNSCC-Kollektivs. Die Zellkerne wurden mit DAPI blau angefärbt. Die Pfeile deuten auf Zell-in-Zell Strukturen mit apoptotischen und nicht-apoptotischen internalisierten Zellen. Maßstab: 100 µm. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). Zur Quantifizierung von Phagozytose-Ereignissen in Tumorgeweben wurde die Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen pro mm² mit einem Bildanalyse-Programm analysiert. In allen untersuchten Kohorten konnten Zell-in-Zell Strukturen aus97 gemacht werden. Die durchschnittliche Häufigkeit reichte von 0,7 CIC/mm² in der HNSCC-Kohorte mit niedrigem Risiko bis zu 17,3 CIC/mm² in der Rektumkarzinom-Kohorte. Der Anteil von Gewebeproben, die Zell-in-Zell Strukturen enthielten, variierte von 25,0 % in der post-therapeutischen HNSCC- Untergruppe bis zu 95,7 % in der Analkarzinom-Kohorte (Abbildung 37). Abbildung 37: Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen bei verschiedenen Krebserkrankungen Dargestellt sind die Häufigkeiten von Zell-in-Zell Strukturen in den untersuchten Kohorten. Die ermittelten Häufigkeiten in den HNSCC-Kohorten wurden verglichen. RCT: Radiochemotherapie; RT: Radiotherapie; Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). Um die unterschiedlichen HNSCC Gewebeproben vergleichen und analysieren zu können, wurden sie nach Charakteristiken für niedriges und hohes Risiko und nach Behandlungsmodalitäten eingeteilt. Es wurde festgestellt, dass Gewebeschnitte von inoperablen Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung signifikant mehr Phagozytose-Ereignisse enthielten als Patienten im Frühstadium 98 der Erkrankung mit niedrigem Risiko (Abbildungen 37 und 38A). Die durchschnittliche Anzahl von Zell-in-Zell Strukturen in befallenen Lymphknoten war signifikant niedriger als in den korrespondierenden Primärtumoren, wohingegen die Anzahl von Patienten, deren Gewebeproben Phagozytose-Ereignisse enthielten, sehr ähnlich war (Abbildungen 37 und 38B). Der Vergleich von prätherapeutischen Biopsien und post-therapeutischen Tumor-Resektionen (sechs Wochen nach RCT) einer HNSCC Kohorte zeigte eine signifikante Verringerung der Phagozytose-Ereignisse bei den post-therapeutischen Proben (Abbildungen 37 und 38C). Außerdem wurden die Häufigkeiten von Zell-in-Zell Strukturen im Tumorzentrum und in der Invasionsfront miteinander verglichen. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl der Anteil von Gewebeproben, die PhagozytoseEreignisse enthielten, sowie die durchschnittliche Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen im Tumorzentrum höher als in der Invasionsfront waren (Abbildungen 37 und 38D). Die prä-therapeutischen Biopsien der Analkarzinom-Kohorte wiesen eine hohe durchschnittliche Häufigkeit von 10,7 CIC/mm² auf. Die höchste Dichte an Zell-in-Zell Strukturen wurde mit einer Häufigkeit von 200 CIC/mm² in einer Gewebeprobe der post-therapeutischen Rektumkarzinom-Kohorte quantifiziert (Abbildungen 37 und 38E). Wegen der geringen Größe der Kohorte von Patienten mit Analkarzinom (n = 23) wurde die ÜberlebensAnalyse als nicht repräsentativ betrachtet. 99 Abbildung 38: Häufigkeit von Zell-in-Zell Strukturen in verschiedenen Krebserkrankungen im Vergleich Dargestellt sind die Häufigkeiten von Zell-in-Zell Strukturen in Gewebeproben jeweils im Vergleich: HNSCC-Patienten mit niedrigem und hohem Risiko (A), HNSCCPrimärtumoren und befallene Lymphknoten (B), HNSCC-Patienten vor und nach neoadjuvanter RCT (C), von HNSCC-Tumorzentrum und Invasionsfront (D) und von posttherapeutischen Gewebeproben von Rektumkarzinomen mit prä-therapeutischen Biopsien von Analkarzinomen (E). RCT: Radiochemotherapie; RT: Radiotherapie; Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). Außerdem wurde ein möglicher Zusammenhang zwischen CIC-Häufigkeiten und Krankheitsverlauf untersucht, um eine prognostische Relevanz von CIC zu überprüfen. Um dies zu erreichen wurden die CIC-Häufigkeiten von 83 Patienten mit Rektumkarzinom und von 234 Patienten mit HNSCC mit den Überlebenszeiten verglichen. Die Kaplan-Meier-Kurven wurden so angefertigt, dass sie die Zeitspanne bis zum Eintritt des untersuchten Ereignisses (lokales Therapieversagen, Metastasierung, Gesamt-Überleben) beginnend vom Zeitpunkt der Diagnose angeben. Niedrige CIC-Häufigkeiten oder das gänzliche Fehlen von Zell-in-Zell Strukturen wiesen einen besseren prognostischen Wert auf. Niedrige CIC-Raten wurden mit einer längeren Zeit bis zum lokalen TherapieVersagen und längerem Metastase-freiem Überleben bei Patienten mit Rektum- 100 karzinom assoziiert (p=0,032). Niedrige CIC-Häufigkeiten oder das Fehlen von Zell-in-Zell Strukturen korrelierte signifikant mit einem verbesserten GesamtÜberleben bei Patienten mit HNSCC (p=0,005) (Abbildung 39). Abbildung 39: Überlebenskurven nach Kaplan-Meier Dargestellt sind Kaplan-Meier Kurven für die Kohorten von Patienten mit HNSCC (obere Reihe) mit Zell-in-Zell Strukturen (grüne, gepunktete Linie) und ohne Zell-in-Zell Strukturen (blaue Linie). Die Kaplan-Meier Kurven für die Kohorte von Patienten mit Rektumkarzinom (untere Reihe) zeigen Patienten mit mehr oder genau 10 CIC/mm² (grüne, gepunktete Linie) und mit weniger als 10 CIC/mm² (blaue Linie). Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). 101 4. Diskussion 4.1. Phagozytose-Induktion durch Hyperthermie Die Phagozytose-Aktivität von sog. nicht-professionellen Phagozyten, meist benachbarten Zellen im Gewebeverband, ist ein bekanntes Phänomen, deren zugrunde liegenden Mechanismen sowie die dazu fähigen Zelltypen bisher noch nicht bis ins Detail erforscht sind. Der Fokus dieser Studie wurde auf die Aufnahme von primär nekrotischen Zellen durch verschiedene Tumorzellen sowie primären gesunden Haut-Fibroblasten gelegt. Für die Induktion der primären Nekrose wurde zum einen die Behandlung mit starker Hitze (45 min bei 56 °C) und zum anderen Bestrahlung gewählt. Da sich die Hyperthermie als zuverlässigere Methode mit einer Nekrose-Induktionsrate von 100 % bewährte, wurde diese Behandlung für die meisten in dieser Arbeit durchgeführten Experimente verwendet. Auffällig war, dass bei dieser Behandlung, im Gegensatz zur Bestrahlung, kaum nekrotische Debris entstand. Die Morphologie der hyperthermierten Zellen entspricht dem frühen Stadium der primären Nekrose. Die Zellen enthielten einen intakten Zellkern bei gleichzeitiger Lyse der Zellmembran. Die durchflusszytometrischen Messungen bestätigten, dass die Behandlung mit Hyperthermie die Permeabilisierung der Zellmembran und den nekrotischen Zelltod induzierte. Um den Effekt der Hyperthermie auf die Proteine der behandelten Zellen zu erfassen, wurde die Protein-Konzentration basierend auf der eingesetzten Zellzahl mit einem BCA photometrisch bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass die Behandlung mit Hitze eine drastische Reduktion der messbaren Proteine hervorrief. Zusätzlich wurde mittels Immunfluoreszenz der Verlust von E-Cadherin, die Unfähigkeit zur Phosphorylierung von Ezrin und zur Formation von Aktinfilamenten nachgewiesen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die behandelten Zellen ohne eigenes Mitwirken passiv von der phagozytischen Zelle aufgenommen werden. Da gezeigt werden konnte, dass unbehandelte, lebende Zellen in demselben Phagozytose-Versuch im Suspensions-System nicht internalisiert werden, wird angenommen, dass diese Veränderungen der Zellmembran von nekrotischen Zellen die Phagozytose stimulieren. Der erste Schritt dabei ist eine verstärkte Adhäsion an die beschädigten Zellen, wodurch schließlich die Aufnahme der 102 nekrotischen Zellen induziert wird. Die Korrelation zwischen dem Grad der Adhäsion und der Phagozytose-Rate wurde mit einem Temperatur-Gradienten demonstriert. Nach der Behandlung mit Temperaturen zwischen 42 – 56 °C für 45 min wurden die Adhäsions-Rate und die Phagozytose-Rate quantifiziert. Dabei wurde eine kritische Temperatur von 54 °C identifiziert, die zu einer signifikanten Erhöhung der Adhäsion und Phagozytose führt. Damit wurde gezeigt, dass die Phagozytose-Rate vom Grad der Adhäsion abhängt und gleichzeitig, dass eine Behandlung mit starker Hitze notwendig ist, um die Membran ausreichend zu verändern, wodurch die erhöhte Adhäsion zustande kommt. Hyperthermie als Methode zur Nekrose-Induktion scheint irrelevant für die Nekrose in vivo zu sein, dennoch wird die Behandlung mit Hitzeschock als geeigneter Ansatz für die Untersuchung der Beseitigung sterbender Zellen durch benachbarte, nicht-professionelle Phagozyten angesehen, weil die hyperthermierten Zellen dem charakteristischen Erscheinungsbild nekrotischer Zellen, wie Lyse der Zellmembran gleichen. Ein weiteres Merkmal nekrotischer Zellen ist der Verlust des proliferativen Potenzials. Dies wurde mit einem Koloniebildungstest getestet, indem bei verschiedenen Temperaturen behandelte Zellen verwendet werden. Es wurde beobachtet, dass das proliferative Potenzial nach Behandlung bei 45 °C noch geringfügig vorhanden war, wohingegen die Behandlung bei 56 °C keine Proliferation mehr zuließ. Damit wurde die Induktion von nekrotischem Zelltod bestätigt. Hitze-Behandlung induziert Zell-Stress und resultiert in der erhöhten Expression von Hitzeschockproteinen, die in ihrer Funktion als Chaperone, neu exprimierte Proteine während deren Faltung stabilisieren und beschädigte Proteine reparieren oder zum Abbau dem Proteasom zuführen (Slater, Cato et al. 1981, Hightower 1991, Hartl 1996). Der nachgewiesene Protein-Verlust durch die gewählte Temperatur-Behandlung könnte zur erhöhten HSP70-Expression führen. Wegen der induzierten Disintegrität der Zellmembran wurde eine erhöhte HSP70-Konzentration im Überstand erwartet. Diese Fragestellung wurde mit einem ELISA untersucht, bei dem die Überstände basierend auf der eingesetzten Zellzahl von hyperthermierten und unbehandelten Zellen in Suspensionskultur nach 4 h und 24 h bestimmt wurde. Dabei wurden in allen Proben relative hohe HSP70-Konzentrationen gemessen, wider Erwarten wurden jedoch die höchsten Werte bei den unbehandelten Zellen festgestellt. Es ist anzunehmen, dass die hohe HSP70-Konzentration bei den lebenden Zellen auf eine aktive 103 Sekretion zurückzuführen ist und die hohe Menge an HSP70 auf eine Hochregulation der HSP70-Expression aufgrund einer Stressreaktion, die durch die Kultur in Suspension hervorgerufen wurde. Die Stress-Reaktion von adhärenten Zellen in Suspensionskultur kann das Eintreten in die Anoikis, einer Form der Apoptose, induzieren (Meredith, Fazeli et al. 1993, Frisch and Francis 1994). Die gemessenen, niedrigeren Werte für die HSP70-Konzentration nach Hyperthermie sind möglicherweise auf eine Denaturierung von HSP70 und eine Reduktion der Genexpression aufgrund der Induktion von primärer Nekrose zurückzuführen und geben die Konzentration von passiv freigesetztem HSP70 an. Nach Behandlung mit Hyperthermie wurde eine Akkumulation des AutophagieMarkers LC3 und des Lysosomen-Markers LAMP1 mittels Immunfluoreszenz beobachtet. LC3-positive Vesikel, anstelle eines diffusen Färbemusters, gelten als Marker für die Induktion von Autophagie, wobei allein die Anwesenheit dieser Vesikel nicht ausreichend ist, um Autophagie nachzuweisen. Eine Rolle der Autophagie-Maschinerie wurde inzwischen auch für die Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen impliziert (Shibata, Lu et al. 2006). LC3 und weitere Autophagie-assoziierte Proteine, die bei der Formation von Autophagosomen beteiligt sind, wurden auch mit dem nekrotischen Zelltod in Verbindung gebracht (Yu, Alva et al. 2004, Erlich, Shohami et al. 2006). Diesen Proteinen wurde sogar eine essentielle Rolle für den Ablauf der Nekrose zugeschrieben, insbesondere LC3 (Samara, Syntichaki et al. 2008). Aufgrund dieser Studien und der charakterisierten Eigenschaften der hyperthermierten Zellen wird angenommen, dass die Hitze-Behandlung, trotz der dokumentierten Anhäufung von LC3-positiven Vesikeln, Nekrose anstelle von Autophagie in den durchgeführten Versuchen induzierte. Der Phagozytose-Versuch wurde in einem Suspensions-System durchgeführt, wobei in einem Experiment mit auf Objektträgern angewachsenen Zellen die Phagozytose von nekrotischen Zellen durch adhärente Zellen ebenfalls nachgewiesen wurde. Daher kann angenommen werden, dass diese Vorgänge auch im Gewebeverband auftreten können. Die Aufnahme fand gleichermaßen homotypisch wie heterotypisch statt, war also nicht an die Interaktion zwischen Zellen derselben Zelllinie gebunden. Dies deutet auf die Erkennung ubiquitär exprimierter Moleküle hin, die Adhäsions-fördernd wirken und schließlich die Phagozytose stimulieren. Zur Untersuchung beteiligter Proteine wurden die 104 phagozytierenden Zellen vor der Koinkubation mit nekrotischen Zellen mit verschiedenen Agenzien behandelt. Dazu zählte die intensive Behandlung mit Proteasen, welche eine Reduktion von Oberflächenmolekülen wie Adhäsionsmolekülen bewirken sollten, die Inhibition der Aktinfilamente und Mikrotubuli sowie die Hemmung der GTPase Aktivität von Dynamin II, das eine essentielle Rolle bei der Abschnürung von Vesikeln bei der Endozytose spielt und bereits mit der professionellen Phagozytose assoziiert wurde (siehe 1.2). Alle durchgeführten Ansätze führten eine erhebliche Reduktion der Phagozytose-Raten herbei, wobei ein vollständiger Verlust der Phagozytose-Fähigkeit bei Hemmung des Aktin-Zytoskeletts verursacht wurde. Aber auch die Hemmung von Dynamin II und der Mikrotubuli verringerte jeweils drastisch die Phagozytose-Aktivität. Diese Versuche beweisen die passive Aufnahme der nekrotischen Zellen, die ohne zelluläre Aktivität der hyperthermierten Zellen zustande kommt, aber durch die Veränderungen der Zellmembran bei Nekrose-Induktion hervorgerufen wird. 4.2. Phagozytose-Induktion durch Röntgenstrahlung Neben der Behandlung mit Hyperthermie wurde die Phagozytose durch nichtprofessionelle Phagozyten auch durch Röntgenstrahlung induziert. Die Dosen und Inkubationszeiten nach Bestrahlung wurden bei den verwendeten Zelllinien (T-Zell-Leukämiezellen, Pankreaskarzinom- und Kopf-Hals-Tumorzellen) zur effizienten Induktion von Nekrose optimiert. Gleichzeitig konnte eine Induktion von Apoptose allerdings nicht vermieden werden, sodass die PhagozytoseVersuche die Aufnahme von nekrotisch sowie apoptotisch sterbenden Zellen repräsentieren. Dabei wurden ähnlich hohe Phagozytose-Raten bei Pankreaskarzinom- und Kopf-Hals-Tumorzellen sowie gesunden Haut-Fibroblasten im Vergleich mit Hyperthermie quantifiziert. Dies deutet darauf hin, dass die untersuchte phagozytische Aktivität der verwendeten Zelllinien nicht auf die Beseitigung hyperthermierter Zellen beschränkt ist, sondern vielmehr einen Prozess zur Aufnahme beschädigter, sterbender Zellen darstellt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass nicht nur nekrotische, sondern auch bestrahlte, apoptotische Zellen aufgenommen werden, indem mittels Immunfluoreszenz-Färbung der ApoptoseMarker aktivierte Caspase 3 in phagozytischen Strukturen nachgewiesen wurde. In Bezug auf eine Studie, welche die Phosphatidylserin-Exposition bei Nek105 rose beweist (Hirt and Leist 2003), kann angenommen werden, dass sich nekrotische und apoptotische Zellen im Verlust der membranösen Phosphatidylserin-Asymmetrie ähneln. Es ist daher möglich, dass diese Gemeinsamkeit die Phagozytose-Aktivität von nicht-professionellen Phagozyten stimuliert. Ähnlich der Phagozytose-Versuchen mit Hyperthermie wurden sowohl homotypische als heterotypische Phagozytose-Strukturen beobachtet. Die Aufnahme von bestrahlten T-Zellen erwies sich dabei am effizientesten, was womöglich auf deren kleinere Zellgröße zurückzuführen ist. Durch die Bestrahlung mit folgenden langen Inkubationszeiten (drei Tage bis zu drei Wochen) häufte sich nekrotische Debris im Überstand an. Um dem Anspruch gerecht zu werden, dass die Beseitigung nekrotisch sterbender Zellen untersucht werden soll, muss die Aufnahme von zellulären Bruchstücken ebenfalls berücksichtigt werden. Die Quantifizierung dieser zellulären Bruchstücke wurde auf eindeutige phagozytische Strukturen beschränkt, bei denen eine sichelförmige Deformation des Zellkerns des Phagozyten vorhanden war. Insgesamt konnte eine große Anzahl derartiger Phagozytose-Ereignisse festgestellt werden. Dies beweist, dass nicht nur nekrotische Zellen, die sich im frühen Stadium des Zelltods befinden, aufgenommen werden, sondern auch zelluläre Bruchstücke von nicht-professionellen Phagozyten gebunden und effizient beseitigt werden. 4.3. Rekrutierung Phagozytose-assoziierter Proteine Nachdem die Ergebnisse der Inhibitions-Versuche von Zytoskelett und Membranoberflächenmolekülen (siehe 3.7.1 – 2) deren essentielle Beteiligung bei der Durchführung der Phagozytose gezeigt hatten, wurden ImmunfluoreszenzFärbungen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Phagozytose- Prozesses zur Anfärbung von F-Aktin, E-Cadherin und dem Verbindungsprotein von Zellmembran und Zellskelett Ezrin unternommen. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen unterstützen die vorangegangenen Ergebnisse und verifizieren eine Verdichtung von F-Aktin sowie von dem Adhäsionsmolekül E-Cadherin an der Kontaktstelle zur nekrotischen Zelle während des Aufnahmeprozesses. Auch für die phosphorylierte Form von Ezrin, die für Bewegungen der Zellmembran notwendig ist, konnte ein ähnliches Färbemuster nachgewiesen werden. 106 Des Weiteren wurde eine Anhäufung von LC3-positiven Vesikeln an der Kontaktstelle zur aufzunehmenden Zelle beobachtet. LC3 wird zusätzlich zur Autophagie auch mit der LC3-assoziierten Phagozytose (LAP) in Verbindung gebracht. Dieser Prozess beschreibt die Rekrutierung von LC3 zu Phagosomen und anschließender Fusion dieser Vesikel mit Lysosomen. Der LAP wurde bisher eine Rolle für die Beseitigung von Pathogenen und sterbenden Zellen durch professionelle Phagozyten, sowie der Aufnahme von autophagischen Zellen (durch Anoikis oder Tamoxifen-Behandlung) durch epitheliale Brustkarzinom-Zellen (Petrovski, Zahuczky et al. 2007) und bei der Entose zugeschrieben (Florey, Kim et al. 2011). In Übereinstimmung mit der LAP zeigen die durchgeführten Versuche eine temporäre Rekrutierung von LC3 und eine Akkumulation von LAMP1-positiven Vesikeln im Zytoplasma des nichtprofessionellen Phagozyten um die aufgenommene Zelle herum. Daher wird ein ähnlicher Mechanismus, bei dem LAP involviert ist, für die Aufnahme primär nekrotischer Zellen durch nicht-professionelle Phagozyten vorgeschlagen, wobei weitere zukünftige Experimente dieser Hypothese belegen müssen. Da es sich bei diesem Phagozytose-Versuch um eine Kombination eines Suspensions-Systems mit adhärent wachsenden Zellen handelt, musste überprüft werden, ob die beobachteten Färbemuster der untersuchten Proteine auf die für den Zelltyp unnatürlichen Bedingungen zurückzuführen sind oder aber auch bei Zellen im angewachsenen Zustand auftreten. Deshalb wurden Versuche mit auf Objektträgern angewachsenen Zellen durchgeführt und die ImmunfluoreszenzFärbungen zu den gleichen Zeitpunkten durchgeführt. Dabei wurde eine stark ähnelnde Lokalisation der angefärbten Proteine in den phagozytischen Strukturen festgestellt. Daher wurde die Interaktion von E-Cadherin, F-Aktin, p-Ezrin, LC3 und LAMP1 bei der Phagozytose-Aktivität als wichtiger Bestandteil des Prozesses gewertet. 4.4. Zelltod der inkorporierten Zelle Die Beobachtungen zur Entwicklung von Phagozytose-Ereignissen über die Zeit (bis zu drei Tage) ergaben, dass die aufgenommene Zelle innerhalb von 24 h zugrunde geht. Diese Annahme basiert auf dem beobachteten Zerfall des Nukleus, der mittels DAPI-Färbung verifiziert wurde. Bei Zell-in-Zell Strukturen, die sich nach 4 h gebildet hatten, waren noch beide Zellkerne sichtbar, wobei der 107 Zellkern der phagozytierenden Zelle sichelförmig an die Peripherie gedrängt wurde. Nach 24 h war der Zellkern der aufgenommenen Zelle nicht mehr mit DAPI färbbar. Da dieser DNA-Farbstoff bevorzugt an die kleine Furche der Doppelhelix bindet (Cavatorta, Masotti et al. 1985), ist anzunehmen, dass die Integrität der DNA innerhalb von 24 h verloren ging. Zu diesem Zeitpunkt nahm der Nukleus der phagozytischen Zelle bereits seine ursprüngliche, ovale Form wieder an. Des Weiteren wurde eine Verringerung der Immunfluoreszenzsignale für HSP70 und LAMP1 nachgewiesen wurde. Der Abbau und der Expressionsstopp dieser angefärbten Proteine beweisen zusammen mit dem Verlust der Integrität von DNA den unumkehrbaren Zelltod. Jedoch scheint insgesamt der Abbau der inkorporierten Zelle nur sehr langsam vonstatten zu gehen, da selbst nach 72 h noch phagozytiertes Material nachgewiesen wurde. Die Frage, ob die aufgenommene Zelle von der phagozytischen Zelle überhaupt vollständig degradiert wird, konnte nicht beantwortet werden. Es wurde aber auch keine Induktion von Zelltod bei der phagozytierenden Zelle beobachtet. Somit deuten die Ergebnisse doch mehr auf den Abbau der inkorporierten Zelle hin. In der Folge könnte der Phagozyt das Material mittels Exozytose ausschleusen, Nährstoffe verwenden und die Moleküle für den Aufbau zellulärer Strukturen nutzen. In diesem Zusammenhang wurde ein Transfer von DNA-Material bei der Phagozytose von apoptotische Körperchen durch Fibroblasten, Makrophagen und Endothelzellen beschrieben, der eine Übertragung von transkriptionsfähigen, aktiven Genen ermöglicht (Holmgren, Szeles et al. 1999). Um dies zu untersuchen wurden die aufzunehmenden Zellen vor der Hitze-Behandlung entweder mit Histon H2B-RFP transfiziert oder mit dem Nukleosid-Analogon EdU markiert, um Bestandteile des Chromatins sichtbar zu machen. Innerhalb von 48 h wurde keine Übertragung des Kernmaterials in den Nukleus des Phagozyten festgestellt. Es ist jedoch nicht vollkommen auszuschließen, dass das markierte Kernmaterial dennoch in den Nukleus des Phagozyten eingebaut wurde, sofern es zuvor proteolytisch gespalten wurde und daher nicht mehr sichtbar war. 108 4.5. Nicht-professionelle Phagozytose versus professionelle Phagozytose Es wird angenommen, dass ein Teil der geschätzten 50-70 Mio Zellen, die pro Tag im menschlichen Körper sterben und ersetzt werden, von benachbarten Zellen, als nicht-professionelle Phagozyten, entfernt werden (Reed 2006). Dabei unterstützen diese Zellen die Immunzellen, welche als professionelle Phagozyten Gewebeschäden erkennen und effizient zelluläre Debris, die prophagozytische „eat-me“ Signale exponiert und DAMPs freisetzt, beseitigen. Zu diesen endogenen Moleküle zählen F-Aktin (Ahrens, Zelenay et al. 2012), Hitzeschockproteine (HSP70, HSP90) und Calretikulin (Obeid, Tesniere et al. 2007), sowie modifizierte Lipide und Proteine der Zellmembran. Zur Untersuchung, ob diese pro-phagozytischen Signale auch die PhagozytoseAktivität bei den verwendeten nicht-professionellen Phagozyten stimulieren, wurde das Medium nach der Hyperthermie-Behandlung ersetzt. Die gewonnenen Phagozytose-Raten wichen nicht von der Kontrolle ab und deuten daher darauf hin, dass freigesetzte DAMPs, wie das im Überstand nachgewiesene HSP70 nicht notwendig sind, um die Zellen auf die Phagozytose vorzubereiten. Die exponierten pro-phagozytischen Signale, vor allem PS, scheinen ausreichend zu sein, um die Phagozytose zu vermitteln. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass die Menge von DAMPs, die während der Koinkubation freigesetzt wird, diesen Effekt verstärkte. Die Dosis-Wirkungs-Kurve mit AnxA5 demonstrierte, dass PS-Rezeptor Interaktionen eine Schlüsselrolle bei der effizienten Aufnahme nekrotischer Zellen spielen, aber auch, dass die Phagozytose nicht vollständig und limitierend von der Erkennung von PS abhängig ist. Bei der Expressionsanalyse von verwendeten phagozytischen und nicht-phagozytischen Zelllinien stellte sich heraus, dass die untersuchten pro-phagozytischen Gene von den Zelllinien unterschiedlich stark exprimiert wurden. Die gewählten Phosphatidylserin- und TetheringRezeptoren (CD68, TIM1, CD36, ITGB5) sind für ihre Funktion bei der Phagozytose apoptotischer Zellen bekannt (Ramprasad, Fischer et al. 1995, Sambrano and Steinberg 1995, Fadok, Warner et al. 1998, Kobayashi, Karisola et al. 2007, Singh, D'Mello et al. 2007). Ein Beweis für die direkte Beteiligung der nachgewiesenen, exprimierten Rezeptoren blieb in dieser Arbeit aus. Aufgrund der Abhängigkeit von der Bindung an PS auf nekrotischen Zellen, wird 109 jedoch die individuelle Effizienz der verwendeten Zelllinien auf ihr jeweiliges Rezeptor-Repertoire zurückgeführt. Da gezeigt werden konnte, dass semiadhärente Zellen, die also wenig Adhäsionsmoleküle exprimieren, nicht Phagozytose-fähig sind, stellt eine weitere Ursache für die unterschiedlichen Phagozytose-Raten womöglich die Zelltyp-spezifische Expression von Adhäsionsmolekülen dar. Im Vergleich mit der Phagozytose von kleinen, nekrotischen Partikeln durch Makrophagen, die mit Raten von bis zu 10 % nach nur 30 min Koinkubation beschrieben wird, wurden insgesamt eher niedrige Phagozytose-Raten quantifiziert (Brouckaert, Kalai et al. 2004). Erste Phagozytose-Ereignisse wurden frühestens nach 2,5 h beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass der phagozytische Prozess bei nicht-professionellen Phagozyten langsamer abläuft und daher im Vergleich mit der Phagozytose-Aktivität der professionellen Phagozyten weniger effizient ist. Als Ursache dafür wird das reduzierte Rezeptor-Repertoire für die Erkennung sterbender Zellen sowie die Tatsache, dass die hyperthermierten Zellen nicht in kleine Partikel zerfallen, sondern als ganze Zellen aufgenommen werden müssen, vermutet. Die Zell-in-Zell Strukturen blieben in Suspensionskultur bis zu drei Tage erhalten, wobei ein Abbau der DNA der aufgenommenen Zelle innerhalb von 24 h beobachtet wurde (siehe 3.9). Im Gegensatz dazu fördern Makrophagen nach der Phagozytose von apoptotischen Körperchen sehr effizient den Abbau des phagozytierten Materials. Dadurch kommt es in der Regel innerhalb von wenigen Stunden zum kompletten lysosomalen Abbau des phagozytierten Materials in die zellulären Grundbausteine wie Peptide, Aminosäuren, Fette, Sterole und Nukleotide via Phagosomen-Reifung und Fusion mit Lysosomen (siehe 1.2). Durch die Aktivität der Makrophagen-eigenen lysosomalen DNase II wird die Aktivität der Caspase-aktivierten DNase der apoptotischen Zelle zur enzymatische Spaltung der DNA unterstützt (McIlroy, Tanaka et al. 2000). Die Akkumulation von LAMP1 positiven Vesikeln um die internalisierte Zelle herum, deutet auf eine ähnliche Beteiligung von lysosomalen Enzymen der nicht- professionellen Phagozyten bei der Degradation der nekrotischen Zellen hin. 110 4.6. Nicht-professionelle Phagozytose versus Kannibalismus Der Zell-Kannibalismus wird als erworbene Fähigkeit maligner Tumorzellen beschrieben, die der Nährstoffversorgung kannibalistischer Zellen im Tumormilieu dienen soll. Dabei unterscheiden die Tumorzellen bei der Aufnahme nicht zwischen lebenden und toten Tumorzellen oder Lymphozyten (Caruso, Muda et al. 2002, Lugini, Lozupone et al. 2003, Fais 2007). Im Gegensatz dazu fand in den durchgeführten Phagozytose-Versuchen nur die Aufnahme von sterbenden Zellen statt. Die selten beobachteten Phagozytose-Ereignisse von lebenden Zellen wurden eher als Aufnahme von beschädigten Zellen betrachtet, die aufgrund der Trypsinierung und der langen Inkubation in Suspension vermutlich Membranveränderungen aufwiesen. Eine Gemeinsamkeit zum Zell-Kannibalismus stellt die Tatsache dar, dass nicht-professionellen Phagozyten auch im angewachsenen Zustand phagozytierten, ähnlich dem Zell-Kannibalismus, der im Gewebeverband stattfindet. Außerdem wurde, aufgrund der Hypothese zur Nährstoffversorgung, der Einfluss von temporärem FBS-Mangel von ein bis drei Tagen auf die kannibalistische Aktivität untersucht und in Studien mit malignen Melanomzellen als Kannibalismus-fördernd nachgewiesen. Dieser Effekt wurde allerdings exklusive bei metastatischen Melanomzellen gezeigt und für Zellen des Primärtumors ausgeschlossen (Lugini, Matarrese et al. 2006). Diese Studie impliziert, dass kannibalistische Zellen durch die Aufnahme und Degradation anderer Zellen einen Vorteil erlangen, um im nährstoffarmen Tumormilieu zu überleben. Eine weitere in vitro Untersuchung zeigte die Abhängigkeit von Serum auf die KannibalismusAktivität einer kleinzelligen Lungenkarzinom-Zelllinie. Langanhaltender SerumEntzug (vier Wochen) verhinderte die Bildung von Zell-in-Zell Strukturen. Die kannibalistische Aktivität konnte aber durch Serum-Zugabe erneut aktiviert werden (Brouwer, de Ley et al. 1984). Aufgrund der erheblichen Unterschiede, die Dauer des Serumentzugs betreffend, können beide Studien nicht direkt miteinander verglichen werden. Es wird jedoch klar, dass der kurzzeitige SerumEntzug den Zell-Kannibalismus fördert, sich die Zellen aber in einem gesunden Grundzustand befinden müssen, um kannibalistisch aktiv sein zu können, was durch langanhaltenden Serum-Entzug verhindert wird. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurden die Zellen eine Woche ohne Passage bis zum konfluenten Wachstum kultiviert. Vor dem Phagozytose-Versuch wurde 111 das Medium mit Serum-freiem Medium für 24 h ersetzt und unter diesen Bedingungen eine erhebliche Verringerung der Phagozytose-Aktivität festgestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Vitalität der phagozytischen Zellen entscheiden ist, ob Phagozytose stattfindet und die phagozytische Aktivität der untersuchten nicht-professionellen Phagozyten nicht als Überlebensmechanismus angesehen werden kann. 4.7. Nicht-professionelle Phagozytose versus Entose Die Entose wurde als nicht-apoptotische Zelltodesform beschrieben, die mit der Bildung morphologisch sehr ähnlicher Zell-in-Zell Strukturen einhergeht (siehe 1.4.3). Diese invasive Aktivität von lebenden Tumorzellen in benachbarte Tumorzellen wurde als ursächlicher Mechanismus für einen Teil der in Tumorgewebeschnitten beobachteten Zell-in-Zell Strukturen vorgeschlagen (Overholtzer, Mailleux et al. 2007). Weil dieser Prozess durch eine Ablösung von der extrazellulären Matrix induziert wird, wurde eine Tumorsuppressor-Funktion vorgeschlagen, indem Zellen, die sich außerhalb ihrer Nische aufhalten, entfernt werden. Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit untersuchten nicht-professionellen Phagozyten findet Entose nur im Suspensions-System statt, nicht aber, wenn die Wirtszellen angewachsen sind. In diesem Zusammenhang muss die Hypothese über eine Tumorsuppressor-Funktion durch Entose kritisch betrachtet werden, wenn auch die Wirtszelle von der extrazellulären Matrix abgelöst ist. Eine aktuellere Studie behauptet eher das Gegenteil, nämlich eine Induktion von Aneuploidie durch Entose, das die Entstehung maligner Tumorzellen fördert (Krajcovic, Johnson et al. 2011). Aneuploide Zellen wurden bei den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen nur bei den verwendeten Tumorzelllinien beobachtet, nicht bei den primären Hautfibroblasten. Daher kann eine Gemeinsamkeit mit der Entose diesbezüglich ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden Unterschiede bei der Beteiligung von E- und P-Cadherin nachgewiesen. Die Interaktion dieser Cadherine zwischen Wirtszelle und internalisierender Zelle wurde bei der Entose mit Funktions-blockierenden Antikörpern gezeigt (Overholtzer, Mailleux et al. 2007). Die untersuchte Pankreaskarzinom-Zelllinie zeigte hingegen keine spezifische Inhibition von Adhäsion und PhagozytoseRate bei Zugabe dieser blockierenden Antikörper. Dennoch scheinen auch bei 112 der nicht-professionellen Phagozytose Cadherine beteiligt zu sein, da eine Akkumulation von E-Cadherin an der Kontaktstelle nachgewiesen werden konnte. Eine Gemeinsamkeit der Phagozytose-Aktivität mit der Entose wurde bei der Rekrutierung des Autophagiemarkers LC3 beobachtet. Bei der Entose wurde die Akkumulation von LC3 auf der entotischen Vakuolenmembran beobachtet. Auch eine Abhängigkeit von den Autophagie-assoziierten Proteinen ATG5, ATG7 und der Klasse III PI-3-Kinase VPS34 für die Fusion mit Lysosomen und dem Abbau der internalisierten Zelle wurde nachgewiesen (Florey, Kim et al. 2011). In den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen wurden ebenfalls eine ringförmige Rekrutierung von LC3, sowie die Akkumulation von Lysosomen um die phagozytierte Zelle gezeigt. Dies deutet auf eine Involvierung des LC3assoziierten Phagozytose-Mechanismus hin, der den lysosomalen Abbau der entotischen und nekrotischen Zelle auf ähnliche Weise fördert. Es wurde berichtet, dass die inkorporierten Zellen entweder durch lysosomale Enzyme der Wirtszelle abgebaut werden, eine Zellteilung durchlaufen oder noch lebend die Wirtszelle verlassen (Overholtzer, Mailleux et al. 2007). Im Gegensatz dazu trifft für die nicht-professionellen Phagozyten nur der lysosomale Abbau und Zelltod der aufgenommenen nekrotischen Zelle zu. 4.8. Prognostischer Wert von Zell-in-Zell Strukturen bei Krebserkrankungen Obwohl Zell-in-Zell Strukturen häufig in Tumoren beobachtet werden, wurden sie bisher nahezu ignoriert und nicht als möglicher prognostischer Faktor in Erwägung gezogen (Wang and Wang 2013). Für die Untersuchung einer möglichen Korrelation zwischen den Häufigkeiten von CIC-Ereignissen im Tumorgewebe und der Prognose für den Patienten wurden TMAs verschiedener Kohorten mit Rektumkarzinom und HNSCC herangezogen. Die Analyse ergab, dass in allen untersuchten Kohorten CICStrukturen vorhanden waren. Die Anzahl von Patienten mit CIC-Ereignissen und die CIC-Raten variierten aber beträchtlich und waren zum Teil abhängig vom Krebs-Typ, dem Stadium, vorangegangener Therapie-Modalität und der Lokalisation der CIC-Ereignisse innerhalb des Tumors. Zudem wurden niedrige CIC-Häufigkeiten mit einer besseren Prognose assoziiert. Deshalb wurden CIC113 Strukturen in den untersuchten Kohorten von Patienten mit Rektumkarzinom und HNSCC als prognostisch relevant betrachtet. In einer Studie von homotypischen CIC-Ereignissen im Tumorgewebe von Patienten mit Pankreasadenokarzinom wurde eine Korrelation zwischen CICHäufigkeiten und niedrigerem Metastasierungs-Risiko festgestellt und eine Schutzfunktion vor Metastasen durch CIC-Ereignisse vorgeschlagen (Cano, Sandi et al. 2012). Im Gegensatz dazu belegen andere Studien einen Zusammenhang von homotypischem Zell-Kannibalismus in Brustkarzinomen (Abodief, Dey et al. 2006), Blasenkarzinomen (Kojima, Sekine et al. 1998), Medulloblastomen (Kumar, Hosseinzadeh et al. 2001) sowie von heterotypischem ZellKannibalismus in Magenkarzinomen (Caruso, Muda et al. 2002) mit schlechter Prognose. In Bezug auf diese widersprüchlichen Studien, deuten die Ergebnisse der untersuchten Kohorten darauf hin, dass CIC-Ereignisse auf verschiedene Arten die Tumorerkrankung beeinflussen. Die Ursache für die beschriebenen Diskrepanzen liegt womöglich in Gewebe- und Zelltyp-spezifischen Unterschieden in Bezug auf Tumor-spezifisches Metastasierungs-Potenzial und Immunzell-Infiltration begründet. Die Aufnahme von nekrotischem Zellmaterial durch Tumorzellen könnte zur Immunevasion beitragen, indem die Phagozytose der nekrotischen Debris durch Antigen-präsentierende Zellen verhindert und dadurch die Entwicklung einer T-Zell-vermittelten Immunantwort gegen spezifische Tumorantigene erschwert wird (Arnold-Schild, Hanau et al. 1999). In den untersuchten Kohorten waren CIC-Strukturen mit internalisierten apoptotischen Zellen sehr seltene Ereignisse. Daher wird angenommen, dass die aufgenommenen Zellen entweder lebende, von der extrazellulären Matrix abgelöste Zellen sind oder nekrotische Zellen darstellen. Nach der Phagozytose durch Tumorzellen erfolgt möglicherweise ein metabolischer Abbau durch die Wirtszelle, sodass internalisierte, lebende Zellen keine Möglichkeit zur ApoptoseInduktion hätten. Zusammengefasst lassen sich zwei Hypothesen zum Einfluss von CICStrukturen auf Tumorerkrankungen formulieren: Die Phagozytose von Zellen, die sich von der extrazellulären Matrix abgelöst haben, ähnlich metastasierenden Zellen, durch andere Tumorzellen könnte das Risiko für Metastasierung senken. Die Beseitigung nekrotisch sterbender Zellen im Tumor hingegen entfernt gleichzeitig immunogene Signale, die eine Tumorimmunität generieren könnten. 114 4.9. Schlussfolgerung und Ausblick Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass Tumorzellen und gesunde Haut-Fibroblasten in der Lage sind, nekrotische sowie apoptotische Zellen aufzunehmen und dabei sowohl homotypische als auch heterotypische Zell-in-Zell Strukturen zu bilden. Die Fähigkeit zur Aufnahme von hyperthermierten, primär nekrotischen Zellen wurde bei mehreren Zelllinien, inklusive Pankreasadenokarzinom-, Glioblastom- und Kopf-Hals-Tumorzellen sowie primären HautFibroblasten demonstriert. Die Phagozytose hyperthermierter Zellen wurde als PS-abhängig und LC3-assoziiert charakterisiert und konnte nicht von semiadhärenten und Suspensions-Zellen ausgeführt werden. Weiterhin wurden die Aktivität der GTPase Dynamin II sowie das dynamische Rearrangement der Aktinfilamente und Mikrotubuli als essentielle mechanistische Faktoren dieses Prozesses identifiziert. Der Phagozytose-Vorgang beinhaltet die Erkennung von PS an PS-Rezeptoren, die Verdichtung von E-Cadherin, F-Aktin und p-Ezrin an der Zell-Zell-Kontaktstelle, gefolgt von einer zeitlich begrenzten Ring-ähnlichen Formation aus E-Cadherin, p-Ezrin, F-Aktin, LC3 und LAMP1 um die aufgenommene Zelle herum und resultiert im Zerfall des Nukleus innerhalb von 24 h und dem lysosomalen Abbau der phagozytierten Zelle (Abbildung 40). 115 Abbildung 40: Modell zur nicht-professionellen Phagozytose Die Fähigkeit zur Beseitigung von primär nekrotischen Zellen ist vielen verschiedenen Zelltypen, inclusive Tumorzellen und gesunden Hautfibroblasten, zu eigen. Zur Untersuchung dieses Vorgangs wurde Nekrose durch Hitze-Behandlung in verschiedenen Zelllinien induziert. Die nekrotischen Zellen enthielten zahlreiche LAMP1- und LC3positive Vesikel sowie zytoplasmatisches HSP70 nach Hyperthermie. Der homotypische sowie heterotyische Phagozytose-Prozess erfordert seitens der phagozytischen Zelle ein dynamisches Rearrangement des Aktin-Zytoskeletts, die Bindung an exponiertes PS sowie die GTPase Aktivität von Dynamin II. Die Zelllyse mit der Auflösung des Nukleus der aufgenommenen Zelle trat innerhalb von 24 h nach Phagozytose ein. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al. 2015). Weitere funktionelle Untersuchungen, womöglich auch in vivo Experimente, sind notwendig, um die molekularen Mechanismen der Aktivität von nichtprofessionellen Phagozyten zur Beseitigung nekrotischer, apoptotischer und autophagischer Zellen, zu identifizieren. Phagozytische Strukturen mit internalisierten nekrotischen Zellen, wie sie in dieser Arbeit durch Hyperthermie induziert wurden, könnten womöglich einem Teil der beobachteten CIC-Ereignisse im Tumorgewebe, die zum ZellKannibalismus zählen, zugrunde liegen. Die histologischen Analysen der Ko116 horten von Patienten mit Rektumkarzinom, Analkarzinom und HNSCC zeigten, dass CIC-Strukturen mit internalisierten nicht-apoptotischen Zellen ein häufiges Ereignis in Tumorgewebeschnitten darstellen. Außerdem wurde eine Korrelation zwischen CIC-Häufigkeiten und Krankheitsverlauf bei Patienten mit Rektumkarzinom und HNSCC nachgewiesen, sodass niedrige CIC-Häufigkeiten mit einer besseren Prognose assoziiert wurden. Zukünftige Studien sind notwendig, um das mögliche Potenzial von CICHäufigkeiten als prognostischer Marker in weiteren Krebs-Typen zu erfassen. In diesem Zusammenhang sollten auch Immunzellen sowie spezifische Proteine, die für den Mechanismus der nicht-professionellen Phagozytose essentiell sind, in den Gewebeschnitten quantifiziert werden. 117 5. Literaturverzeichnis Abodief, W. T., P. Dey and O. Al-Hattab (2006). "Cell cannibalism in ductal carcinoma of breast." Cytopathology 17(5): 304-305. Ahrens, S., S. Zelenay, D. Sancho, P. 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Anhang – Ergänzende Tabellen Die Tabellen 13 – 16 fassen die klinischen Daten der sieben verwendeten Kohorten zusammen. Die Charakteristika der Kohorten wurden bereits veröffentlicht (Schwegler, Wirsing et al. , Grabenbauer, Lahmer et al. 2006, Distel, Fickenscher et al. 2009, Pretscher, Distel et al. 2009, Tabachnyk, Distel et al. 2012). Tabelle 13: Klinische Daten der Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen, Teil 1 n Geschlecht (n) Männlich Weiblich Alter (Jahre) Median (95 % C.I.) Lokales The- Median rapie(95 % Versagen C.I.) (Monate) MetastaseMedian freies Über- (95 % leben C.I.) (Monate) GesamtMedian Überleben (95 % (Monate) C.I.) T Stadium (n) T1 T2 T3 T4 N Stadium (n) N0 N1 N2 N3 M Stadium (n) M0 M1 Grading (n) G1/2 G3/4 UICC97 (n) 1 2 3 4 Gesamt Frühstadium, adjuvante RCT Fortgeschrittene Erkrankung, definitive RT 321 274 47 54,3 (85,4) (14,6) (53,9 – 55.7) 62 51 (82.3) (15.9) 11 (17.7) (3.4) 51.0 (49.4 – 53.3) 52 43 (82.7) (13.4) 9 (17.3) (2.8) 56.0 (53.2 – 58) 50.0 (58.3 – 69.4) 67.0 (72.1 – 111) 42.0 (44.9 – 72.4) 53.0 (61.7 – 73) 81.5 (82 – 121.7) 42.0 (44.7 – 72.4) 54.0 (63.5 – 74.6) 81.5 (82 – 121.7) 44.0 (47.6 – 74.2) 59 105 78 79 68 55 186 12 237 84 176 145 15 30 61 215 (18.4) (32.7) (24.3) (24.6) (21.2) (17.1) (57.9) (3.7) (73.8) (26.2) (54.8) (45.2) (4.7) (9.3) (19) (67) 13 30 14 5 23 17 22 0 62 0 37 25 6 13 17 26 128 (21) (4) (48.4) (9.3) (22.6) (4.4) (8.1) (1.6) (37.1) (7.2) (27.4) (5.3) (35.5) (6.9) (0) (0) (100.0) (19.3) (0.0) (0) (59.7) (11.5) (40.3) (7.8) (9.7) (1.9) (21) (4) (27.4) (5.3) (41.9) (8.1) 0 2 25 25 5 4 41 2 39 13 37 15 0 0 7 45 0 (0) (3.8) (0.6) (48.1) (7.8) (48.1) (7.8) (9.6) (1.6) (7.7) (1.2) (78.8) (12.8) (3.8) (0.6) (75.0) (12.1) (25.0) (4) (71.2) (11.5) (28.8) (4.7) (0) (0) (0) (0) (13.5) (2.2) (86.5) (14) Die Werte in der ersten Klammer sind Relativwerte innerhalb der Sub-Kohorte, wohingegen die Werte in der zweiten Klammer Relativwerte in Bezug auf die gesamte HNSCC-Kohorte darstellen. C.I.: Konfidenzintervall; RCT: Radiochemotherapie; RT: Radiotherapie. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). Tabelle 14: Klinische Daten der Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen, Teil 2 Geschlecht (n) Alter (Jahre) Lokales Therapie-Versagen (Monate) Metastasefreies Überleben (Monate) GesamtÜberleben (Monate) T Stadium (n) N Stadium (n) M Stadium (n) Grading (n) UICC97 (n) n Männlich weiblich Median (95 % C.I.) Median (95 % C.I.) Median (95 % C.I.) Median (95 % C.I.) T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 N3 M0 M1 G1/2 G3/4 1 2 3 4 Metastasierung Neoadjuvante RCT Adjuvante RCT Zentrum/Invasionsfront 29 28 (96.6) (8.7) 1 (3.4) (0.3) 53.0 (49.3 – 55) 35 32 (91.4) (10) 3 (8.6) (0.9) 52,5 (51,3 – 54,5) 143 120 (83.9) (37.4) 23 (16.1) (7.2) 58,0 (56,2 – 59,2) 51,0 (48,8 – 83,9) 87,0 (74,1 – 96,6) 32,0 (34,5 – 46,1) 61,0 (51,3 – 85,7) 90,0 (77,2 – 99,6) 37,5 (37 – 48,3) 61,0 (53,8 – 89,3) 90,0 (77,5 – 99,8) 41,0 (39,9 – 51) 7 8 6 8 0 4 23 2 6 23 15 14 0 1 2 26 (24,1) (27,6) (20,7) (27,6) (0) (13,8) (79,3) (6,9) (20,7) (79,3) (51,7) (48,3) (0) (3,4) (6,9) (89,7) (2,2) (2,5) (1,9) (2,5) (0) (1,2) (7,2) (0,6) (1,9) (7,2) (4,7) (4,4) (0) (0,3) (0,6) (8,1) 3 9 6 17 7 2 25 1 32 3 27 8 1 2 2 30 (8,6) (0,9) (25,7) (2,8) (17,1) (1,9) (48,6) (5,3) (20,0) (2,2) (5,7) (0,6) (71,4) (7,8) (2,9) (0,3) (91,4) (10) (8,6) (0,9) (77,1) (8,4) (22,9) (2,5) (2,9) (0,3) (5,7) (0,6) (5,7) (0,6) (85,7) (9,3) 36 56 27 24 38 29 69 7 98 45 60 83 8 14 33 88 (25,2) (11,2) (39,2) (17,4) (18,9) (8,4) (16,8) (7,5) (26,6) (11,8) (20,3) (9) (48,3) (21,5) (4,9) (2,2) (68,5) (30,5) (31,5) (14) (42) (18,7) (58) (25,9) (5,6) (2,5) (9,8) (4,4) (23,1) (10,3) (61,5) (27,4) Die Werte in der ersten Klammer sind Relativwerte innerhalb der Sub-Kohorte, wohingegen die Werte in der zweiten Klammer Relativwerte in Bezug auf die gesamte HNSCC-Kohorte darstellen. C.I.: Konfidenzintervall; RCT: Radiochemotherapie; RT: Radiotherapie. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). 129 Tabelle 15: Klinische Daten der Rektum- und Analkarzinom Kohorten Rektumkarzinom, klinisch Gesamt männlich weiblich Alter (Jahre) Median (95 % C. I.) Rektumkarzinom, pathologisch 83 83 59 (71,1) 24 (28,9) 64,0 (59,7 – 65,2) Analkarzinom 9 14 59,0 23 (39,1) (60,9) (48,7 – 64,2) (53,3 – 98,8) Lokales The- Median (95 % C. I.) 39,0 (35,7 – 44,1) 71,0 rapieVersagen (Monate) MetastaseMedian (95 % C. I.) 38,0 (29,9 – 40,5) 82,0 (62 – 113,5) freies Überleben (Monate) GesamtMedian (95 % C. I.) 44,0 (41,9 – 48,6) 86,5 (65,9 – Überleben 115,6) (Monate) T Stadium --(n) T0 11 (13,3) --T1 0 (0) 2 (2,4) 1 (4,3) T2 7 (8,4) 25 (30,1) 13 (56,5) T3 64 (77,1) 32 (38,6) 7 (30,4) T4 12 (14,5) 13 (15,7) 2 (8,7) N Stadium (n) N0 18 (21,7) 53 (63,9) 10 (43,5) N1 52 (62,7) 30 (36,1) 5 (21,7) N2 13 (15,7) 0 (0,0) 8 (34,8) M Stadium (n) M0 53 (63,9) --20 (87) M1 30 (36,1) --3 (13) Grading (n) G1/2 73 (88,0) 16 (69,6) G3/4 10 (12,0) 7 (30,4) UICC97 (n) 1 22 (26,5) 3 (13) 2 28 (33,7) 7 (30,4) 3 21 (25,3) 13 (56,5) 4 12 (14,5) 0 (0) C.I.: Konfidenzintervall; RCT: Radiochemotherapie; RT: Radiotherapie. Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). 130 Tabelle 16: Überleben der Patienten HNSCC gesamt [%] Analkarzinom [%] Rektumkarzinom [%] 5 years 71,6 5 years 70,9 10 years 70,9 2,5 years 76,3 5 years 72,2 75,0 87,3 68,0 50,0 87,3 68,0 90,2 64,8 63,6 68,5 63,4 60,0 10 years 66,6 Überleben ohne lokales TherapieVersagen Gesamt-Überleben 60,3 39,5 Metastase-freies Überleben 81,1 78,8 ohne Krankheits-Anzeichen 69,3 63,9 (NED) Modifiziert nach (Schwegler, Wirsing et al.). 131 7. Danksagung Ich bedanke mich bei Prof. Dr. Rainer Fietkau (Direktor der Strahlenklinik) für die finanzielle Unterstützung und die Tätigkeit als Gutachter. Mein großer Dank gilt PD Dr. Luitpold Distel für die Bereitstellung des Themas und die Betreuung, insbesondere der histologischen Untersuchungen, sowie die Tätigkeit als Prüfer. Großer Dank geht auch an Prof. Dr. Falk Nimmerjahn, der sich als Betreuer an der Naturwissenschaftlichen Fakultät, als Gutachter sowie als Prüfer zur Verfügung gestellt hat. Bei Prof. Dr. Benedikt Kost bedanke ich mich für die freundliche Bereitschaft als Zweitprüfer. 132 8. Lebenslauf PERSÖNLICHE DATEN Name: Geburtsdatum: Geburtsort: Staatsangehörigkeit: AUSBILDUNG 12/2010 – 05/2015 10/2004 – 03/2010 1995 – 2004 Manuela Schwegler 23.12.1984 München Deutsch Promotion an der Strahlenklinik Erlangen Titel der Dissertation: Phagozytose von nekrotischen Zellen durch gesunde Haut-Fibroblasten und Tumorzellen Studium Biologie (Diplom) Ludwig-Maximilians-Universität München, Abschlussnote: 1,3; Titel der Diplomarbeit: Untersuchungen des Einflusses von MCAM auf die Migration von Endothelzellen in der Angiogenese Pestalozzi-Gymnasium München, Abitur 133 9. Publikationsliste Schwegler M, Wirsing AM, Dollinger AJ, Abendroth B, Putz F, Fietkau R, Distel LV. Clearance of primary necrotic cells by nonprofessional phagocytes. Biology of the Cell, 2015; 107(10): 372-387. Schwegler M, Wirsing AM, Schenker HM, Ott L, Fietkau R, Putz F, Distel LV. Prognostic Value of Homotypic Cell Internalization by Non-Professional Phagocytic Cancer Cells. BioMed Research International, 2015; Article ID 359392 (elektronische Veröffentlichung vor dem Druck 04.10.2015). Kroeber J, Wenger B, Schwegler M, Daniel C, Schmidt M, Djuzenova CS, Polat B, Flentje M, Fietkau R, Distel LV. Distinct increased outliers among 136 rectal cancer patients assessed by γH2AX. Radiation Oncology, 2015; 10:36. Wenger B, Schwegler M, Brunner M, Daniel C, Schmidt M, Fietkau R, Distel LV. PML-nuclear bodies decrease with age and their stress response is impaired in aged individuals. BMC Geriatr., 2014; 14: 42. Hecht M, Harrer T, Büttner M, Schwegler M, Erber S, Fietkau R, Distel LV. Cytotoxic effect of efavirenz is selective against cancer cells and associated with the cannabinoid system. AIDS, 2013; 27: 2031-2040. 134