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OPTIMISATION INSTRUMENTALE DE LA TECHNIQUE DE GAP-FRAP VISANT À DISCRIMINER DIFFERENTS TYPES CELLULAIRES SELON L’ACTIVITE DES JONCTIONS COMMUNICANTES INSTRUMENTAL OPTIMIZATION OF GAP-FRAP TECHNIQUE RELATED TO GAP JUNCTIONS FUNCTIONALITY FOR DIFFERENT CELL TYPES JR Stines1, M Abbaci1, W Blondel2, M Barberi-Heyob1, D Dumas3, F Guillemin1, J Didelon1. 1
CRAN-UMR CNRS 7039, Centre de Recherche en Automatique de Nancy – CAV, Centre Alexis Vautrin, 54511 Vandoeuvre (France), 2 CRAN-UMR CNRS 7039, Centre de Recherche en Automatique de Nancy – INPL, Institut National Polytechnique de Lorraine, 54511 Vandoeuvre (France), 3 LEMTA-UMR CNRS 7563 et équipe IFR 111, Laboratoire de mécanique et ingénierie cellulaire et tissulaire, Plateau Technique d’Imagerie Cellulaire, Faculté de médecine, 54511 Vandoeuvre(France). ABSTRACT Gap junctionnal intercellular communication has been shown to be involved in the carcinogenesis process. GAP-FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) technique could be used to estimate gap junctions functionality and their potential involvement for distinguish normal and cancer cells. We developed a sensitive microspectrofluorimetric method to characterize the kinetics of fluorescence recovery after photobleaching. We used a positive control cell line (fibroblast), a negative control (FaDu) and an intermediate (KB) head and neck cancer cell lines. Our results indicate that using our approach, the fluorescence kinetic profiles remain comparable with the method widely used by confocal microscopy. INTRODUCTION La communication intercellulaire se fait chez l’homme par l’intermédiaire de canaux transmembranaires appelés jonctions communicantes (gap junctions), reliant directement de cytoplasme à cytoplasme, deux cellules adjacentes [1]. La majorité des cellules cancéreuses présente une diminution du nombre et de la fonctionnalité des gap junctions, par comparaison à leurs homologues saines [2,3] accompagnée d’une plus importante prolifération cellulaire. Le lien présumé entre la perte de la communication intercellulaire et le processus de cancérogenèse, nous permet d’envisager le développement d’une technique spectrale qui discriminerait des populations saines et cancéreuses. L’objectif de cette étude a été de comparer les réponses des lignées cellulaires choisies sur deux instrumentations différentes.
MATERIELS ET METHODES Lignées cellulaires et conditions de culture. Nous avons utilisé des fibroblastes de type CCD1137Sk (ATCC CRL 2703), des FaDu (carcinome de pharynx humain, ATCC HTB 43) et des KB (carcinome épidermoïde de l’oropharynx, ATCC CCL 17). Les fibroblastes utilisés représentent dans ce travail, la lignée positive de référence en terme de communication intercellulaire via les gap junctions [4]. Nous avons préalablement montré que la lignée de fibroblastes exprimait un fort marquage membranaire en connexines (Cx) 43, par opposition à la lignée FaDu qui sera considérée comme notre lignée négative. Une distribution des Cx43 au niveau membranaire et cytoplasmique a été mise en évidence pour les KB. Les lignées ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, Cergy-Pontoise, France), supplémenté à 9% de sérum de veau fœtal inactivé (Costar). Implication des jonctions communicantes. La communication intercellulaire gap jonctionnelle (GJIC) est appréhendée sur des cellules vivantes à l'aide de la technique de gap-FRAP [5] en utilisant une sonde rendue fluorescente après clivage enzymatique intracellulaire. Les cellules ont été préparées 72h avant application de la technique de FRAP. Les différentes lignées ont été marquées au 5,6 carboxyfluoresceine diacetate (5,6 CFDA) (Molecular Probes, Oregon, USA) à 6 µg/mL pendant 15 min à 37°C, puis rincées trois fois avec du RPMI complémenté afin d’éliminer l’excédent de sonde fluorescente non incorporée dans les cellules. Ce produit est hydrolysé par des estérases cytoplasmiques aspécifiques en 5,6 carboxyfluoresceine (5,6 CF). Cette molécule fluorescente de caractère hydrophile et de poids moléculaire 376 Da, diffuse à travers les gap junctions. Instrumentation en microscopie confocale. Le microscope confocal SP2-AOBS Leica (IFR 111) est utilisé comme matériel de référence dans
Laser ARGON CP200 Capteur à fibres optiques Caméra DP50
Plan image
Grossissement ×100 spot laser de 600nm de diamètre Microscope AX 70
échantillon Figure 1 : Microspectrofluorimètre (MSF) à base de fibres optiques.
Les mesures en gap-FRAP, réalisées avec un objectif 10×, proviennent d’une série d’images et de spectres obtenus simultanément ou, uniquement après traitement de la série de spectres. Les mesures avant photoblanchiment sont réalisées toutes les 30 s pendant 120 s. Le photoblanchiment est obtenu
par une irradiation laser argon à 488 nm de 137 µW durant 5 s pour les cellules KB et FaDu et de 832 µW pour les fibroblastes. Les acquisitions du signal de fluorescence après photoblanchiment ont été réalisées toutes les 30 s pendant 750 s. L’intensité de fluorescence mesurée entre 510 et 550 nm est obtenue par excitation de la lampe à vapeur de mercure du microscope entre 460 et 490 nm, à une puissance de 490 µW répartie sur tout l’échantillon. RESULTATS ET CONCLUSION La figure 2 indique l’indice de fraction mobile (R) par lignées cellulaires et selon l’appareil de mesure utilisé (microscopie confocale, MSF traditionnelle) : = intensité de R = (If-I0)/(Id-I0) ; avec If fluorescence finale, I0 = intensité de fluorescence à t0 (temps = 0s) après photoblanchiment et Id = intensité de fluorescence avant photoblanchiment.
fraction mobile(UA)
un premier temps. Il est constitué d’un microscope inversé (LEICA DMIRE2 HC Fluo TCS 1-B), associé à trois sources laser : argon (548, 476, 488 et 514 nm), Hélium-Néon (543 nm) et Hélium Néon (633 nm). La source d’irradiation utilisée provient du laser argon à 488 nm. Les mesures ont été réalisées avec un objectif 63× à immersion d’huile et l’intensité du signal de fluorescence est mesurée dans une bande passante comprise entre 500 et 560 nm. La puissance laser a été mesurée en sortie d’objectif à l’aide d’un puissancemètre (Newport, modèle 2835-C). L’acquisition s'est déroulée en trois étapes et s’est adressée à des sites de traitements et d’observations choisis. Les mesures avant photoblanchiment ont été réalisées toutes les 15 s pendant 150 s. Le photoblanchiment a été provoqué par l’irradiation laser zoomée sur la cellule cible à la puissance de 65 µW durant 45 s. Les acquisitions du signal de fluorescence, avant et après photoblanchiment, ont été réalisées toutes les 15 s durant 900 s à une puissance de 13 µW. Instrumentation en microscopie traditionnelle. Dans un deuxième temps, les mesures de gapFRAP ont été élaborées à l’aide d’un microscope traditionnel droit à épifluorescence (Olympus Provis AX70). Une source laser argon (Spectraphysics, beamlock), une caméra CCD refroidie par effet peltier (Olympus DP50), un spectromètre haute sensibilité, refroidi par azote liquide (Jobin Yvon CP200) et un capteur à fibre optique ont été annexés au microscope (Fig 1). Ce dispositif permet, par l’utilisation du capteur à fibres optiques, de focaliser le faisceau laser au niveau de l’échantillon aux dimensions minimales de 600 nm de diamètre.
confocal
1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00
MSF
FaDu
KB
Fibroblaste
Figure 2 : Comparaison des mesures de gap-FRAP sur les fibroblastes, KB et FaDu en microscopie confocale et traditionnelle.
La comparaison des résultats instrumentaux permet de montrer d’une part, concernant la distinction des lignées par gap-FRAP, des réponses comparables pour les deux instruments et d’autre part, des valeurs de fraction mobile en MSF traditionnelle inférieures à celles obtenues en microscopie confocale mais avec une sensibilité identique. Les résultats comparatifs obtenus avec les 2 microscopes permettent à ce niveau d’étude d’être optimiste quant à l’utilisation du système étudié au laboratoire (MSF) et favorisent la poursuite du développement instrumental pour son utilisation dans la poursuite de la recherche en analyse tissulaire. REFERENCES [1] DA Goodenough. Annu. Rev. Biochem. 1996, 65, 475-502,. [2] XD Ma. World J Gastroenterol. 2003, 9 (5), 946-950,. [3] HB Grossman. Cancer Res. 1994, 54 (11),30623065. [4] HL De Feijter-Rupp. Carcinogenesis 1998, 19 (5), 747-754. [5] MH Wade. Science 1986, 232, 525-528.
