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RNA Isolation und Reverse Transkription Im heutigen Praktikum werden wir RNA aus Drosophila melanogaster isolieren und damit eine reverse Transkription und PCR zur Analyse geschlechtsspezifischer Expression einzelner Gene durchführen. Bitte lesen Sie die folgenden Hintergrundinformationen zur Vorbereitung auf das Praktikum. Die Laborprotokolle werden Ihnen im Kurs zur Verfügung gestellt und dort auch besprochen. Reverse Transkriptase kann in der Praxis dazu benutzt werden, um sogenannte cDNA (complementary DNA) zu synthetisieren, d.h. einzel- oder doppelsträngige DNA-Kopien von RNAMolekülen. Solche cDNAs werden vielfältig genutzt, etwa für Hybridisierung, für Klonierungen, für Expressionsklonierungen, oder für die Erstellung von sog. cDNA- oder EST-Banken. Die eukaryotische Zelle enthält viele tausend mRNA-Arten mit jeweils zell- und gewebespezifisch unterschiedlicher Zusammensetzung. Unter einer cDNA- Genbank oder auch nur einer EST(“expressed sequence tag”) Bank versteht man eine Population von bakteriellen Stämmen oder Phagen, in denen jeweils eine mRNA pro Zelle bzw. Phagen als cDNA-Insertion in einem Plasmid bzw. Phagen vertreten ist. Die Gesamtmenge aller mRNAs an der Gesamtzell-RNA ist, trotz ihrer Diversität, allerdings recht gering, in der Regel zwischen 0,5 und 2%. Will man cDNAs von mRNA-Fraktionen herstellen, so ist es zweckmäßig, die Population der mRNA vor der reversen Transkription präparativ anzureichern. Die Synthese von cDNA kann operational in 4 Schritte gegliedert werden: 1) Assoziation der Primer: Die reverse Transkriptase benötigt einen Primer mit einer freien 3’-Hydroxygruppe. Für den heutigen Versuch wird eine von mehreren möglichen Varianten verwendet. Für eine klonierbare cDNA nukleärer RNA verwenden wir Oligo-dT von einer Kettenlänge zwischen 10 und 20 als generellen “Primer”. Dieses synthetische Oligonukleotid assoziiert vornehmlich mit den polyadenalierten Enden der mRNAs. 2) Erststrangsynthese durch reverse Transkriptase: In der Praxis wird dafür meist das Enzym eines Vögel befallenden Myoblastose-Virus (AMV, avian myoblastosis virus) oder das Enzym eines Affen befallenden Virus (MMLV, moloney murine leukoblasosis virus) eingesetzt. Durch die Polymerisation entstehen mRNA/DNA-Hybride. 3) Entfernung der mRNA aus dem mRNA/DNA-Hybrid: Vor der Synthese des zweiten Strangs muss die RNA aus den RNA/DNA-Hybridmolekülen entfernt werden. Dies kann durch eine spezifische RNase (RNase H) oder durch Alkalibehandlung erzielt werden. 4) Zweitstrangsynthese: Der zweite DNA-Strang kann im Prinzip mit verschiedenen Enzymen, auch der reversen Transkriptase, hergestellt werden. Üblicherweise verwendet man jedoch das sog. KlenowFragment der DNA- Polymerase I aus E. coli. Diesem Enzym fehlt die 5’-3’-Exonukleaseaktivität der Polymerase, so dass der Abbau der neugebildeten doppelsträngigen DNA verhindert wird. Auch dieses Enzym benötigt ein freies 3’-OH-Ende und damit einen “Primer”, der im vorliegenden Fall durch spontane Schleifenbildung (“hairpin”- oder “loop”-Bildung) der Einzelstrang-cDNA ensteht.
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Weitere Schritte sind erforderlich, soll eine doppelsträngige cDNA kloniert werden: 1) Trimmen der doppelsträngigen cDNA: Durch Behandlung mit S1- oder Mungbohnen Nuklease, beides Enzyme, die einzelsträngige Nukleinsäuren hydrolysieren, werden überhängende Einzelstrangenden und die Schleifenstruktur an einem Ende der cDNA entfernt. Es entsteht eine doppelsträngige cDNA mit glatten Enden (engl. “blunt ends”). 2) “Linker”-Addition: Sollen nach der Klonierung die cDNA-Insertionen wieder aus dem Vektor exzisierbar sein, so müssen an die glatten Enden der cDNA sog. “linker” addiert werden, d.h. chemisch synthetisierte kurzkettige, komplementäre Oligonukleotide meist von 6-15 Nukleotiden Länge, die die Erkennungssequenz gewöhnlich einer Restriktionsendonuklease (z.B. EcoRI) enthalten. Solche Moleküle können tandemartig miteinander oder mit einem analog restringierten Vektor assoziieren und durch eine Inkubation mit DNA- Ligase kovalent miteinander verknüpft werden. 3) Maskierung interner Restriktionsschnittstellen: Der “linker”-Addition vorgeschaltet wird meist eine Modifizierung sogenannter interner Schnittstellen für das Enzym, mit dem die Klonierung durchgeführt wird, im beschriebenen Fall durch die der EcoRI-Restriktase komplementären EcoRI-Methylase. Die Markierung etwaiger EcoRI-Schnittstellen in der cDNA entzieht sich dem Angriff durch das EcoRI-Enzym und verhindert das Zerschneiden der cDNA beim Trimmen der addierten „linker”. Vor der molekularen Klonierung wird die cDNA nämlich mit dem für die Klonierung vorgesehenen Enzym behandelt, um die tandemartig vorhandenen übererschüssigen “linker”-Sequenzen an den cDNA-Enden zu entfernen und “linker”-Monomere zu erhalten. Danach ist die cDNA an ihren Enden mit Sequenzen für EcoRI- Schnittstellen ausgestattet und kann durch Ligation in einen mit EcoRI geschnittenen Vektor, z.B. in den Phagen λgt11, integriert und die rekombinante DNA in Bakterien kloniert werden.
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