Síntese E Avaliação Biológica De ésteres Derivados Do Borneol

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ALINE TEIXEIRA MACIEL E SILVA SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE ÉSTERES DERIVADOS DO BORNEOL Belo Horizonte 2014 UFMG/ ICEx/ DQ 1005a D 545a ALINE TEIXEIRA MACIEL E SILVA SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE ÉSTERES DERIVADOS DO BORNEOL Dissertação apresentada ao Departamento de Química do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Química – Química Orgânica. Belo Horizonte 2014 . S586s 2014 D Silva, Aline Teixeira Maciel e Síntese e avaliação biológica de ésteres derivados do borneol [manuscrito] / Aline Teixeira Maciel e Silva. 2014. [xii], 146 f. : il. Orientadora: Grácia Divina de Fátima Silva. Coorientadora: Roqueline Rodrigues Silva. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de Química. Inclui bibliografia. 1. Química orgânica - Teses 2. Ésteres – Teses 3. Produtos naturais – Teses 4. Síntese orgânica – Teses I. Silva, Grácia Divina de Fátima, Orientadora II. Silva, Roqueline Rodrigues, Coorientadora III. Título. CDU 043 O trabalho descrito nesta dissertação foi realizado sob orientação da Professora Doutora Grácia Divina de Fátima Silva e coorientação da Professora Doutora Roqueline Rodrigues Silva. O trabalho descrito nesta dissertação foi desenvolvido sob a colaboração da professora Doutora Lucienir Pains Duarte. “...e esta é a vitória que vence o mundo: a nossa fé .” 1 Jo. 5:4 Dedico este trabalho à minha querida avó Maria Margarida Maciel e Silva. Agradecimentos AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por sempre se fazer presente na minha vida, guiando meus passos e me abençoando em todas as minhas escolhas. A Ti, Senhor, toda minha gratidão! Aos meus pais Arlinda e Luiz por todo o amor, apoio e incentivo. Aos meus irmãos Camilla e André pelo carinho e amizade. À minha avó Margarida e minha tia Dé que nunca mediram esforços para que eu pudesse realizar os meus sonhos. Tenho certeza que sem a ajuda de vocês eu jamais teria chegado até aqui. À Professora Drª. Grácia Divina de Fátima Silva pela contribuição com seus conhecimentos e por todos estes anos de convivência tão agradável. À Professora Drª. Roqueline Rodrigues Silva por sua colaboração, sugestões e discussões que contribuíram para meu crescimento científico e pessoal. À Professora Drª. Lucienir Pains Duarte, obrigada por sempre estar disposta a ajudar e pelas contribuições ao longo destes seis anos de convivência. Você é um exemplo de uma profissional dedicada e compromissada com o ensino e com o conhecimento. Serei eternamente grata a você por tudo! Aos Professores Dr. Sidney Augusto Vieira Filho (Bibo) e Dr. Daniel Crístian Ferreira Soares pela amizade e discussões que muito contribuíram para meu crescimento. Aos Professores Dr. Marcelo Henrique dos Santos, Drª. Jacqueline Aparecida Takahashi, Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, Drª. Ana Lúcia Teles Rabello pela realização dos testes biológicos. À minha querida “aluna” Laila, por me ajudar com tanta dedicação e compromisso. Obrigada por tudo! Aos Professores Fernando Carazza (in memoriam) e Adriana Akemi Okuma por terem iniciado o trabalho com o borneol. Agradeço a colaboração do Professor Ângelo de Fátima e a doutoranda Débora pela contribuição para a realização das sínteses no reator de micro-ondas. Agradecimentos Aos examinadores, pela participação na banca de mestrado e por contribuírem para essa dissertação. Aos amigos de laboratório: Grasi, Vinícius, Fernando, Vanessa, Josana, Débora, Fernanda, Larissa, Carol, Dani, Nathany, Jeff, Jailton e Mariana pelo convívio, companheirismo e amizade. À Comunidade Apostólica pelas contínuas orações e pelo carinho que transmitem a mim. À minha amiga Betânia pelo carinho, apoio e por transmitir tanta alegria nos momentos que precisei. Aos amigos do time (Lê, Carol e Bruno), que mesmo distantes torceram por mim! Aos Professores do Departamento de Química da UFMG, pelos conhecimentos transmitidos e aos técnicos pela assistência. Ao Departamento de Química e a Universidade Federal de Minas Gerais, pela oportunidade de realização deste trabalho. À CAPES pelo apoio financeiro. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho, MUITO OBRIGADA! Sumário SUMÁRIO ÍNDICE DE FIGURAS...................................................................................... ÍNDICE DE ESQUEMAS.................................................................................. ÍNDICE DE TABELAS...................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS....................................... RESUMO.......................................................................................................... ABSTRACT...................................................................................................... i x xi xiii xvi xvii INTRODUÇÃO Produtos naturais como fonte de novos fármacos........................................... A classe dos terpenos...................................................................................... Substâncias derivadas dos terpenos................................................................ 01 05 08 OBJETIVOS Objetivos do trabalho........................................................................................ 11 CAPÍTULO 1: SÍNTESE DOS ÉSTERES DO BORNEOL 1.1 Parte Experimental..................................................................................... 1.1.1 Materiais e Métodos................................................................................ 1.1.2 Procedimentos......................................................................................... 1.1.2.1 Obtenção dos ésteres derivados do borneol........................................ 1.1.2.1.a Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando DIC/DMAP (KANE et al., 2004, adaptado)........................................................... 1.1.2.1.b Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando SOCl2 (MIRANDA, 2007).............................................................................. 1.1.2.1.c Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando DIC/DMAP com irradiação por micro-ondas........................................................ 1.1.3 Descrição dos ésteres obtidos................................................................ 1.1.3.1 Hexanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (1)...................... 1.1.3.2 Octanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (2)....................... 1.1.3.3 Decanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (3)...................... 1.1.3.4 Duodecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (4)................ 1.1.3.5 Tetradecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (5).............. 12 12 13 13 13 14 14 16 16 17 18 19 20 Sumário 1.1.3.6 Hexadecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (6).............. 1.1.3.7 Octadecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (7)............... 1.1.3.8 Ácido 4-oxo-4-[(1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila]oxi] butanoico (8)......................................................................................................... 1.1.3.9 Succinato de bis(1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (9).................. 1.1.3.10 4-{Isopropil[isopropilamino)carbonil]amino}-4-oxobutanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (10).......................................... 1.1.3.11 Benzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (11).................... 1.1.3.12 4’-Metoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (12)...... 1.1.3.13 Isopropilcarbamato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (13)..... 1.1.3.14 3’,4’-Dimetoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (14)..................................................................................................... 1.1.3.15 3’,4’,5’-Trimetoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (15)..................................................................................................... 1.1.3.16 3’,5’-Dinitrobenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (16)... 1.1.3.17 3’,5’-Dinitrosalicilato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (17).... 1.1.3.18 Nicotinato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (18).................... 1.1.3.19 4’-Aminobenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (19)....... 1.1.3.20 2’-Acetilbenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (20)........ 1.2 Resultados e Discussão............................................................................. 1.2.1 Síntese dos ésteres................................................................................. 1.2.2 Síntese e caracterização dos ésteres graxos.......................................... 1.2.3 Síntese e caracterização dos ésteres aromáticos................................... 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 40 42 60 CAPÍTULO 2: ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA 2.1 Introdução Geral......................................................................................... 2.2 Atividade Antimicrobiana............................................................................ 2.2.1 Introdução................................................................................................ 2.2.2 Teste antimicrobiano............................................................................... 2.2.2.1 Avaliação da atividade antimicrobiana em ensaio de CIM (Concentração Inibitória Mínima)......................................................... 2.2.2.2 Metodologia.......................................................................................... 2.2.2.3 Resultados e discussão........................................................................ 2.3 Atividade Antiproliferativa........................................................................... 2.3.1 Introdução................................................................................................ 2.3.2 Teste antiproliferativo.............................................................................. 2.3.2.1 Resultados e discussão........................................................................ 2.4 Atividade Anti-inflamatória.......................................................................... 2.4.1 Introdução................................................................................................ 72 73 73 74 75 76 78 80 80 82 83 86 86 Sumário 2.4.2 Teste anti-inflamatório............................................................................. 2.4.2.1 Metodologia.......................................................................................... 2.4.2.1.1 Avaliação da atividade anti-inflamatória: edema de pata induzido por carragenina................................................................................. 2.4.2.2 Resultados e discussão........................................................................ 2.5 Atividade Leishmanicida............................................................................. 2.5.1 Introdução................................................................................................ 2.5.2 Teste leishmanicida................................................................................. 2.5.2.1 Metodologia.......................................................................................... 2.5.2.1.1 Método colorimétrico empregando o reagente MTT......................... 2.5.2.2 Resultados e Discussão....................................................................... 87 87 CONCLUSÃO............................................................................................... 96 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 98 88 88 91 91 92 92 93 94 ANEXO........................................................................................................... 107 Índice de Figuras i ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Obtenção do ácido acetilsalicílico (aspirina). (Foto: Richard Webb)................. 02 Figura 2: Catharanthus roseus (vinca) e estrutura química das substâncias vincristina e vimblastina. (Foto: P. Schönfelder)............................................... 03 Figura 3: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel........................................... 04 Figura 4: Estrutura química do trans-cariofileno e do -humuleno............................ 05 Figura 5: Mecanismo simplificado da biossíntese dos monoterpenos cíclicos borneol e cânfora. As estruturas sombreadas em azul correspondem aos intermediários comuns à biossíntese de todos os monoterpenos cíclicos......................................................................................................... 07 Figura 6: Estrutura do ácido betulínico e do bevirimat............................................... 08 Figura 7: Benzoatos do Borneol sintetizados por Corrêa et al., 2012........................ 09 Figura 8: Salicilato de bornila sintetizado por Vasconcelos et al., 2012..................... 10 Figura 9: Deslocamento de sinal do hidrogênio H2 observado quando ocorre formação do éster....................................................................................... 43 Figura 10: Espectro na região do IV do éster 9 (KBr)................................................. 46 Figura 11: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do composto 9 em CDCl3......................................................................................................... 46 Índice de Figuras ii Figura 12: Estrutura do composto 9........................................................................... 47 Figura 13: Espectro na região do IV do éster 8 (KBr)................................................. 48 Figura 14: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 8 em CDCl3........................ 49 Figura 15: Espectro na região do IV do éster 10 (NaCl)............................................. 51 Figura 16: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 10 em CDCl3...................... 51 Figura 17: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 10 em CDCl3 52 Figura 18: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 10 em CDCl3....................... 53 Figura 19: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 10 em CDCl3.......................... 53 Figura 20: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3......................................................................................................... 54 Figura 21: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3......................................................................................................... 55 Figura 22: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3......................................................................................................... 56 Figura 23: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3......................................................................................................... 57 Figura 24: Mapa de contornos COSY (400 MHz) do composto 10 em CDCl3........... 58 Figura 25: Fragmentos do composto 10..................................................................... 58 Índice de Figuras iii Figura 26: Estrutura proposta para o composto 10.................................................... 59 Figura 27: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 12 em CDCl3. 63 Figura 28: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 13 em CDCl3. 64 Figura 29: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 13 em CDCl3....................... 64 Figura 30: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 13 em CDCl3.......................... 65 Figura 31: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3......................................................................................................... 66 Figura 32: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3......................................................................................................... 67 Figura 33: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3......................................................................................................... 68 Figura 34: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3......................................................................................................... 68 Figura 35: Mapa de contornos COSY (400 MHz) do composto 13 em CDCl3........... 69 Figura 36: Estrutura proposta para o composto 13.................................................... 70 Figura 37: Fotos dos micro-organismos avaliados..................................................... 75 Figura 38: Estimativa de incidência de câncer no Brasil em 2014 por região............ 81 Índice de Figuras iv Figura 39: Medicamento Taxol® (Paclitaxel)............................................................... 81 Figura 40: Efeito do borneol e seus ésteres na proliferação de células tumorais...... 85 Figura 41: Reação de redução do MTT a Formazan.................................................. 93 Figura 42: Espectro na região do IV do éster 1 (ATR)............................................... 108 Figura 43: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 1 em CDCl3........................ 108 Figura 44: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 1 em CDCl3... 109 Figura 45: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 1 em CDCl3......................... 109 Figura 46: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 1 em CDCl3............................ 110 Figura 47: Espectro na região do IV do éster 2 (ATR)............................................... 110 Figura 48: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 2 em CDCl3........................ 111 Figura 49: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 2 em CDCl3......................... 111 Figura 50: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 2 em CDCl3............................ 112 Figura 51: Espectro na região do IV do éster 3.......................................................... 112 Figura 52: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 3 em CDCl3........................ 113 Figura 53: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 3 em CDCl3......................... 113 Figura 54: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 3 em CDCl3............................ 114 Índice de Figuras v Figura 55: Espectro na região do IV do éster 4.......................................................... 114 Figura 56: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 4 em CDCl3........................ 115 Figura 57: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 4 em CDCl3......................... 115 Figura 58: Expansão do subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 4 em CDCl3....... 116 Figura 59: Espectro na região do IV do éster 5 (ATR)............................................... 116 Figura 60: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 5 em CDCl3........................ 117 Figura 61: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 5 em CDCl3... 117 Figura 62: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 5 em CDCl3......................... 118 Figura 63: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 5 em CDCl3............................ 118 Figura 64: Espectro na região do IV do éster 6 (ATR)............................................... 119 Figura 65: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 6 em CDCl3......................... 119 Figura 66: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 6 em CDCl3......................... 120 Figura 67: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 6 em CDCl3............................ 120 Figura 68: Espectro na região do IV do éster 7 (ATR)............................................... 121 Figura 69: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 7 em CDCl3........................ 121 Índice de Figuras vi Figura 70: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 7 em CDCl3.. 122 Figura 71: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 7 em CDCl3........................ 122 Figura 72: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 7 em CDCl3........................... 123 Figura 73: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 8 em CDCl3........................ 123 Figura 74: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 8 em CDCl3........................... 124 Figura 75: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 9 em CDCl3........................ 124 Figura 76: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 9 em CDCl3........................ 125 Figura 77: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 9 em CDCl3........................... 125 Figura 78: Espectro na região do IV do éster 11 (ATR)............................................. 126 Figura 79: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 11 em CDCl3...................... 126 Figura 80: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 11 em CDCl3 127 Figura 81: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 11 em CDCl3...................... 127 Figura 82: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 11 em CDCl3......................... 128 Figura 83: Espectro na região do IV do éster 12 (NaCl)............................................ 128 Figura 84: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 12 em CDCl3...................... 129 Figura 85: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 12 em CDCl3...................... 129 Índice de Figuras vii Figura 86: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 12 em CDCl3......................... 130 Figura 87: Espectro na região do IV do éster 13........................................................ 130 Figura 88: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 13 em CDCl3...................... 131 Figura 89: Espectro na região do IV do éster 14........................................................ 131 Figura 90: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 14 em CDCl3...................... 132 Figura 91: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 14 em CDCl3 132 Figura 92: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 14 em CDCl3...................... 133 Figura 93: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 14 em CDCl3......................... 133 Figura 94: Espectro na região do IV do éster 15 (ATR)............................................. 134 Figura 95: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 15 em CDCl3...................... 134 Figura 96: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 15 em CDCl3...................... 135 Figura 97: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 15 em CDCl3......................... 135 Figura 98: Espectro na região do IV do éster 16 (ATR)............................................. 136 Figura 99: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 16 em CDCl3...................... 136 Figura 100: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 16 em CDCl3........................................................................................................ 137 Índice de Figuras viii Figura 101: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 16 em CDCl3..................... 137 Figura 102: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 16 em CDCl3........................ 138 Figura 103: Espectro na região do IV do éster 17 (KBr)............................................. 138 Figura 104: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 17 em CDCl3.................... 139 Figura 105: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 17 em CDCl3..................... 139 Figura 106: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 17 em CDCl3........................ 140 Figura 107: Espectro na região do IV do éster 18 (NaCl)........................................... 140 Figura 108: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 18 em CDCl3.................... 141 Figura 109: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 18 em CDCl3..................... 141 Figura 110: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 18 em CDCl3........................ 142 Figura 111: Espectro na região do IV do éster 19...................................................... 142 Figura 112: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 19 em CDCl3.................... 143 Figura 113: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 19 em CDCl3..................... 143 Figura 114: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 19 em CDCl3........................ 144 Figura 115: Espectro na região do IV do éster 20...................................................... 144 Índice de Figuras ix Figura 116: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 20 em CDCl3.................... 145 Figura 117: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 20 em CDCl3..................... 145 Figura 118: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 20 em CDCl3........................ 146 Índice de Esquemas x ÍNDICE DE ESQUEMAS Esquema 1: Mecanismo da reação de esterificação de Steglich…………………… 37 Esquema 2: Rearranjo 1,3 do intermediário O-acil-isouréia...................................... 37 Esquema 3: Reação com participação do DMAP....................................................... 38 Esquema 4: Mecanismo da reação com SOCl2......................................................... 39 Esquema 5: Ácidos utilizados na esterificação do borneol......................................... 40 Esquema 6: Reação de obtenção do derivado do ácido p-metoxibenzoico………… 62 Esquema 7: Proposta de mecanismo para formação do composto 13...................... 70 Índice de Tabelas xi ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1: Rendimento e tempo de reação nas diferentes metodologias para obtenção dos ésteres do borneol…………………………………………….. Tabela 2: Dados de RMN e de IV dos ésteres 1 – 10................................................ 41 44 Tabela 3: Condições de reação usada na tentativa de obtenção do éster derivado do ácido succínico...................................................................................... 45 Tabela 4: Dados de RMN 1D e 2D (400 MHz, CDCl3) do composto 10 e comparação com dados de RMN 13C do borneol....................................... 59 Tabela 5: Dados de RMN e de IV dos ésteres 11 – 20.............................................. 61 Tabela 6: Condições de reação usada na tentativa de obtenção do éster derivado do ácido p-metoxibenzoico……………………………………………………. 62 Tabela 7: Dados de RMN 1D e 2D (400 MHz, CDCl3) do composto 13 e comparação com dados de RMN 13C do borneol....................................... 71 Tabela 8: Amostras utilizadas no teste antimicrobiano.............................................. 77 Tabela 9: Avaliação biológica do borneol e seus ésteres........................................... 79 Tabela 10: Valores de concentração (GI50 em μg/mL) necessários para inibir a proliferação de células em 50%................................................................. 84 Tabela 11: Média, erro padrão da média e percentual de inibição do edema de pata em relação ao controle negativo (P<0,05)........................................ 89 Índice de Tabelas xii Tabela 12: Atividade biológica do borneol e seus ésteres testados em dose única 20 g mL-1................................................................................................... 95 Abreviaturas, siglas e símbolos xiii ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS  – Deslocamento químico ºC – Graus Celsius 1D – Uma dimensão 2D – Duas dimensões 786-0 – Linhagem de células de carcinoma de rim AINEs – Anti-inflamatórios não esteroides ATCC – American Type Culture Collection ATR – Attenuated Total Reflection (Reflectância Total Atenuada) BHI – Broth Heart Infusion CC – Cromatografia em Coluna CCD – Cromatografia em Camada Delgada CDTN/CNEN – Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear / Comissão Nacional de Energia Nuclear CI50 – Concentração da substância em teste que inibe 50% do crescimento celular CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas COSY – “Correlation Spectroscopy” d – Dupleto ddd – Duplo dupleto duplo DEPT135 – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 135 DIC – Di-isopropilcarbodi-imida DIU – N’,N’-Di-isopropiluréia DMAP – 4-Dimetilaminopiridina Abreviaturas, siglas e símbolos xiv DOX – Doxorrubicina DQ – Departamento de Química Fiocruz – Fundação Oswaldo Cruz HaCaT – Célula humana normal de queratinócitos hept – Hepteto HIV – Human immunodeficiency virus HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectroscopy HSQC – Heteronuclear Single Quantum Coherence Spectroscopy HRMS-ESI – High Resolution Mass Spectra using Electrospray Ionization HT-29 – Linhagem de células de carcinoma de cólon humano IC50 – Concentração da substância em teste que inibe 50% do crescimento celular IMO – Irradiação de Micro-ondas IV – Infravermelho J – Constante de acoplamento K562 – Linhagem de células de tumor de medula óssea LAREMAR – Laboratório de Ressonância Magnética de Alta Resolução m – Multipleto MCF-7 – Linhagem de células de tumor de mama MIC – Mínima Concentração Inibitória MO – Micro-ondas NCI-ADR/RES – Linhagem de células de tumor de ovário resistente a múltiplos fármacos NEPLAM – Núcleo de Estudo de Plantas Medicinais NO – Óxido Nítrico Abreviaturas, siglas e símbolos oct – Octeto OMS – Organização Mundial da Saúde OVCAR-3 – Linhagem de células de tumor de ovário humano ppm – Partes por milhão Rf – Fator de retenção RMN – Ressonância Magnética Nuclear RMN de 13C – Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13 RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio s – Simpleto sl – Sinal largo SNC – Sistema Nervoso Central t – Tripleto td – Tripleto duplo TMS – Tetrametilsilano UFC – Unidades Formadoras de Colônias UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais UNIFAL – Universidade Federal de Alfenas Unicamp – Universidade Estadual de Campinas xv Resumo xvi RESUMO Os terpenos e seus derivados representam compostos de grande interesse para os pesquisadores em função do grande potencial como fonte de novos fármacos. Neste trabalho foram sintetizados ésteres a partir do terpeno borneol utilizando duas metodologias (DIC/DMAP e SOCl2). Também foi avaliada a irradiação de microondas, para obter estes compostos, em ausência de solvente. Foram sintetizados 20 ésteres do borneol, dentre eles 18 não estão descritos na literatura. Algumas das reações conduzidas sob irradiação com micro-ondas e na ausência de solvente levaram a produtos de rearranjo. Os ésteres do borneol tiveram suas estruturas elucidadas através de métodos espectrométricos e espectroscópicos. O meio reacional no qual se utilizou DIC/DMAP e irradiação de micro-ondas, em menor tempo proporcionou os melhores rendimentos. Os compostos sintetizados foram submetidos a testes de avaliação de sua atividade como antimicrobiano, leishmanicida, antiproliferação celular e anti- inflamatório. Os melhores resultados no teste antimicrobiano foram encontrados para 4’-metoxibenzoato de bornila, 3’,4’-dimetoxibenzoato de bornila e 3’,4’,5’- trimetoxibenzoato de bornila. Não foi observado nenhum efeito leishmanicida significativo produzido pelos ésteres do borneol submetidos ao teste. Em relação à atividade antiproliferativa, os compostos octanoato de bornila, benzoato de bornila e 3’,4’,5’-trimetoxibenzoato de bornila apresentaram resultados mais promissores, com efeitos citotóxicos para as linhagens de células de câncer de ovário (OVCAR-3), ovárioresistente (NCI-ADR/RES), mama (MCF-7), medula óssea (K562) e rim (786-0). No teste de atividade anti-inflamatória, o hexanoato de bornila, octanoato de bornila, tetradecanoato de bornila, hexadecanoato de bornila, octadecanoato de bornila, benzoato de bornila, 3’,5’-dinitrobenzoato de bornila e nicotinato de bornila foram aqueles que proporcionaram melhor redução do edema induzido por carragenina. Abstract xvii ABSTRACT The terpenes and its derivatives represent compounds of great interest to researchers because of the great potential as a source of new drugs. In this work, esters from the terpene borneol were synthesized using two methodologies (DIC/DMAP and SOCl2). It was also evaluated the microwave irradiation to obtain these compounds, without the use of solvent. It was synthesized 20 borneol esters, among them 18 are not described in the literature. Some of the reactions conducted under microwave irradiation and in the absence of solvent, led to products of rearrangement. The borneol esters had their structures elucidated through spectroscopic and spectrometric methods. The reaction condition in which were used DIC/DMAP and microwave irradiation, in less time produced better yields. The synthesized compounds were subjected to assays to evaluate its activity as antimicrobial, leishmanicidal, cellular antiproliferation and anti-inflammatory. The best results on the antimicrobial assays were found for bornyl 4’-methoxybenzoate, bornyl 3’,4’-dimethoxybenzoate and bornyl 3’,4’,5’-trimethoxybenzoate. It was not observed significative leishmanicidal effect produced by the borneol esters subjected to assay. In relation to the antiproliferative cells assays, bornyl octanoate, bornyl benzoate and bornyl 3’,4’,5’-trimethoxybenzoate showed more promising results, with cytotoxic effects to cell lines of ovarian cancer (OVCAR-3), ovarian-resistant (NCI-ADR/RES), breast (MCF-7), bone marrow (K562) and kidney (786-0). In the anti-inflammatory assays, the bornyl hexanoate, bornyl octanoate, bornyl tetradecanoate, bornyl hexadecanoate, bornyl octadecanoate, bornyl benzoate, bornyl 3’,5’-dinitrobenzoate and bornyl nicotinate were those that provided better reduction in the edema induced by carrageenin. Introdução 1 INTRODUÇÃO Produtos naturais como fonte de novos fármacos Ao longo dos tempos os seres humanos têm contado com a natureza para atender as suas necessidades básicas. As plantas, em particular, formam a base de diversos sistemas tradicionais de medicina, com os primeiros registros que datam de cerca de 2600 a.C., que documentam o uso de aproximadamente 1000 substâncias derivadas de plantas, na Mesopotâmia. Os gregos e os romanos contribuíram substancialmente para o uso e desenvolvimento racional de drogas a partir de plantas. Dioscórides, um médico grego (40-90 d.C.), registrou com precisão a coleta, o armazenamento e o uso de ervas medicinais durante suas viagens com exércitos romanos (CRAGG E NEWMAN, 2013). A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de 80% da população em alguns países asiáticos e africanos dependem da medicina tradicional para cuidados de saúde primários. Os tratamentos à base de plantas são a forma mais popular da medicina tradicional e são altamente lucrativos no mercado internacional. O mercado global de produtos à base de plantas deve chegar a R$ 10 trilhões em 2050 (KHAZIR et al., 2014; CHAUDHARY E SINGH, 2011). Em 1804, Friedrich Sertürner foi o primeiro a isolar o alcaloide morfina da papoula (Papaver somniferum), fato que marcou uma busca constante por outros medicamentos a partir de plantas. Em 1824, Pierre-Jean Robiquet isolou a codeína (antitussígeno) também da papoula. Porém, o marco histórico no processo de desenvolvimento da indústria farmacêutica mundial foi a descoberta da salicina por Raffaele Piria em 1829 a partir da planta Salix alba. A primeira modificação estrutural realizada foi a partir da salicilina, que levou à obtenção do ácido salicílico em 1839. A partir do ácido salicílico, Felix Hoffman sintetizou a aspirina (ácido acetilsalicílico) em 1897 (Figura 1, pág 2). Nasceu então a famosa e poderosa indústria farmacêutica da Alemanha e também a primeira patente que se tem conhecimento na área de medicamento (CALIXTO E SIQUEIRA JR, 2008). Introdução 2 OH O HO O HO OH OH Salicilina 1829 O OH OH O OH O Salix alba Ácido Salicílico 1839 Ácido acetilsalicílico 1897 Figura 1: Obtenção do ácido acetilsalicílico (aspirina). (Foto: Richard Webb). Fonte: http://www.forestryimages.org. Acesso em: 02/01/2012. A descoberta de várias substâncias utilizadas no tratamento do câncer está ligada ao uso de plantas na medicina tradicional. Os primeiros agentes derivados de plantas que avançaram para o uso clínico no tratamento do câncer foram os alcaloides vinblastina e vincristina, isolados da planta Catharanthus roseus (vinca) (CRAGG et al., 2009) (Figura 2, pág. 3). A planta inicialmente foi investigada por ser utilizada pela população de Madagascar como hipoglicemiante. Porém, foi observado durante os estudos da vinca que seus extratos levavam a granulocitopenia, em consequência da supressão da medula óssea dos animais. A confirmação da atividade em modelos experimentais de leucemia e linfoma levou ao isolamento dos alcaloides que, atualmente, são de grande utilidade no tratamento de linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e testículos e leucemia linfoblástica aguda infantil (BRANDÃO et al., 2010). O Introdução 3 N OH N O N H O H O OH O O Vincristina; R=CH3 N H O R O Vimblastina; R=CHO Figura 2: Catharanthus roseus (vinca) e estrutura química das substâncias vincristina e vimblastina. (Foto: P. Schönfelder). Fonte: http://www.biologie.uni-regensburg.de/Botanik/Schoenfelder/ Acesso em: 03/01/2014. O paclitaxel (Figura 3, pág. 4), um terpeno extraído a partir da casca de Taxus brevifolia (Taxaceae), também confirma o sucesso de produtos naturais na descoberta de novas drogas. O paclitaxel foi isolado pela primeira vez em 1971, por Wall e colaboradores, nos Estados Unidos. Nenhum agente anticancerígeno natural teve um impacto tão grande sobre o tratamento do câncer como o paclitaxel (KHAZIR et al., 2014). O paclitaxel foi o primeiro composto descoberto capaz de inibir a divisão celular pela despolimerização dos microtúbulos, um mecanismo de ação até então desconhecido. Ele é comercializado pela companhia americana Bristol-Meyer Squibb com o nome de Taxol® e atualmente está disponível como medicamento em mais de 60 países (SOUZA, 2004). O paclitaxel tem sido utilizado no tratamento do câncer, principalmente o de ovário e mama (KHAZIR et al., 2014). Diversos derivados semi-sintéticos têm sido desenvolvidos a partir do paclitaxel. O primeiro aprovado para utilização clinica foi o docetaxel (Figura 3, pág. 4), que demonstrou atividade significativa em diversos tipos de tumores, e um padrão de toxicidade diferente do seu composto de origem. No entanto, os dois compostos Introdução 4 aprovados possuem certas limitações, que os cientistas ainda estão tentando superar através da síntese de outros análogos. Modificações nas estruturas destes compostos têm sido feitas com o objetivo de se descobrir novos agentes com maior citotoxicidade em tumores resistentes, baixa toxicidade e maior solubilidade (KHAZIR et al., 2014). . O O O O OH O O N H O OH O H OH C6H5 O O Paclitaxel HO O O O OH O O O N H H O OH OH O O C6H5 O O Docetaxel Figura 3: Estrutura química do paclitaxel e do docetaxel. Cragg e Newman analisaram as fontes de novos medicamentos ao longo do período de 01/1981 a 12/2010. Eles observaram que 69% dos anti-infecciosos (compostos que englobam os agentes antibacterianos, antifúngicos, antiparasitários e antivirais) são derivados de produtos naturais ou são compostos inspirados em produtos naturais. Já na área do tratamento do câncer, esse número é ainda maior, correspondendo a 75% dos medicamentos (CRAGG E NEWMAN, 2013). Um exemplo nacional de medicamento desenvolvido a partir de estudos com plantas é o Acheflan®, um anti-inflamatório tópico totalmente desenvolvido no Brasil. O laboratório Aché, uma das maiores indústrias farmacêuticas da América do Sul, após Introdução 5 vários anos de pesquisas, lançou em 2005 este produto. A descoberta foi feita a partir da planta conhecida como “erva baleeira” (Cordia verbenacea). Do óleo essencial desta planta foram isolados dois compostos ativos, responsáveis pela ação anti-inflamatória relatada, o -humuleno e o trans-cariofileno (Figura 4) (PASSOS et al., 2007; FERNANDES et al., 2007; QUEIROZ et al., 2009). Fica claro a partir desse exemplo como a biodiversidade pode auxiliar a indústria de países emergentes na descoberta de novos compostos para o tratamento de diversas doenças existentes. trans-cariofileno -humuleno Figura 4: Estrutura química do trans-cariofileno e do -humuleno. Além de serem fonte de novas drogas, os produtos naturais têm inspirado o desenvolvimento da química orgânica sintética, levando a avanços em metodologias de síntese e possibilitando a criação de análogos do composto original com propriedades farmacológicas melhoradas (HARVEY, 2008). A classe dos terpenos Com base na sua estrutura e na origem biossintética, os produtos vegetais podem ser classificados em diferentes grupos, tais como os terpenos, alcaloides e compostos fenólicos (CROTEAU et al., 2000). Os terpenos estão entre a classe mais estruturalmente variada dos produtos vegetais. Todos os terpenos são derivados da fusão repetitiva de uma unidade de isopreno (C5H8) e o número de unidades determina a sua classificação (MOSES, et al., 2013). Os terpenos com 10 unidades de carbono (C10) são chamados de monoterpenos e foram os primeiros compostos a serem isolados a partir da terebintina Introdução 6 (resina líquida obtida de coníferas) na década de 1850. Os monoterpenos são conhecidos como componentes voláteis das essências das flores e dos óleos essenciais de ervas e especiarias. Em geral, são isolados por processo de destilação ou extração e encontra uso industrial considerável em indústria de flavorizantes e perfumes (CROTEAU et al., 2000). A síntese de todos os monoterpenos passa por um mecanismo comum, iniciado pela formação de um cátion geranila (Figura 5, pág. 7). Este intermediário sofre isomerização, ciclizações até a reação final, que geralmente é finalizada através da perda de um próton ou a adição de um nucleófilo (DEGENHARDT et al., 2009). Os monoterpenos borneol e cânfora são formados através do intermediário difosfato de bornila (CROTEAU E KARP, 1977). Neste processo, uma enzima terpeno sintase catalisa a formação do difosfato de bornila a partir do cátion de bornila. O produto é então hidrolisado ou oxidado, levando à formação de borneol ou cânfora, respectivamente (Figura 5, pág. 7) (CROTEAU E KARP, 1979). O borneol é um monoterpeno bicíclico presente no óleo essencial de numerosas plantas medicinais das famílias Dipterocarpaceae (Dipterocarpus turbinatus tree), Lamiaceae (Rosmarinus officinalis e Salvia officinalis), Valerianaceae (Valeriana officinalis) e Asteraceae (Matricaria chamomilla) (HORVÁTHOVÁ et al., 2009). Na medicina popular chinesa, o borneol é empregado para diversos fins, como por exemplo, tratamento da dor de garganta, aftas, feridas, queimaduras e infecções da pele (LIU et al., 2011). Ele também tem sido frequentemente encontrado em muitos medicamentos populares para o tratamento de doenças do Sistema Nervoso Central (SNC), tais como a doença de Alzheimer e Acidente Vascular Cerebral (YU et al., 2013). Muitos estudos mostram que o borneol possui ação analgésica, anti-inflamatória, antioxidante, antibacteriana e cicatrizante (CANDAN et al., 2003; HORVÁTHOVÁ et al., 2009; LIU et al., 2011; BARRETO, 2013). Além disso, diversas publicações têm mostrado que o borneol aumenta a penetração de drogas através da pele e da córnea (CUI et al., 2011; QI et al., 2013, JINGJING et al., 2012) e acelera a abertura da barreira hemato-encefálica, aumentando a distribuição de drogas no tecido cerebral (YU et al., 2013). Introdução 7 10 OPP OPP 1 3 4 OPP 2 isomerização 5 6 OPP 7 8 9 difosfato de geranila difosfato de trans-linalina cátion geranila difosfato de cis-linalina OPP OPP fechamento 3,7 OPP difosfato de bornila cátion bornila cátion -terpinila O H2O fechamento 6,1 cátion linalina O OH borneol cânfora Figura 5: Mecanismo simplificado da biossíntese dos monoterpenos cíclicos borneol e cânfora. As estruturas sombreadas em azul correspondem aos intermediários comuns à biossíntese de todos os monoterpenos cíclicos. Introdução 8 Substâncias derivadas dos terpenos Devido às diversas atividades atribuídas aos terpenos, muitos estudos vêm sendo conduzidos no sentido de se obter derivados destes compostos e testá-los frente a diversos alvos biológicos (BORGATI, 2013; CORRÊA et al., 2012). Um dos exemplos de grande êxito na obtenção de derivados de terpenos é o antiviral bevirimat, um análogo do triterpeno pentacíclico ácido betulínico (Figura 6). O bevirimat é o primeiro composto de uma nova classe de terapia antirretroviral, conhecido como inibidores de maturação do vírus HIV (SMITH, et al,. 2007). Kashiwada e colaboradores (1996) isolaram o ácido betulínico de Syzigium claviflorum e observaram a moderada atividade anti-HIV do composto. Porém, quando foi realizada a modificação na cadeia lateral do ácido, com a adição de um grupo na posição 3, a atividade do novo composto mostrou ser 1000 vezes maior que do acido betulínico (KASHIWADA, et al., 1996). Devido à necessidade cada vez maior de novos agentes antirretrovirais com novos mecanismos de ação, a fim de prevenir a resistência do vírus HIV e fornecer terapias alternativas para aqueles pacientes que não conseguem ou não toleram os medicamentos existentes no mercado, o bevirimat mostra-se como uma esperança, já que apresenta um mecanismo de ação novo, diferente de todas as drogas utilizadas para tratamento do HIV. H H OH OH O O O HO HO O O Ácido betulínico Bevirimat Figura 6: Estrutura do acido betulínico e do bevirimat. Introdução 9 Corrêa e colaboradores relataram a síntese de dois benzoatos do borneol (Compostos 1 e 2, Figura 7) e estes apresentaram considerável atividade in vitro contra as formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi. O composto 1, quando testado com concentração igual 100 µg/mL, inibiu mais de 98% do crescimento do parasita após 72h de incubação. Na mesma concentração, o composto 2 inibiu completamente a proliferação do parasita. O IC50/72h encontrado para 1 e 2 foram 10,1 e 12,8 µg/mL, respectivamente. O IC50/72h do benzonidazol (padrão utilizado) para T. cruzi foi de 2,5 µg/mL (CORRÊA et al., 2012). 8 9 7 1 O 2 O 4 14 R1 11 1: R1 = R2 = R3 = OCH3 2: R1 = R2 = R3 = H 16 R2 R3 Figura 7: Benzoatos do Borneol sintetizados por Corrêa et al., 2012. Vasconcelos e colaboradores também estudaram a atividade biológica de um derivado do borneol. No estudo realizado, o éster salicilato de bornila (Figura 8, pág. 10) foi sintetizado e avaliado frente às atividades de toxicidade e anti-inflamatória (VASCONCELOS et al., 2012). Como resultado do teste realizado, os pesquisadores observaram que não houve sinal de toxicidade aguda do éster nos animais estudados. Além disso, o derivado do borneol apresentou boa atividade anti-inflamatória, relacionada possivelmente com a diminuição de mediadores como prostaglandina E2 (PGE2), óxido nítrico (NO) e citocinas pró-inflamatórias. Introdução 10 O OH O Figura 8: Salicilato de bornila sintetizado por Vasconcelos et al., 2012. Devido às diversas atividades já atribuídas ao borneol e o fato de existirem poucos estudos com derivados deste monoterpeno, propõe-se sintetizar derivados desta molécula e avaliar a atividade farmacológica dos mesmos. Objetivos 11 OBJETIVOS DO TRABALHO  Sintetizar e caracterizar os ésteres derivados do borneol utilizando duas metodologias diferentes;  Avaliar o rendimento e eficácia das metodologias utilizadas;  Avaliar in vitro a atividade leishmanicida, antimicrobiana e antiproliferativa dos compostos sintetizados;  Avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo dos ésteres sintetizados. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 12 1 SÍNTESE DOS ÉSTERES DO BORNEOL 1.1 Parte Experimental 1.1.1 Materiais e métodos Nesse trabalho, a purificação dos produtos obtidos da síntese foi realizada por cromatografia em coluna (CC), utilizando sílica gel 60 (0,063-0,2mm, Macherey-Nagel) como fase estacionária. Os solventes empregados como fase móvel foram hexano, clorofórmio e acetato de etila (puros ou combinados e em ordem crescente de polaridade). Para acompanhamento das reações foram executadas análises de cromatografia em camada delgada (CCD). Na preparação das cromatoplacas utilizouse como fase estacionária sílica gel 60G (0,045mm, Merck) na espessura de aproximadamente 0,25 mm; como fase móvel utilizaram-se os solventes hexano, clorofórmio e acetato de etila (puros ou combinados). Como reveladores usou-se vanilina perclórica (solução de vanilina etanólica a 1% (p/v) e ácido perclórico a 3% (v/v), misturados na proporção de 1:1), seguido por aquecimento em estufa a 130 ºC. As temperaturas de fusão não corrigidas foram determinadas em aparelho Microquímica MQAPF-302. Espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos utilizando o espectrômetro modelo Spectrum One Perkin Elmer do Laboratório de Química Farmacêutica da Faculdade de Farmácia da UFMG. Este possui dispositivo ATR, permitindo que o espectro seja obtido diretamente da amostra sólida ou oleosa, sem a necessidade do uso de pastilha. Também foi utilizado o espectrômetro Shimadzu IR408 do Departamento de Química, UFMG, neste caso utiliza-se pastilhas de KBr [1% (m/m)] ou janela de NaCl e o espectrômetro Nicolet, modelo Nexus 470 da Thermo Scientific do Laboratório de Química de Nanoestruturas de Carbono do CDTN/CNEN. O equipamento está acoplado a um microscópio Nicolet Centaurus com uma ampliação de 10 vezes, com amostra aplicada diretamente em janela de silício. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 13 Os espectros de RMN de 1D e 2D foram obtidos em espectrômetros Bruker Avance DPX-200 e DRX-400 do Laboratório de Ressonância Magnética de Alta Resolução (LAREMAR) do Departamento de Química, UFMG. Os solventes deuterados utilizados encontram-se indicados em cada caso. Os deslocamentos químicos () foram registrados em ppm usando tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência interna e as constantes de acoplamento (J) dadas em Hz. Os espectros de massas de alta resolução foram obtidos em Espectrômetro de Massas com Fonte de Ionização Electrospray (ESI-MS) modelo SHIMADZU LC-ITTOF (Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais-UFMG). A numeração utilizada na nomenclatura dos compostos segue a regra da IUPAC, porém a utilizada nas estruturas químicas não segue a regra da IUPAC. As estruturas foram numeradas de modo a auxiliar na atribuição e no detalhamento dos dados espectroscópicos. Os ácidos empregados para a síntese dos ésteres foram aqueles disponíveis no laboratório (Esquema 5, pág. 40). 1.1.2 Procedimentos 1.1.2.1 Obtenção dos ésteres derivados do borneol 1.1.2.1.a Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando DIC/DMAP (KANE et al., 2004, adaptado) Foram solubilizados, sob agitação magnética, em um balão de fundo redondo acoplado a um tubo contendo cloreto de cálcio, 3 mmol do ácido, 1 mmol de borneol e uma quantidade catalítica de DMAP (0,25 – 0,33 mmol) em diclorometano, (exceto para o ácido succínico (Tabela 3, pág. 45), onde as concentrações foram alteradas). Após 10 minutos foram adicionados a esta mistura, sob banho de gelo, 3 mmol de DIC. A mistura foi mantida sob agitação magnética, à temperatura ambiente, e o desenvolvimento da reação foi seguido por CCD. Após o fim da reação evaporou-se o Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 14 solvente da mistura em evaporador rotatório. Os produtos obtidos foram purificados por cromatografia em coluna. 1.1.2.1.b Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando SOCl2 (MIRANDA, 2007) Foram adicionados, sob agitação magnética, em um balão bitubulado, 2 mL (27,5 mmol) de SOCl2 e 3 mmol do ácido. O balão foi acoplado a um condensador de bolas com terminação ligada a um tubo com cloreto de cálcio. A mistura foi mantida sob agitação magnética e refluxo durante 3 horas. Após o fim da reação, o excesso de SOCl2 foi removido com o auxílio de uma bomba de vácuo, acoplada a 2 tubos imersos em nitrogênio líquido. Após remoção total do SOCl2, adicionaram-se 1 mmol de borneol ao balão e 2 mL de tolueno. A mistura foi mantida sob agitação magnética e refluxo e o desenvolvimento da reação foi seguido por CCD. Após o fim da reação adicioram-se lentamente, 5 mL de solução aquosa de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 5% (p/v) ao balão. A mistura reacional foi levada para o funil de separação e foi lavada três vezes com clorofórmio (3 x 25 mL). Em seguida, a fase orgânica foi lavada com 20 mL de água destilada, posteriormente com 30 mL de solução de bicarbonato de sódio 5% (p/v) e por fim com 20 mL de água destilada. Esta fase foi colocada em contato com sulfato de sódio anidro, filtrada e, finalmente, o solvente foi destilado em evaporador rotatório. O material obtido foi purificado por cromatografia em coluna (CC), conduzindo ao éster de interesse. 1.1.2.1.c Obtenção dos ésteres derivados do borneol utilizando DIC/DMAP com irradiação por micro-ondas Adicionaram-se em um balão de fundo redondo 3 mmol do ácido, 1 mmol de borneol e uma quantidade catalítica de DMAP (0,25 – 0,33 mmol) na ausência de solvente. A mistura foi mantida sob banho de gelo e, em seguida, foram adicionados 3 mmol de DIC. A mistura reacional foi submetida à irradiação de micro-ondas (IMO) em um reator DISCOVER CEM®. As condições empregadas foram: temperatura de 25, 70, Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 15 130 ou 170 ºC (indicada em cada caso), potência de 250 watts, tempo de rampa: 2 minutos, tempo de irradiação de micro-ondas: 3 ou 5 minutos, em agitação máxima e tubo aberto. Após o término da IMO o bruto da reação foi purificado por cromatografia em coluna. Na Tabela 1 (pág. 41) encontram-se os rendimentos, as condições e o tempo de reação para cada produto obtido. Apenas os produtos 11 (benzoato de bornila, pág. 26) e 15 (3,4’,5’trimetoxibenzoato de bornila, pág. 30) estão descritos, os demais são inéditos na literatura. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 16 1.1.3 Descrição dos ésteres obtidos 1.1.3.1 Hexanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (1) 8 9 7 10 O 6 2 1 O 4 11 13 15 Fórmula Molecular: C16H28O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 2h T. a. DIC/DMAP 1 3 62 103 2 Tolueno 26 h Refluxo SOCl2 1 3 36 91 3 - 3 min 25 °C 1 3 51 85 4 - 3 min 70 °C 1 3 76 126 5 - 5 min 70 °C 1 3 61 102 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 1160, 1175, 1454, 1782, 2873, 2954. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,4, J3 = 10, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,011,87 (m, 1H) 1,78-1,56 (m, 4H), 1,35-1,16 (m, 6H), 0,99 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,93-0,91 (6H, H9 e H16), 0,87 (s, 3H, H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,1 (C11), 79,6 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 13 45,1 (C4), 36,9 (C3), 34,7 (C12), 31,4 (C13), 28,1 (C5), 27,2 (C14), 24,9 (C6), 22,3 (C15), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,9 (C16), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 275,1987; encontrado: 275,1922; erro: 23,6 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 17 1.1.3.2 Octanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (2) 8 9 7 10 O 6 2 1 O 4 11 13 15 17 Fórmula Molecular: C18H32O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 1h T. a. DIC/DMAP 1 3 79 144 2 Tolueno 29 h Refluxo SOCl2 1 3 44 125 3 - 3 min 25 °C 1 3 83 153 4 - 3 min 70 °C 1 3 87 160 5 - 5 min 70 °C 1 3 93 175 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 1160, 1175, 1732, 2873, 2933, 2954. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (m, 1H, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,01-1,87 (m, 1H) 1,76-1,60 (m, 4H), 1,29 (sl, 10H, H13 ao H17), 0,98 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,91-0,87 (9H, H18, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,2 (C11), 79,6 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 13 44,9 (C4), 36,9 (C3), 34,7 (C12), 31,7 (C13), 29,1 (C14), 29,0 (C15), 28,1 (C5), 27,1 (C16), 25,2 (C6), 22,6 (C17), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 14,1 (C18), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 303,2300; encontrado: 303,2387; erro: 28,7 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 18 1.1.3.3 Decanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (3) 8 9 7 10 O 6 2 1 11 O 4 13 15 17 19 Fórmula Molecular: C20H36O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 3h T. a. DIC/DMAP 1 3 85 171 2 Tolueno 17 h Refluxo SOCl2 1 3 34 80 3 - 3 min 70 °C 1 3 92 186 4 - 5 min 70 °C 1 3 95 194 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (KBr, cm-1): 1160, 1178, 1456, 1736, 2856, 2926, 2956. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3,4, J3 = 10, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,011,87 (m, 1H) 1,76-1,59 (m, 4H), 1,27 (sl, 14H, H13 ao H19), 0,98 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,91-0,87 (9H, H20, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,2 (C11), 79,6 (C2), 48,7 (C7), 47,8 (C1), 13 44,9 (C4), 36,9 (C3), 34,7 (C12), 31,9 (C13), 29,5 (C14), 29,3 (C15), 29,3 (C16), 29,2 (C17), 28,1 (C5), 27,1 (C18), 25,2 (C6), 22,7 (C19), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 14,1 (C20), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 331,2613; encontrado: 331,2563; erro: 15,1 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 19 1.1.3.4 Dodecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (4) 8 9 7 10 O 6 1 2 11 O 4 13 15 17 21 19 Fórmula Molecular: C22H40O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 14 h T. a. DIC/DMAP 1 3 72 157 2 Tolueno 19 h Refluxo SOCl2 1 3 43 95 3 - 3 min 70 °C 1 3 82 82 4 - 5 min 70 °C 1 3 76 171 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (Si, cm-1): 1025, 1160, 1180, 1736, 2854, 2925. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,4, J3 = 10, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,011,87 (m, 1H) 1,78-1,59 (m, 4H), 1,26 (sl, 18H, H13 ao H21), 0,99 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,91-0,87 (9H, H22, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3):C (ppm): 174,0 (C11), 79,6 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 45,0 (C4), 36,9 (C3), 34,7 (C12), 31,9 (C13), 29,6 (CH2), 29,5 (CH2), 29,3 (CH2), 29,2 (CH2), 28,1 (C5), 27,2 (CH2), 25,2 (C6), 22,6 (CH2), 19,7 (C9), 18,8 (C8), 14,0 (C22), 13,4 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 359,2926; encontrado: 359,2956; erro: 8,3 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 20 1.1.3.5 Tetradecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (5) 8 9 7 10 O 6 1 2 O 4 13 11 15 17 21 19 23 Fórmula Molecular: C24H44O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 2h T. a. DIC/DMAP 1 3 82 194 2 Tolueno 24 h Refluxo SOCl2 1 3 17 62 3 - 3 min 70 °C 1 3 89 213 4 - 5 min 70 °C 1 3 87 213 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 721, 1024, 1159, 1177, 1247, 1734, 2853, 2923, 2953. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (m, 1H, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,01-1,87 (m, 1H) 1,69-1,61 (m, 4H), 1,26 (sl, 22H, H13 ao H23), 0,98 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,91-0,87 (9H, H24, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,1 (C11), 79,6 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 13 45,1 (C4), 36,9 (C3), 34,8 (C12), 32,0 (C13), 29,7 (CH2), 29,5 (CH2), 29,4 (CH2), 29,2 (CH2), 28,1 (C5), 27,2 (CH2), 25,2 (C6), 22,7 (CH2), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 14,1 (C24), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 387,3239; encontrado: 387,3294; erro: 14,5 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 21 1.1.3.6 Hexadecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (6) 8 9 7 10 O 6 2 1 11 O 4 13 15 17 19 21 23 25 Fórmula Molecular: C26H48O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 1h T. a. DIC/DMAP 1 3 73 186 2 Tolueno 47 h Refluxo SOCl2 1 3 36 140 3 - 3 min 70 °C 1 3 77 196 4 - 5 min 70 °C 1 3 82 212 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 721, 1024, 1159, 1177, 1734, 2853, 2922. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3, J3 = 10, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,00-1,87 (m, 1H) 1,69-1,60 (m, 4H), 1,26 (sl, 26H, H13 ao H25), 0,98 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,900,87 (9H, H26, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,2 (C11), 79,6 (C2), 48,7 (C7), 47,8 (C1), 13 44,9 (C4), 36,9 (C3), 34,7 (C12), 31,9 (C13), 29,7 (CH2), 29,6 (CH2), 29,5 (CH2), 29,4 (CH2), 29,3 (CH2), 29,2 (CH2), 28,1 (C5), 27,1 (CH2), 25,2 (C6), 22,7 (CH2), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 14,1 (C26), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 415,3552; encontrado: 415,3561; erro: 2,2 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 22 1.1.3.7 Octadecanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (7) 8 9 7 10 O 6 2 1 O 4 11 13 15 17 21 19 23 25 27 Fórmula Molecular: C28H52O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 19 h T. a. DIC/DMAP 1 3 65 182 2 Tolueno 47 h Refluxo SOCl2 1 3 41 175 3 - 3 min 70 °C 1 3 85 234 4 - 5 min 70 °C 1 3 92 253 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 721, 1159, 1176, 1734, 2852, 2922. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,92-4,85 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,4, J3 = 9,8, H2), 2,43-2,27 (m, 3H, H3 e H12), 2,011,87 (m, 1H) 1,76-1,59 (m, 4H), 1,26 (sl, 30H, H13 ao H27), 0,98 (d, 1H, J = 3,4, H3), 0,91-0,87 (9H, H28, H9 e H8), 0,83 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 174,1 (C11), 79,6 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 13 45,1 (C4), 36,9 (C3), 34,8 (C12), 32,0 (C13), 29,7 (CH2), 29,5 (CH2), 29,4 (CH2), 29,2 (CH2), 28,1 (C5), 27,2 (CH2), 25,2 (CH2), 22,7 (CH2), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 14,1 (C28), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 443,3865; encontrado: 443,4183; erro: 71,7 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 23 1.1.3.8 Ácido 4-oxo-4-[(1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-il)oxi] butanoico (8) 8 9 7 10 O 6 1 2 O 4 11 OH 13 O Fórmula Molecular: C14H22O4 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia 1 CH2Cl2 26 h T. a. DIC/DMAP Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 5 35 58 Faixa de temperatura de fusão: 50-52 °C IV (KBr, cm-1): 642, 804, 1018, 1160, 1182, 1328, 1386, 1714, 1738, 2882, 2928, 2954, 2988, 3448. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,93-4,89 (m, 1H, H2), 2,67 (sl, 4H, H12, H13), 2,42-2,27 (m, 1H), 1,97-1,65 (m, 3H) 1,35-1,15 (m, 3H), 1,00 (d, 1H, J = 3,2, H3), 0,90 (s, 3H, H9), 0,87 (s, 3H, H8), 0,82 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 178,1(C14), 172,3 (C11), 80,5 (C2), 48,8 (C7), 13 47,8 (C1), 44,8 (C4), 36,6 (C3), 29,2 (C12), 29,1 (C13), 28,0 (C5), 27,0 (C6), 19,7 (C9), 18,8 (C8), 13,4 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M - H]-: 253,1440; encontrado 253,1428; erro: 4,6 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 24 1.1.3.9 Succinato de bis(1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (9) 8 9 7 10 O 6 1 4 4' 2 O O 11 1' 12' 6' 2' O 10' 7' 9' 8' Fórmula Molecular: C24H38O4 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. 1 CH2Cl2 26 h T. a. 2 - 3 min 25 °C 3 - 5 min 25 °C Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) DIC/DMAP 2 1 20 155 1 3 2 4 1 3 17 44 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Faixa de temperatura de fusão: 75-77 °C IV (KBr, cm-1): 1022, 1156, 1212, 1352, 1386, 1456, 1730, 2876, 2956, 3446. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,94-4,87 (ddd, 2H, J1 = 2,2, J2 = 3,2, J3 = 10, H2, H2’), 2,65 (s, 4H, H12, H12’), 2,422,27 (m, 2H), 1,99-1,60 (m, 8H) 1,36-1,16 (m, 6H), 1,02-0,93 (dd, 2H, J1 = 3,4, J2 = 10,2, H3, H3’), 0,90 (s, 6H, H9, H9’), 0,87 (s, 6H, H8, H8’), 0,83 (s, 6H, H10, H10’). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 172,4 (C11, C11’), 80,3 (C2, C2’), 48,8 (C7, 13 C7’), 47,8 (C1, C1’), 45,0 (C4, C4’), 36,7 (C3, C3’), 29,7 (C12, C12’), 28,1 (C5, C5’), 27,2 (C6, C6’), 19,7 (C9, C9’), 18,9 (C8, C8’), 13,5 (C10, C10’). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 413,2668; encontrado 413,2700; erro: 7,7 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 25 1.1.3.10 4-{Isopropil[isopropilamino)carbonil]amino}-4-oxobutanoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (10) 8 9 7 18 10 18 17 H O 6 1 2 O 4 11 12 13 14 O N 15 19 N 20 O 16 19 Fórmula Molecular: C21H36N2O4 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. 1 - 3 min 25 °C 2 - 5 min 25 °C Metodologia DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 3 20 50 1 3 17 44 IV (NaCl, cm-1): 1022, 1170, 1366, 1386, 1456, 1524, 1662, 1704, 1732, 2878, 2956, 2970, 3314. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 7,63-7,61 (sl, 1H, H20), 4,94-4,86 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,3, J3 = 10, H2), 4,52-4,32 (hept, 1H, J = 6,8, H17), 4,10-3,86 (oct, 1H, J = 7, H16), 2,73 (sl, 4H, H12, H13), 2,412,25 (m, 1H, H3), 1,93-1,84 (m, 1H, H6) 1,79-1,72 (m, 1H, H5), 1,69-1,65 (m, 1H, H4), 1,31-1,24 (m, 2H, H5 e H6), 1,38 (d, 6H, J = 6,6, H18), 1,19 (d, 6H, J = 6,6, H19), 1,020,95 (dd, 1H, J1 = 3,3, J2 = 10,2, H3), 0,87 (s, 3H, H9), 0,90 (s, 3H, H8), 0,82 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 173,5 (C11), 172,2 (C14), 154,0 (C15), 80,5 13 (C2), 48,9 (C7), 47,9 (C1 e C17), 45,0 (C4), 42,8 (C16), 36,6 (C3), 30,5 (C13), 29,8 (C12), 28,0 (C5), 27,2 (C6), 22,4 (C19), 20,8 (C18), 19,7 (C9), 18,8 (C8), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 403,2573; encontrado 403,2655; erro: 20,3 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 26 1.1.3.11 Benzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (11) 8 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14` 11 4 13 15 14 Fórmula Molecular: C17H22O2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 4h T. a. DIC/DMAP 1 3 59 99 2 Tolueno 17 h Refluxo SOCl2 1 3 3 8 3 Tolueno 30 h Refluxo SOCl2 1 3 26 68 4 Tolueno 100 h Refluxo SOCl2 1 3 6 13 5 - 3 min 122 °C 1 3 62 107 6 - 5 min 122 °C 1 3 81 140 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 710, 978, 1112, 1270, 1451, 1714, 2879, 2953. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 8,07 (d, 2H, J = 6,8, H13, H13’), 7,60-7,41 (m, 3H, H14, H14’ e H15), 5,16-5,08 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3, J3 = 9,8, H2), 2,56-2,40 (m, 1H, H3), 2,21-2,07 (m, 1H, H6) 1,86-1,74 (m, 2H), 1,46-1,27 (m, 2H), 1,17-1,08 (dd, 1H, J1 = 3,4, J2 = 13,6, H3), 0,97 (s, 3H, H9), 0,92 (s, 6H, H8 e H10). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 166,8 (C11), 132,7 (C-15), 130,9 (C12), 129,5 (C13 ou C14), 128,3 (C13 ou C14), 80,5 (C2), 49,1 (C7), 47,9 (C1), 45,0 (C4), 36,9 (C3), 28,1 (C5), 27,4 (C6), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 281,1517; encontrado: 281,1525; erro: 2,8 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 27 1.1.3.12 4’-Metoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (12) 8 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 4 15 13 O 14 16 Fórmula Molecular: C18H24O3 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 24 h T. a. DIC/DMAP 1 3 30 57 2 Tolueno 31 h Refluxo SOCl2 1 3 5 14 3 - 3 min 130 °C 1 3 56 105 4 - 5 min 70 °C 1 3 15 29 5 - 5 min 130 °C 1 3 50 95 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (ATR, cm-1): 696, 770, 848, 1032, 1102, 1118, 1168, 1280, 1510, 1606, 1712, 2838, 2880, 2954. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 8,02 (d, 2H, J = 9, H13 e H13’), 6,93 (d, 2H, J = 8,8, H14 e H14’), 5,13-5,05 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,2, J3 = 10, H2), 3,86 (s, 3H, H16), 2,54-2,38 (m, 1H, H3), 2,19-2,06 (m, 1H, H6), 1,88-1,72 (m, 2H), 1,45-1,22 (m, 2H), 1,15-1,06 (dd, 1H, J1 = 3,5, J2 = 13,6, H3), 0,96 (s, 3H, H9), 0,91 (s, 6H, H8 e H10). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3):C (ppm): 166,6 (C11), 163,3 (C15), 131,5 (C13, C13’), 123,5 (C12), 113,6 (C14, C14’), 80,2 (C2), 55,4 (C16), 49,1 (C7), 47,9 (C1), 45,1 (C4), 37,0 (C3), 28,1 (C5), 27,5 (C6), 19,8 (C9), 18,9 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 311,1623; encontrado 311,1609; erro: 4,5 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 28 1.1.3.13 Isopropilcarbamato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (13) 8 9 7 10 13 O 6 1 2 O 4 11 14 N 12 13' H Fórmula Molecular: C14H25NO2 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. 1 - 5 min 70 °C 2 - 5 min 130 °C 3 - 3 min 170 °C Metodologia DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 3 13 20 1 3 17 28 1 3 12 19 Faixa de Temperatura de Fusão: 63-65 °C IV (Si, cm-1): 1087, 1259, 1546, 1708, 1683, 2876, 2954, 3298. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 4,85-4,80 (m, 1H, H2), 4,48 (sl, 1H, H14) 3,91-3,68 (m, 1H, H12), 2,41-2,26 (m, 1H, H3), 1,94-1,82 (m, 1H, H6), 1,79-1,71 (m, 1H, H5), 1,67-1,63 (m, 1H, H4), 1,25-1,23 (m, 2H, H5 e H6), 1,16 (d, 6H, J = 6,4, H13, H13’), 1,01 (d, 1H, J = 3,1, H3), 0,90 (s, 3H, H8), 0,86 (s, 3H, H9), 0,84 (s, 3H, H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 156,3 (C11), 79,9 (C2), 48,8 (C7), 47,8 (C1), 13 45,0 (C4), 43,1 (C12), 36,9 (C3), 28,1 (C5), 27,2 (C6), 23,1 (C13, C13’), 19,7 (C9), 18,8 (C8), 13,5 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 262,1783; encontrado 262,1834; erro: 19,4 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 29 1.1.3.14 3’,4’-Dimetoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (14) 8 9 7 6 10 1 18 O 13 2 O 14 11 O 4 19 15 17 O 16 Fórmula Molecular: C19H26O4 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 72 h T. a. DIC/DMAP 1 3 77 161 2 Tolueno 43 h Refluxo SOCl2 1 3 23 47 3 - 3 min 130 °C 1 3 51 106 4 - 5 min 130 °C 1 3 60 127 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (Si, cm-1): 763, 1025, 1114, 1177, 1224, 1271, 1290, 1453, 1514, 1601, 1710, 2878, 2954. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 7,73-7,68 (dd, 1H, J1 = 1,8, J2 = 8,4, H17), 7,58 (d, 1H, J = 2, H13), 6,90 (d, 1H, J = 8,4, H16), 5,13-5,06 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3,4, J3 = 9,8, H2), 3,94 (s, 6H, H18, H19), 2,552,39 (m, 1H, H3), 2,18-2,05 (m, 1H, H6) 1,84-1,71 (m, 2H), 1,48-1,23 (m, 2H), 1,16-1,08 (dd, 1H, J1 = 3,4, J2 = 13,8, H3), 0,97 (s, 3H, H9), 0,92 (s, 6H, H8 e H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 166,6 (C11), 153,1 (C15), 148,9 (C14), 123,7 13 (C12), 123,4 (C17), 112,5 (C16), 110,5 (C13), 80,4 (C2), 56,1 (C18 e C19), 49,2 (C7), 47,9 (C1), 45,2 (C4), 37,0 (C3), 28,2 (C5), 27,5 (C6), 19,8 (C9), 19,0 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 341,1729; encontrado 341,1703; erro: 7,6 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 30 1.1.3.15 3’,4’,5’-Trimetoxibenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (15) 8 9 7 6 10 O 13' 2 1 O 14' 11 O 16 4 15 13 O 14 17 O Fórmula Molecular: C20H28O5 18 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 5h T. a. DIC/DMAP 1 3 54 123 2 Tolueno 72 h Refluxo SOCl2 1 3 35 122 3 - 3 min 170 °C 1 3 82 193 4 - 5 min 130 °C 1 3 80 182 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Faixa de Temperatura de Fusão: 69-71 °C IV (ATR, cm-1): 767, 873, 1122, 1228, 1333, 1415, 1586, 1708, 2836, 2952. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 7,32 (s, 2H, H13, H13’), 5,12-5,07 (m, 1H, H2), 3,92 (s, 9H, H16, H17 e H18), 2,54-2,42 (m, 1H, H3), 2,16-2,05 (m, 1H, H6) 1,81-1,75 (m, 2H), 1,47-1,26 (m, 2H), 1,12 (d, 1H, J = 13,6, H3), 0,98 (s, 3H, H9), 0,92 (s, 6H, H8 e H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 166,4 (C11), 152,9 (C14, C14’), 142,2 (C15), 13 126 (C12), 106,8 (C13, C13’), 80,7 (C2), 60,9 (C17), 56,2 (C16 e C18), 49,1 (C7), 47,9 (C1), 45,0 (C4), 37,0 (C3), 28,1 (C5), 27,5 (C6), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 371,1834; encontrado 371,1892; erro: 15,6 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 31 1.1.3.16 3’,5’-Dinitrobenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (16) 8 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 NO2 4 15 13 14 NO2 Fórmula Molecular: C17H20N2O6 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 1h T. a. DIC/DMAP 1 3 84 381 2 Tolueno 19 h Refluxo SOCl2 1 3 7 27 3 - 3 min 130 °C 1 3 56 128 4 - 5 min 130 °C 1 3 75 174 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Faixa de Temperatura de Fusão: 145-147 °C IV (ATR, cm-1): 702, 729, 822, 913, 1286, 1302, 1343, 1541, 1723, 2879, 2956, 3018. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 9,23 (t, 1H, J = 2,1, H15), 9,15 (d, 2H, J = 2, H13 e H13’), 5,27-5,20 (m, 1H, H2), 2,622,46 (m, 1H, H3), 2,14-2,01 (m, 1H, H6) 1,88-1,80 (m, 2H), 1,58-1,36 (m, 2H), 1,21-1,12 (dd, 1H, J1 = 3,4, J2 = 13,8, H3), 0,99 (s, 3H, H9), 0,95 (s, 6H, H8 e H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 162,7 (C11), 148,7 (C14, C14’), 134,6 (C12), 13 129,3 (C13, C13’), 122,2 (C15), 83,2 (C2), 49,3 (C7), 48,1 (C1), 44,9 (C4), 36,8 (C3), 28,1 (C5), 27,4 (C6), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,7 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M+H]-: 349,1400; encontrado 349,1408; erro: 2,3 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 32 1.1.3.17 3’,5’-Dinitrosalicilato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (17) 8 9 7 6 10 O OH 2 1 13 O 14 11 NO2 4 15 17 16 NO2 Fórmula Molecular: C17H20N2O7 Aspecto: sólido laranja Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 21 h T. a. DIC/DMAP 1 3 41 97 2 Tolueno 24 h Refluxo SOCl2 1 3 traços - 3 - 3 min 170 °C 1 3 13 16 4 - 5 min 170 °C 1 3 21 25 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Faixa de Temperatura de Fusão: 135-136 °C IV (KBr, cm-1): 720, 742, 806, 1086, 1178, 1262, 1338, 1352, 1454, 1546, 1622, 1682, 1710, 2884, 2958, 3098. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 12,93 (s, 1H, H13), 9,03 (1H, H15), 8,97 (1H, H17), 5,28-5,23 (m, 1H, H2), 2,60-2,48 (m, 1H, H3), 2,09-1,98 (m, 1H, H6), 1,89-1,83 (m, 2H), 1,55-1,37 (m, 2H), 1,14 (1H, H3), 0,99 (s, 3H, H9), 0,96 (s, 6H, H8 e H10). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3):C (ppm): 168,3 (C11), 159,9 (C13), 138,2 (C16), 137,8 (C14), 129,7 (C17), 126,5 (C15), 116,2 (C12), 84,6 (C2), 49,3 (C7), 48,1 (C1), 44,7 (C4), 36,6 (C3), 28,0 (C5), 27,3 (C6), 19,6 (C9), 18,8 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M - H]-: 363,1192; encontrado 363,1191; erro: 0,3 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 33 1.1.3.18 Nicotinato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (18) 8 9 7 6 10 O 13 2 1 O 11 N 14 4 15 17 16 Fórmula Molecular: C16H21NO2 Aspecto: óleo incolor Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 3h T. a. DIC/DMAP 1 3 72 123 2 Tolueno 40 h Refluxo SOCl2 1 3 10 26 3 - 3 min 70 °C 1 3 43 73 4 - 5 min 70 °C 1 3 60 101 5 - 5 min 130 °C 1 3 38 64 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO IV (NaCl, cm-1): 702, 740, 1024, 1124, 1286, 1302, 1590, 1718, 2880, 2954, 3040, 3054. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 9,26-9,25 (sl, 1H, H13), 8,80-8,76 (dd, 1H, J1 = 1,8, J2 = 4,8, H15), 8,34-8,28 (td, 1H, J1 = 1,8, J2 = 8,0, H17), 7,44-7,37 (dd, 1H, J1 = 4,8, J2 = 8,0, H16), 5,19-5,12 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3,2, J3 = 9,8, H2), 2,57-2,41 (m, 1H, H3), 2,17-2,03 (m, 1H, H6), 1,84-1,74 (m, 2H), 1,50-1,26 (m, 2H), 1,18-1,09 (dd, 1H, J1 = 3,6, J2 = 13,8, H3), 0,98 (s, 3H, H9), 0,93 (s, 6H, H8 e H10). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3):C (ppm): 165,5 (C11), 153,2 (C13), 150,9 (C15), 136,9 (C17), 126,8 (C12), 123,2 (C16), 81,2 (C2), 49,2 (C7), 48,0 (C1), 45,0 (C4), 36,9 (C3), 28,1 (C5), 27,4 (C6), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + H]+: 260,1651; encontrado 260,1651; erro: 0 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 34 1.1.3.19 4’-Aminobenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (19) 8 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 4 15 13 NH2 14 Fórmula Molecular: C17H23NO2 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Quant. (mg) 1 CH2Cl2 96 h T. a. DIC/DMAP 1 3 24 43 2 Tolueno 18 h Refluxo SOCl2 1 3 0 0 3 - 3 min 70 °C 1 3 7 13 4 - 5 min 70 °C 1 3 6 11 5 - 5 min 130 °C 1 3 8 15 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Faixa de Temperatura de Fusão: 114-115 °C IV (Si, cm-1): 773, 1120, 1172, 1286, 1311, 1598, 1630, 1681, 2954, 3369, 3478. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 7,87 (d, 2H, J = 8,6, H13, H13’), 6,65 (d, 2H, J = 8,6, H14, H14’), 5,10-5,02 (ddd, 1H, J1 = 2,2, J2 = 3,4, J3 = 9,8, H2), 4,06 (sl, 2H, H16), 2,52-2,36 (m, 1H, H3), 2,19-2,06 (m, 1H, H6), 1,80-1,71 (m, 2H), 1,40-1,23 (m, 2H), 1,14-1,05 (dd, 1H, J1 = 3,4, J2 = 13,8, H3), 0,96 (s, 3H, H9), 0,90 (s, 6H, H8 e H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 166,9 (C11), 150,7 (C15), 131,6 (C13, C13’), 13 120,7 (C12), 113,8 (C14, C14’), 79,8 (C2), 49,1 (C7), 47,9 (C1), 45,1 (C4), 37,0 (C3), 28,2 (C5), 27,5 (C6), 19,8 (C9), 19,0 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 296,1626; encontrado 296,1581; erro: 15,2 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 35 1.1.3.20 2’-Acetilbenzoato de 1,7,7 trimetilbiciclo[2.2.1]heptan-2-ila (20) O 8 9 7 6 10 1 O O 2 18 19 13 O 14 11 4 15 17 Fórmula Molecular: C19H24O4 16 Aspecto: sólido branco Condições da Reação: Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. Quant. (%) (mg) 1 CH2Cl2 96 h T. a. DIC/DMAP 1 3 10 21 2 Tolueno 22 h Refluxo 1 3 5 16 3 - 3 min 70 °C 1 3 traços - 4 - 5 min 70 °C 1 3 9 19 5 - 5 min 130 °C SOCl2 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO 1 3 8 16 Faixa de Temperatura de Fusão: 53-54 °C IV (Si, cm-1): 669, 1081, 1194, 1263, 1722, 1776, 2882, 2955. RMN de 1H (200 MHz, CDCl3, H (ppm), multiplicidade, integração, J (Hz), atribuição): 8,05-8,00 (dd, 1H, J1 = 1,6, J2 = 7,8, H14), 7,60-7,51 (td, 1H, J1 = 1,8, J2 = 7,6, H16), 7,36-7,27 (td, 1H, J1 = 1,2, J2 = 7,6, H15), 7,13-7,08 (dd, 1H, J1 = 1,0, J2 = 8,0, H17), 5,11-5,03 (ddd, 1H, J1 = 2, J2 = 3,2, J3 = 10, H2), 2,53-2,39 (m, 1H, H3), 2,36 (s, 3H, H19), 2,14-2,00 (m, 1H, H6), 1,81-1,72 (m, 2H), 1,44-1,26 (m, 2H), 1,14-1,05 (dd, 1H, J1 = 3,4, J2 = 13,8, H3), 0,95 (s, 3H, H9), 0,90 (s, 6H, H8 e H10). RMN de C (50 MHz, CDCl3): C (ppm): 169,5 (C18), 164,5 (C11), 150,8 (C13), 133,4 13 (C15), 131,4 (C17), 125,9 (C14), 124,0 (C12), 123,8 (C16), 80,8 (C2), 49,1 (C7), 47,9 (C1), 45,0 (C4), 36,8 (C3), 28,1 (C5), 27,4 (C6), 21,1 (C19), 19,7 (C9), 18,9 (C8), 13,6 (C10). HRMS (ESI): m/z calculado - [M + Na]+: 339,1572; encontrado 339,1571; erro: 0,3 ppm. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 36 1.2 Resultados e Discussão Todos os ésteres foram sintetizados através de duas metodologias distintas, onde foram avaliados o tempo de reação, temperatura, rendimento e a eficiência do uso da irradiação de micro-ondas na preparação destes. As metodologias avaliadas seguem mecanismos de reações distintos. A primeira metodologia aplicada utiliza a DIC (di-isopropilcarbodi-imida) como reagente de acoplamento e o DMAP (4-dimetilaminopiridina) como catalisador. Esta reação é conhecida como esterificação de Steglich (LAUE e PLAGENS, 2005) e consiste no uso de um reagente de acoplamento que ao reagir com o ácido carboxílico forma um intermediário (O-acil-isouréia), que apresenta reatividade semelhante ao anidrido correspondente do ácido carboxílico. O mecanismo desta reação está descrito no Esquema 1 (pág. 37). Na primeira etapa da reação a DIC desprotona o ácido carboxílico 1. Em seguida, a DIC protonada 3, que apresenta um carbono com grande caráter eletrofílico, é atacada pelo carboxilato 2, originando a O-acil-isouréia 4. Após uma nova protonação deste intermediário, há uma adição nucleofílica do álcool 5 ao carbono carbonílico de 6, levando à formação do éster protonado 7 e conduzindo à eliminação da N´,N´-di-isopropiluréia (DIU) (excelente grupo abandonador). Após desprotonação de 7, obtém-se o produto desejado 8 Quando a reação ocorre na presença de nucleófilos fortes, tais como aminas, há uma rápida adição deste nucleófilo ao intermediário protonado O-acil-isouréia (6), levando à obtenção do produto desejado. Entretanto, para nucleófilos mais fracos, como álcoois, onde a esterificação ocorre de maneira mais lenta, existe a possibilidade de um rearranjo 1,3 do intermediário O-acil isouréia (6) resultando na N-acil-isouréia (10), o que impossibilita a reação com o álcool (Esquema 2, pág. 37). Assim, o uso de DMAP (um nucleófilo mais forte que o álcool) impede que esta reação paralela ocorra (Esquema 3, pág. 38), pois esta base substitui o grupo O-acil-uréia como grupo abandonador, formando a nova espécie acilante 11. Esta nova espécie, que não pode formar produtos secundários de rearranjo, reage rapidamente com o álcool, conduzindo à formação do éster 8 (RODRIGUES, 2011). Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 37 O R O O 1 N H C N R DIC 2 O N H N 3 H O R 7 HN R1 O R1 OH C R 5 H N HN RCOOH -RCOO O R 6 O C DIU C O N 4 O O O N H C DMAP N H -DMAP -DIU R O R1 8 Esquema 1: Mecanismo da reação de esterificação de Steglich. HN C N 6 O H R O H H O -H N R N N N R O H 9 Esquema 2: Rearranjo 1,3 do intermediário O-acil-isouréia. O O 10 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 38 N HN C N 6 O N N N R + H N - DIU O N DMAP R O 11 R R1 - DMAPH+ O OH O R O R1 8 Esquema 3: Reação com participação do DMAP. Para as reações utilizando-se DIC e DMAP foi avaliado o uso da irradiação de micro-ondas na preparação dos ésteres. Inicialmente, todos os ésteres foram submetidos a 3 minutos de reação; porém, observou-se que para alguns deles o tempo era insuficiente para consumir todo o borneol do meio reacional. Assim, aumentou-se o tempo de reação para 5 minutos para obter melhores rendimentos. Como a reação no reator de micro-ondas ocorre na ausência de solvente, faz-se necessário que um dos reagentes esteja na forma líquida para que ocorra maior contato entre as substâncias do meio reacional, levando a formação do produto desejado. Portanto, como a maior parte dos reagentes eram sólidos à temperatura ambiente, foi necessário o aquecimento da reação para que ocorresse a fusão de um dos reagentes. A temperatura da reação variou de acordo com o ácido utilizado, sendo observado bons rendimentos à temperatura de 70 °C, mesmo não sendo essa temperatura correspondente ao ponto de fusão da maioria dos ácidos utilizados. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 39 Na segunda metodologia avaliada, utiliza-se o cloreto de tionila (SOCl2) com o objetivo de produzirmos um cloreto de acila (cloreto de ácido), para posterior adição do álcool. O mecanismo dessa reação consiste no ataque nucleofílico da hidroxila do ácido ao enxofre polarizado, com a saída do íon cloreto, formando o composto 1 (Esquema 4). Logo após, ocorre desprotonação de 1, seguida de ruptura de ligação, levando à formação do cloreto de acila 2 e dióxido de enxofre 3. Em seguida, com a adição do álcool ao meio reagente, ocorre um ataque nucleofílico da hidroxila alcoólica ao carbono altamente polarizado do cloreto de ácido, originando o intermediário 4. Finalmente, há saída de cloreto e desprotonação, levando à formação do éster 5. Um dos maiores problemas desta reação é a instabilidade do cloreto de ácido formado durante o mecanismo, pois, sendo uma espécie muito reativa, pode ocorrer sua hidrólise pela umidade do ar, levando a formação do ácido carboxílico de origem. O O R OH + Cl S R - Cl- O Cl O H Cl - R R Cl 4 - H+ O R1 O Cl S + R Cl O 1 H S O R O O O + S 1 O - H+ H O R1 O O R 5 Esquema 4: Mecanismo da reação com SOCl2. R1 OH R Cl 2 O O 3 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 40 1.2.1 Síntese dos ésteres Para síntese dos ésteres derivados do borneol foram utilizados dezessete ácidos, sendo oito graxos e nove aromáticos (Esquema 5). Destes, foi possível obter 20 ésteres, sendo 18 inéditos. Os rendimentos das reações variaram de 02 a 95% (Tabela 1, pág. 41). Os melhores resultados foram obtidos utilizando os reagentes DIC/DMAP com irradiação de micro-ondas, uma vez que o tempo de reação diminuiu consideravelmente e os rendimentos foram satisfatórios. + OH O A ou B RCOOH ou ArCOOH O R A= DIC/DMAP (com ou sem micro-ondas) B= SOCl2 R= -(CH2)4CH3 -(CH2)6CH3 -(CH2)8CH3 -(CH2)10CH3 -(CH2)12CH3 -(CH2)14CH3 -(CH2)16CH3 -(CH2)2COOH Ar= O OMe MeO OMe OMe OMe OH O2N NO2 OMe O N O2N NO2 NH2 Esquema 5: Ácidos utilizados na esterificação do borneol. As reações conduzidas com SOCl2 apresentaram rendimentos muito inferiores quando comparados ao DIC/DMAP. Isso se explica devido à formação do cloreto de ácido, uma espécie muito instável que é facilmente hidrolisada na presença de umidade no ar. Assim, como as reações de esterificação conduzidas por esta metodologia não foram realizadas em atmosfera inerte, pode-se concluir que o cloreto de ácido formado retornava ao ácido original, diminuindo os rendimentos destas reações. De todos os ésteres sintetizados, apenas o benzoato de bornila (11) e 3’,4’,5’trimetoxibenzoato de bornila (15) não são inéditos. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 41 Tabela 1: Rendimento e tempo de reação nas diferentes metodologias para obtenção dos ésteres do borneol Metodologias ,c DIC/DMAP (sem IMO) * , d DIC/DMAP (com IMO) * SOCl2 * Acido Carboxílico Tempo (h) Rendimento/ a (Produto) Hexanoico 2 62 / (1) Octanoico 1 79 / (2) Decanoico Dodecanoico Tetradecanoico Hexadecanoico Octadecanoico 3 14 2 1 19 3 minutos 5 minutos 85 / (3) 72 / (4) 82 / (5) 73 / (6) 65 / (7) Temperatura (°C) 25 70 25 70 70 70 70 70 70 Rendimento a (Produto) 51 / (1) 76 / (1) 83 / (2) 87 / (2) 92 / (3) 82 / (4) 89 / (5) 77 / (6) 85 / (7) 26 20 / (9) 70 26 35 / (8) 25 Benzoico 4 59 / (11) p-metoxibenzoico 24 30 / (12) Butanodioico Tempo (h) b Rendimento a (Produto) Temperatura (°C) Rendimento a (Produto) 70 61 / (1) 26 36 / (1) 70 93 / (2) 29 44 / (2) 70 70 70 70 70 95 / (3) 76 / (4) 87 / (5) 82 / (6) 92 / (7) 17 19 24 47 47 34/ (3) 43 / (4) 17 / (5) 36 / (6) 41 / (7) 0 20 / (10) 2 / (9) 25 17 / (9) 17 / (10) 46 8 / (9) 122 62 / (11) 122 81 / (11) 17 30 100 3 / (11) 26 / (11) 6 / (11) 130 50 / (12) 130 56 (12) 15 / (12) 13 / (13) 60 / (14) 80 / (15) 75 / (16) 17 / (13) 31 5 / (12) 43 72 23/ (14) 35 / (15) 19 7 / (16) 24 - / (17) 40 10 / (18) 18 0 22 5 / (20) 70 3,4-dimetoxibenzoico 3,4,5-trimetoxibenzoico 72 5 77 / (14) 54 / (15) 130 170 51 / (14) 82 / (15) 130 130 3,5-dinitrobenzoico 1 84 / (16) 130 56 / (16) 130 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico 21 41 / (17) 170 13 / (17) 12 / (13) 170 21 / (17) 70 130 70 130 70 130 60 / (18) 38 / (18) 6 / (19) 8 / (19) 9 / (20) 8 / (20) Nicotínico 3 72 / (18) 70 43 / (18) p-aminobenzoico 96 24 / (19) 70 7 / (19) Acetilsalicílico 96 10 / (20) 70 - / (20) * Em todas as reações foram utilizados a proporção de 1 mol borneol para 3 mol do ácido, exceto para ácido Butanodioico (Ver tabela 3, pág. 45). a Os produtos encontram-se descritos por números, a estrutura de cada um deles está descrita no item 1.1.3. b Tempo de reação entre cloreto de ácido e o borneol. O tempo para formar o cloreto de ácido foi padronizado em 3h (MIRANDA, 2007). c A reação conduzida por essa metodologia foi realizada sob temperatura ambiente. d A reação conduzida por essa metodologia foi mantida em aquecimento, sob refluxo. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 42 1.2.2 Síntese e caracterização dos ésteres graxos Para obtenção dos ésteres de cadeia graxa foram utilizados oito ácidos, que seguem uma série homóloga na qual se varia o número de carbono na cadeia graxa, com exceção do ácido butanodioico (succínico), que apresenta dois grupos carboxila na sua estrutura. Os rendimentos dos ésteres obtidos variaram de 20 a 85%, utilizandose DIC/DMAP sem IMO (Tabela 1, pág. 41). Quando foi utilizada a metodologia do cloreto de tionila, os rendimentos foram muito inferiores (8 a 44%). O uso de DIC/DMAP com IMO forneceu melhores rendimentos (2 a 95%), e menor tempo de reação (3 e 5 minutos) quando comparados com cloreto de tionila (17 a 47 horas) e DIC/DMAP sem IMO (1 a 26 horas). Para as reações conduzidas sob irradiação de micro-ondas, não foi observado grande diferença nos rendimentos quando se utilizou 3 minutos ou 5 minutos de aquecimento. Como os ácidos graxos possuem baixo ponto de fusão, 3 minutos de aquecimento já foram suficientes para que houvesse fusão de todo material de partida. Para os ácidos hexanoico e octanoico, utilizou-se em um primeiro momento a temperatura de 25 °C, uma vez que estes são líquidos a temperatura ambiente e, portanto, não seria necessário o aquecimento para que ocorresse a sua fusão. Porém, foi observado para o ácido hexanóico um rendimento abaixo do obtido pela metodologia DIC/DMAP sem IMO. Assim, decidiu-se aquecer a reação a 70 °C para observar se haveria um aumento na formação do produto. Todos os ésteres obtidos foram caracterizados utilizando espectroscopia de IV, RMN de 1H e 13C e espectrometria de massas. Alguns sinais observados nos espectros no IV e de RMN de 1H e 13 C são fundamentais para a caracterização e confirmação da formação dos ésteres graxos: a) deslocamento do sinal do hidrogênio (H2) ligado ao carbono carbinólico para região mais desblindada do espectro em relação ao borneol (Figura 9, pág. 43); Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 43 b) aparecimento do espectro de RMN de 13 C dos sinais correspondentes ao carbono carbonílico do éster (~174 ppm) e a cadeia alifática do ácido (~29 ppm); c) presença de uma banda intensa no espectro no IV, referente ao estiramento da ligação C=O de éster (~1730 cm-1). Nos espectros de todos os derivados graxos sintetizados foi possível observar os sinais característicos que comprovavam a obtenção do produto desejado (Tabela 2, H H O OH 4.000 5.058 R 1.00 4.050 5.074 5.068 O 1.00 4.100 ppm (t1) 5.107 5.084 Éster 5.124 5.117 5.134 Borneol 3.997 3.989 3.982 4.039 4.031 pág. 44). Todos os compostos obtidos são inéditos na literatura. 3.950 3.900 5.200 ppm (t1) 5.150 5.100 5.050 5.000 Figura 9: Deslocamento de sinal do hidrogênio H2 observado quando ocorre formação do éster. Como os ésteres de cadeia graxa apresentam grande similaridade estrutural, será discutida detalhadamente apenas a caracterização dos ésteres derivados do ácido succínico. A caracterização dos demais produtos foi feita de modo semelhante e seus dados espectroscópicos encontram-se descritos no item 1.1.3 (pág. 16). Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 44 Tabela 2: Dados de RMN e de IV dos ésteres 1 – 10 RMN de 1H RMN de 13C IV H (ppm) C (ppm) (cm-1) H-C-O C=O C=O 1 4,92-4,85 (ddd) 174,1 1732 2 4,92-4,85 (m) 174,2 1732 3 4,92-4,85 (ddd) 174,2 1710 4 4,92-4,85 (ddd) 174,0 1736 5 4,92-4,85 (m) 174,1 1734 6 4,92-4,85 (ddd) 174,2 1734 7 4,92-4,85 (ddd) 174,1 1734 8 4,93-4,89 (m) 172,3 1738 9 4,94-4,87 (ddd) 172,4 1730 10 4,94-4,86 (ddd) 173,5 1732 Composto Para todos os ésteres sintetizados, foi utilizado excesso do ácido numa quantidade três vezes maior que o álcool. Porém, para o ácido succínico foram avaliadas outras quantidades de reagente, uma vez que este substrato apresenta dois grupos carboxila passíveis de esterificação. Portanto, devido à possibilidade de ocorrerem a adição do álcool em ambas carboxilas do ácido, decidiu-se utilizar primeiro um excesso do álcool em relação ao ácido (Condição 1, Tabela 3, pág. 45). Nesta reação, foi observada a formação de dois produtos. Um deles apresentou um Fator de Retenção (Rf) maior que o Borneol (material de partida) e o outro um Rf menor que o Borneol. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 45 Tabela 3: Condições de reação usada na tentativa de obtenção do éster derivado do ácido succínico Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido (mmol) Rend. (%) Produto 1 CH2Cl2 26 h T. a. DIC/DMAP 2 1 20 9 2 CH2Cl2 26 h T. a. DIC/DMAP 1 5 35 8 4 Tolueno 46 h Refluxo SOCl2 2 1 8 9 5 - 3 min 70 °C 1 3 0 - 6 - 3 min 25 °C 1 3 2 e 20 9 e 10 7 - 5 min 25 °C 1 3 17 e 17 9 e 10 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO Após purificação em coluna cromatográfica foi possível isolar apenas o composto que apresentou maior Rf. Este se apresentou como óleo incolor, solúvel em clorofórmio. O espectro na região do IV (Figura 10, pág. 46) de 9 apresenta bandas em 2956 cm-1 característica de estiramento assimétrico da ligação CH de grupos CH2 de compostos alifáticos. A banda em 1730 cm-1 é característica de estiramento de ligação dupla CO de éster. Não foi observada nenhuma banda correspondente a estiramento OH, ou CO de ácido. Para espectros obtidos com pastilha de KBr, pode-se observar uma banda larga em torno de 3400 cm-1, que caracteriza estiramento OH de água, uma vez que o KBr é muito higroscópico, sendo muito difícil mantê-lo seco (BARBOSA, 2007). Isto foi observado no espectro do éster 9, onde verificamos uma banda em 3446 cm-1. Na expansão do espectro de RMN de 1H (Figura 11, pág. 46) de 9 observou-se um duplo dupleto duplo (ddd) em H 4,94-4,87 (J1 = 2,2, J2 = 3,2, J3 = 10), integrando para um hidrogênio, que foi atribuído ao hidrogênio do carbono carbinólico H2, que acopla com os hidrogênios H6, H3 e H3 respectivamente (Figura 24, pág. 58). Em H 2,66 observou-se um simpleto, integrando para dois hidrogênios. Este sinal foi atribuído aos hidrogênios metilênicos H12 e H12’ vizinhos à carbonila. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 8 9 7 10 75 O 6 70 46 4' 2 1 O 11 O 4 1' 12' 6' 2' 65 O 10' 7' 9' 60 8' 826 888 55 980 45 40 35 10 1156 2956 1212 15 1022 1352 20 1140 1386 2876 25 1112 30 1242 1456 3446 %Transmittance 50 5 1730 0 3800 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 Wavenumber (cm-1) 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 0.950 0.932 0.897 0.827 0.869 1.018 1.001 0.975 1.184 1.164 1.212 1.241 1.272 1.255 1.287 1.293 1.340 1.351 1.363 1.598 1.689 1.667 1.646 1.776 1.755 1.737 1.717 1.800 1.859 1.887 1.912 1.994 1.984 1.949 1.929 4.867 4.883 4.878 2.307 2.289 2.267 4.894 4.933 4.928 4.917 2.376 2.357 2.337 2.317 4.944 3.40 3.00 3.14 2.425 2.407 2.385 1.60 2.652 Figura 10: Espectro na região do IV do éster 9 (KBr). 1.00 4.950 4.900 4.850 4.800 ppm (t1) 2.00 3.36 3.97 1.10 1.90 2.50 1.50 1.00 ppm (t1) Figura 11: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do composto 9 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol A análise do espectro de RMN de 47 13 C e do subespectro DEPT135 (Figuras 76 e 77, pág. 125) indicou a presença de 12 sinais, sendo dois referentes à carbono metínico, quatro à carbono metilênico, três à carbono metílico e três à carbono não hidrogenado. O fato do espectro de RMN de C apresentar apenas um sinal em C 172,4 13 permite sugerir que o éster 9 apresentou esterificação em ambas as carbonilas do ácido succínico, uma vez que não foi observado nenhum sinal de carbono carboxílico de ácido no RMN de 13C. A presença de apenas um sinal integrando para 2 hidrogênios em H 2,66 também confirma essa hipótese, uma vez que o produto dissubstituído leva à um composto simétrico, onde ambos hidrogênios (H12 e H12’) teriam um mesmo deslocamento (simpleto) no espectro de RMN de 1H. Para confirmação da estrutura do composto obtido foi importante a utilização da espectrometria de massas de alta resolução com ionização por electrospray (HRMSESI) em modo positivo. Este experimento mostrou a presença de um pico de massa sobre carga (m/z) para o íon [M + Na]+: 403,2700, que está bem próximo da massa exata teórica [M + Na]+: 403,2668, erro: 7,7 ppm, o que confirmou a estrutura proposta para 9 (Figura 12). Assim, após análise, verificamos que o espectro de RMN de 1H (Figura 11, pág. 46) para a substância 9 não estava com as integrais de acordo com a estrutura proposta. Portanto, os valores das integrais dos sinais foram dobrados (Figura 75, pág. 124), já que a molécula apresenta plano de simetria, e por isso, os sinais dos hidrogênios são equivalentes entre si. O composto 9 também foi obtido quando se utilizou o SOCl2, porém com rendimento inferior ao obtido com DIC/DMAP (Entrada 4, Tabela 3, pág. 45). 8 9 7 10 O 6 1 4 4' 2 O O 11 1' 12' 6' 2' O 10' 7' 9' 8' Figura 12: Estrutura do composto 9. Para avaliar o efeito da concentração do ácido na obtenção do éster, utilizou-se uma concentração maior deste em relação ao álcool (Condição 2, Tabela 3, pág. 45). A Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 48 reação também ficou por 26 horas à temperatura ambiente e obteve-se um produto (8) com 35% de rendimento. O produto 8 apresentou-se como sólido branco, com Rf menor que o borneol e faixa de fusão de 50-52 °C. No espectro no infravermelho (IV) (Figura 13) de 8 observou-se uma banda intensa em 1738 cm-1 característica do estiramento de ligação C=O de éster e uma banda também intensa em 1714, característica de estiramento de ligação C=O de ácido. Em 3448 cm-1 observou-se uma banda larga, característica de estiramento da ligação O-H. Em 1328 cm-1 foi observado uma banda intensa referente ao estiramento da ligação C-O. 65 8 9 7 60 10 O 55 6 2 1 50 O 4 11 OH 13 45 O 804 642 35 30 926 %Transmittance 40 1114 1018 3448 20 996 25 15 1422 3600 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 Wavenumber (cm-1) 1800 1600 1400 1160 1182 3800 1328 5 1714 1738 2882 2928 2954 2988 10 1200 1000 800 600 Figura 13: Espectro na região do IV do éster 8 (KBr). A análise do espectro de RMN de 1H (Figura 14, pág. 49) de 8 mostrou a presença de um multipleto em H 4,93-4,89, integrando para um hidrogênio, o qual corresponde ao hidrogênio H2 do carbono carbinólico. Em H 2,67 observou-se a presença de um sinal largo, integrando para quatro hidrogênios, correspondendo aos hidrogênios H12 e H13. 0.996 0.897 0.000 0.822 0.871 1.157 1.012 1.208 1.176 1.260 1.231 1.351 1.286 1.672 1.653 1.738 1.692 1.842 1.757 1.896 1.872 1.931 1.914 2.268 49 1.974 2.315 2.288 2.355 2.337 2.406 2.383 2.377 2.672 2.423 8 4.886 4.934 4.934 4.886 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 9 7 10 O 6 2 1 O 4 11 OH 13 O 1.00 5.050 5.000 ppm (t1) 4.950 4.900 4.850 4.800 4.750 3.19 3.17 2.91 0.96 2.0 2.72 3.0 3.44 4.0 1.14 4.34 1.00 5.0 ppm (t1) 1.0 0.0 Figura 14: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 8 em CDCl3. O espectro de RMN de 13 C e subespectro DEPT135 (Figuras 73 e 74, págs. 123 e 124) indicou a presença de 14 sinais, sendo dois referentes à carbono metínico, cinco à carbono metilênico, três à carbono metílico e quatro à carbono não hidrogenado. Observou-se a presença de dois sinais de carbono carbonílico, em C 178,1 e 172,3, o que evidenciou a formação do éster em apenas uma carboxila do ácido succínico. A análise do espectro de massas de alta resolução com ionização por electrospray (HRMS-ESI) em modo negativo de 8 confirmou a estrutura proposta. O experimento mostrou a presença de um pico de massa sobre carga (m/z) para o íon [M - H]-: 253,1428, que está bem próximo da massa exata teórica [M - H]-: 253,1440, erro: 4,6 ppm. A síntese do éster derivado do ácido succínico através da metodologia utilizando DIC/DMAP com uso da IMO também forneceu compostos diferentes (Condições 6 e 7, Tabela 3, pág. 45). Quando a reação foi aquecida a 70 °C (Condição 5), não houve formação de nenhum produto e observamos decomposição do ácido, uma vez que a reação tornou-se escura e na placa cromatográfica visualizou-se a mancha Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 50 correspondente apenas ao borneol. Assim, a síntese foi novamente realizada, sob temperatura ambiente, variando-se apenas o tempo de reação. A irradiação usando apenas 3 minutos (Condição 6, Tabela 3, pág. 45) forneceu 2 produtos, com 20% e 2% de rendimento. O produto minoritário foi identificado através dos dados de RMN 1H e 13 C do como sendo o composto 9. O produto obtido em maior quantidade (10), após a caracterização através de RMN de 1H, 13 C e DEPT-135, apresentou sinais que não eram compatíveis com nenhum dos compostos esperadas (compostos 8 e 9). O composto 10 foi obtido como um óleo transparente e solúvel em clorofórmio. O espectro na região do IV (Figura 15, pág. 51) de 10 apresenta absorção em 3314 cm1 característica de estiramento de ligação NH de amida, em 2970 cm-1 característica de estiramento assimétrico da ligação CH de grupos CH3, em 2878 cm-1 característica de estiramento simétrico da ligação CH de grupos CH2 de compostos alifáticos, em 1732 cm-1 característica de estiramento de ligação C=O de éster, em 1704 e 1662 cm-1 característica de estiramento da ligação C=O de amida e de deformação angular da ligação NH, em 1524 cm-1 características de deformação angular da ligação NH de grupo amida, em 1456 e 1386 cm-1 características de deformação angular de CH2 e CH3 (BARBOSA, 2007). No espectro de RMN de 1H de 10 (Figura 16 e 17, págs. 51 e 52) observou-se um sinal largo em H 7,62, integrando para 1H, um duplo dupleto duplo em H 4,94-4,86 (J1 = 2,2, J2 = 3,3, J3 = 10); integrando para 1H, característico de hidrogênio ligado a carbono carbinólico (H2); um hepteto em H 4,42 (J = 6,8), integrando para 1H, um octeto em H 3,98 (J = 7), integrando para 1H. Observou-se ainda, três simpletos em H 0,90, 0,87 e 0,82, correspondentes a três metilas e dois dupletos em H 1,38 (J = 6,6) e 1,19 (J = 6,6), integrando para seis hidrogênios cada, correspondentes a quatro metilas. Também verificou-se a presença de cinco multipletos em H 2,41-2,25, 1,931,84, 1,79-1,72, 1,69-1,65, 1,31-1,24, todos integrando para 1H; houve também, um duplo dupleto em H 1,02-0,95 (J1 = 3,3, J2 = 10,2), integrando para 1H. 6 4 1 O 11 12 9 13 O 10 14 18 N O 15 20 2 N 1000 2.0 Figura 16: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 10 em CDCl3. 3.28 2.90 2.93 1.33 3.20 3.38 2.26 3.32 3.11 1.53 1.34 ppm (t1) 1.719 1.691 1.673 1.652 1.399 1.366 1.310 0.871 0.935 1.004 1.210 1.277 1.269 0.922 1.255 1.177 0.899 0.968 1.239 0.823 1.298 0.953 1.022 1.290 1200 1.758 1.741 1.792 1.779 1400 1.843 1.872 1600 1.24 3.0 1.933 1.913 1.896 1800 2.253 2400 2200 2000 Wavenumber (cm-1) 1.12 4.0 2.371 2.361 2.342 2.322 2.302 2.293 2.275 2.410 2.393 2.730 3.864 2600 4.02 5.0 3.897 2800 3.930 3.964 3.999 4.032 4.065 3000 1.12 6.0 4.321 4.100 4.355 4.388 4.422 4.456 3200 1.11 1.00 1.09 7.0 3400 1162 1138 1170 1180 1252 1300 1366 1386 1456 1524 7 3600 1662 1704 1732 8 4.490 15 1022 1114 5 2878 0 2956 2970 3800 4.524 20 996 %Transmittance 40 800 17 18 H 16 19 O 19 1.0 600 Figura 15: Espectro na região do IV do éster 10 (NaCl). 444 640 30 814 25 982 10 3314 7.634 7.631 7.625 7.616 7.269 7.606 4.938 4.927 4.921 4.911 4.888 4.877 4.872 4.861 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 51 55 50 45 35 400 8 9 7 18 10 3.897 3.864 3.964 3.930 4.032 3.999 4.100 4.065 4.355 4.321 4.422 4.388 4.490 4.456 4.524 1 1.366 1.310 1.298 0.968 1.177 0.922 1.004 1.255 1.210 0.871 1.290 0.953 0.823 1.239 0.899 1.277 1.022 0.935 1.269 1.652 1.399 1.691 18 17 O 6 1.673 1.741 1.719 1.779 1.758 1.843 1.792 1.896 1.872 1.933 1.913 2.275 52 2.253 2.302 2.293 2.342 2.322 2.371 2.361 2.410 2.393 3.864 2.730 3.930 3.897 3.999 3.964 4.065 4.032 4.456 4.422 4.388 4.355 4.321 4.100 4.911 4.938 4.888 4.927 4.921 4.877 4.872 4.861 4.524 4.490 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol H 2 12 O 4 11 13 14 N O 15 19 N 20 16 O 19 1.12 1.11 4.50 4.40 4.30 4.20 4.10 4.00 3.90 ppm (t1) 3.28 2.90 2.93 1.33 2.0 3.20 3.38 2.26 3.32 3.11 1.53 1.34 3.0 1.24 1.12 4.0 4.02 1.12 1.11 1.00 5.0 ppm (t1) 1.0 Figura 17: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 10 em CDCl3. A análise do espectro de RMN de 13 C (Figura 18, pág. 53) e do subespectro DEPT-135 (Figura 19, pág. 53) de 10 indicou a presença de 18 sinais de carbono, sendo dois sinais com intensidades bem diferentes, isto fica nítido no espectro DEPT135. Destes, cinco sinais correspondem a carbono metílico, cinco a carbono metilênico, quatro a carbono metínico e quatro a carbono não hidrogenado. Os sinais em C 173,5 (CO), 172,2 (CO) e 154,0 (CO) foram atribuídos a carbono carbonílico e o sinal em C 80,5 foi atribuído a um carbono carbinólico. Os sinais mais intensos em C 22,4 e C 20,8 foram atribuídos a dois carbono metílico cada um. A observação no espectro de RMN de 1H dos sinais em H 7,62, 4,42 e 3,98 que não estão presentes no espectro dos compostos 8 e 9, aliado à presença de dois sinais de carbono metílico em C 22,4 e C 20,8, dois sinais de carbono metínico em C 42,8 e C 45 e três sinais de carbono carbonílico em C 173,5, 172,3 e 154 no espectro de RMN de 13 C, sugeriu um composto totalmente diferente dos compostos 8 e 9. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 53 Procedeu-se, então, a uma análise detalhada dos espectros de RMN 1D e 2D de 10 a 8 9 7 18 10 12 O 4 -0.00000 13.481 18.855 19.718 20.788 22.424 27.173 28.038 29.845 44.972 42.843 36.636 30.478 47.877 48.901 76.402 H 2 1 77.037 18 17 O 6 77.672 80.504 153.976 172.177 173.518 fim de se elucidar a estrutura química do composto obtido. 11 13 14 O N 15 19 N 20 16 O 19 150 100 50 0 ppm (t1) 80 ppm (t1) 70 60 50 40 30 -0.00000 18.854 13.480 20.789 19.718 22.423 27.174 29.844 28.037 30.477 36.637 42.843 44.971 47.857 80.505 Figura 18: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 10 em CDCl3. 20 Figura 19: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 10 em CDCl3. 10 0 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 54 No mapa de correlações HSQC (Figura 20), o sinal em H 4,90 mostrou correlação com o sinal em C 80,5. Esses sinais foram atribuídos a H2 e C2. Os sinais de hidrogênio de H3 a H10 foram atribuídos aos seus respectivos átomos de carbono no mapa de contornos HSQC (Figuras 20 e 21, pág. 55), após comparação com dados de RMN de 13 C descritos na literatura (BRIGGS et al., 1971) para o borneol (Tabela 4, pág. 59). As correlações feitas para os sinais de carbono do anel bicíclico foram: o sinal em C 36,6 (C3) mostrou correlação com sinal em H 2,32 e 0,98 (H3), sinal em C 45,0 (C4) mostrou correlação com sinal em H 1,67 (H4), sinal em C 28,0 (C5) mostrou correlação com sinal em H 1,74 e 1,23 (H5), sinal em C 27,2 (C6) mostrou correlação com sinal em H 1,90 e 1,29, sinal em C 18,8 (C8) mostrou correlação com sinal em H 0,90, sinal em C 19,7 (C9) mostrou correlação com sinal em H 0,87 e, por fim, sinal em C 13,5 (C10) mostrou correlação com sinal em H 0,82 (H10). 10 20 30 C-3/H-3 C-12/H-12 C-13/H-13 C-16/H-16 40 C-17/H-17 50 8 9 7 18 10 6 C-2/H-2 1 4 60 18 17 O H 2 12 O 11 13 14 O N 15 19 N 20 70 16 80 O 19 90 ppm (t1) 5.00 ppm (t2) 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 Figura 20: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 55 A partir dos sinais atribuídos de C1 a C10 procedeu-se a análise do mapa de contornos HMBC (Figuras 22 e 23 págs. 56 e 57) para atribuição dos sinais de carbono restantes na molécula. O sinal em H 4,90 (H2) apresentou correlação com os sinais em C 27,2 (C6) (Figura 22, pág. 56) e C 173,5 (C11) (Figura 23 pág. 57). No mapa de contornos HMBC o sinal em C 173,5 (C11) apresentou correlação com o sinal em H 2,73. O sinal de hidrogênio em H 2,73 também apresentou correlação com um carbono carbonílico em C 172,2 (C14) (Figura 22, pág. 56). No mapa de contornos HSQC foram atribuídos os sinais para os carbonos metilênicos C12 e C13 em H 2,73 (Figura 21). 8 9 7 18 10 18 6 1 4 10 17 O H 2 12 O 11 13 14 O N 15 19 N 20 C-10/H-10 16 C-8/H-8 O 19 20 C-9/H-9 C-18/H-18 C-19/H-19 C-6/H-6 C-5/H-5 C-6/H-6 C-5/H-5 30 C-12/H-12 C-13/H-13 C-3/H-3 C-3/H-3 40 C-4/H-4 50 ppm (t1) 2.50 2.00 1.50 1.00 ppm (t2) Figura 21: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 56 No mapa de contornos HMBC, o sinal do carbono carbonílico em C 172,2 (C14) apresentou correlação com o sinal em H 4,42 (H17). O sinal de hidrogênio H17 também apresentou correlações com um carbono metílico em C 20,8 (C18) e com um carbono não hidrogenado em C 154,0 (C15) (Figura 22). No mapa de contornos HSQC foi atribuído o sinal para H18 em H 1,38 (Figura 21, pág. 55) e para o carbono metínico C17 em C 47,9. No mapa de contornos HMBC, o sinal em H 3,98 (H16) correlacionou-se com o sinal do carbono metílico em C 22,4 (C19) (Figura 22). No mapa de contornos HSQC foram atribuídos os sinais para H19 em H 1,19 e para o carbono metínico C16 em C 42,8 (Figura 21, pág. 55). 0 H-6/C-5 H-2/C-6 H-17/C-18 H-16/C-19 H-12/C-13 H-13/C-12 50 H-5/C-6 8 9 7 18 10 18 6 1 4 100 17 O H 2 12 O 11 13 14 O N 15 19 N 20 16 O 19 150 H-17/C-15 H-17/C-14 H-12 e H13/ C-11 e C-14 ppm (t1) 5.0 ppm (t2) 4.0 3.0 2.0 1.0 Figura 22: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 57 No mapa de contornos COSY (Figura 24, pág. 58), o sinal de hidrogênio em H7,62 (H20) apresentou correlação com o sinal em H3,98 (H16). O sinal de hidrogênio em H4,90 (H2) apresentou correlação com os sinais de hidrogênio em H2,32 (H3) e H0,98 (H3). O sinal em H4,42 (H17) apresentou correlação com o sinal em H1,38 (H18). O sinal de hidrogênio em H3,98 (H16) apresentou correlação com o hidrogênio em H1,19 (H19). O sinal de hidrogênio em H2,32 (H3) apresentou correlação com o sinal de hidrogênio em H1,67 (H4). 165.0 8 9 7 18 10 18 17 O 6 1 4 H 2 12 O 11 13 14 O N 15 19 N 170.0 20 16 O 19 H-17/C-14 H-2/C-11 175.0 ppm (t1) 4.90 4.80 4.70 4.60 4.50 4.40 ppm (t2) Figura 23: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 10 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 58 0.0 H-2/H-3 H-16/H-19 H-2/H-6 H-17/H-18 1.0 H-3/H-4 2.0 H-2/H-3 3.0 4.0 H-20/H-16 5.0 6.0 7.0 8.0 ppm (t1) 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm (t2) Figura 24: Mapa de contornos COSY (400 MHz) do composto 10 em CDCl3. Devido ao alto valor de deslocamento do hidrogênio H20 ( H7,62), ao desdobramento do seu sinal no espectro de RMN de 1H (sinal largo) e bem como o fato do seu sinal não apresentar correlação com nenhum carbono no mapa de contornos HSQC, pode-se inferir que H20 está ligado a um átomo de nitrogênio. Assim, após análise dos espectros de RMN 1D e 2D do composto 10, chegou-se nos seguintes fragmentos do produto: 8 9 7 H 10 18 O 6 1 4 18 17 2 O 11 12 13 14 ? O Figura 25: Fragmentos do composto 10. 15 O N 20 19 16 19 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 59 Através da análise dos fragmentos encontrados para o composto 10, observouse que os grupos isopropila presentes nessa molécula só poderiam ter se originado do reagente DIC. Sabendo-se que pode ocorrer o rearranjo do intermediário 1,3 O-acilisouréia, resultando na N-acil-isouréia (Esquema 2, pág. 37), foi proposta a estrutura abaixo para o composto 10 (Figura 26), que está de acordo com todos os dados de RMN encontrados. 8 9 7 18 10 18 17 O 6 1 H 2 O 4 11 12 13 14 O N 15 19 N 20 O 16 19 Figura 26: Estrutura proposta para o composto 10. Tabela 4: Dados de RMN 1D e 2D (400 MHz, CDCl3) do composto 10 e comparação com dados de RMN 13C do borneol Nº Borneol Composto 10 Tipo de carbono 1 47,8 47,9 C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 77,3 38,7 44,9 28,1 25,7 49,3 18,5 20,0 13,1 80,5 36,6 45,0 28,0 27,2 48,9 18,8 19,7 13,5 173,5 29,8 30,5 172,2 154,0 42,8 47,9 20,8 22,4 CH CH2 CH CH2 CH2 C CH3 CH3 CH3 C CH2 CH2 C C CH CH 2CH3 2CH3 H HMBC COSY 4,94-4,86 2,41-2,25; 1,02-0,95 1,69-1,65 1,79-1,72; 1,31-1,24 1,93-1,84; 1,31-1,24 6 3 5 0,90 0,87 0,82 2,73 2,73 3,98 4,42 1,38 1,19 11, 13, 14 12, 14 19, 20 18, 15, 14 17 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 60 Foi observado que o aumento no tempo de irradiação para 5 minutos (Condição 7, Tabela 3, pág. 45) também forneceu 2 produtos, ambos com 17% de rendimento. Um dos produtos apresentou Rf maior que o borneol e, após a caracterização através de RMN de 1H, 13 C e DEPT135, pode-se concluir que se tratava do composto 9. O segundo composto, apresentou Rf menor que o borneol e após comparação com dados de RMN de 1H, 13 C e DEPT-135 verificou-se que o produto era correspondente ao composto 10. Portanto, um aumento no tempo de radiação aumentou a proporção do produto dissubstituído em relação ao produto obtido por rearranjo. Isto possivelmente ocorre, pois, o aumento no tempo de irradiação favorece uma maior dispersão do DMAP no meio reacional, o que diminui a ocorrência de reações paralelas. 1.2.3 Síntese e caracterização dos ésteres aromáticos Na síntese dos ésteres aromáticos foram utilizados nove ácidos, sendo oito com anel arila, contendo diferentes substituintes doadores e retiradores de densidade eletrônica no anel, e um com anel piridímico. A partir destes ácidos sintetizou-se 10 compostos. Os rendimentos obtidos para os ésteres variaram de 10 a 84%, utilizandose DIC/DMAP sem IMO (Tabela 1, pág. 41). Quando foi utilizada a metodologia do cloreto de tionila, os rendimentos foram muito inferiores (3 a 35%). O Uso de DIC/DMAP com IMO forneceu bons rendimentos (6 a 81%) e menor tempo de reação (3 e 5 minutos) quando comparados com cloreto de tionila (17 a 100 horas) e DIC/DMAP sem IMO (1 a 96 horas). Os ésteres aromáticos foram caracterizados por espectroscopia 1 Infravermelho (IV), Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de H, no 13 C, subspectro DEPT135, ponto de fusão (quando aplicado) e espectrometria de massas de alta resolução. Os sinais característicos do espectro no IV e de RMN que comprovaram a formação dos produtos estão descritos na Tabela 5 (pág. 61) e se caracterizam por: a) deslocamento do sinal do hidrogênio (H2) ligado ao carbono carbinólico do borneol para região mais desblindada do espectro; Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 61 b) aparecimento no espectro de RMN de 1H dos sinais correspondentes aos hidrogênios do anel aromático; c) aparecimento do espectro de RMN de 13 C dos sinais correspondentes ao carbono carbonílico do éster (~166 ppm) e os sinais correspondentes aos carbonos aromáticos; d) presença de uma banda intensa no espectro no IV, referente ao estiramento da ligação C=O de éster (~1710 cm-1). Tabela 5: Dados de RMN e de IV dos ésteres 11 – 20 RMN de 1H RMN de 13C IV H (ppm) C (ppm) (cm-1) H-C-O C=O C=O 11 5,16-5,08 (ddd) 166,8 1714 12 5,13-5,05 (ddd) 166,6 1712 13 4,85-4,80 (m) 156,3 1708 14 5,13-5,06 (ddd) 166,6 1710 15 5,12-5,07 (m) 166,4 1708 16 5,27-5,20 (m) 162,7 1723 17 5,28-5,23 (m) 168,3 1710 18 5,19-5,12 (ddd) 165,5 1718 19 5,10-5,02 (ddd) 166,9 1681 20 5,11-5,03 (ddd) 164,5 1722 Composto Na síntese dos ésteres aromáticos também foi verificada a formação de subproduto quando se utilizou irradiação de micro-ondas para obtenção do éster derivado do ácido p-metoxibenzoico. De acordo com a Tabela 6 (pág. 62), quando se utilizou a temperatura de 70 °C (Condição 4), foi verificada a formação de mais de um produto (Esquema 6, pág. 62). Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 62 8 + HO 3 OH OMe O 3 DIC DMAP (cat) 5 min IMO 70°C 9 7 6 10 O 13' 2 1 O 4 + 14' 11 15 13 12 14 13 13% de rendimento OMe 16 15% de rendimento Esquema 6: Reação de obtenção do derivado do ácido p-metoxibenzoico. Tabela 6: Condições de reação usada na tentativa de obtenção do éster derivado do ácido p-metoxibenzoico Condição Solvente Tempo Temp. Metodologia Borneol (mmol) Ácido Rend. Produto (mmol) (%) 1 CH2Cl2 24 h T. a. DIC/DMAP 1 3 30 12 2 Tolueno 31 h Refluxo SOCl2 1 3 5 12 3 - 3 min 130 °C 1 3 56 12 4 - 5 min 70 °C 1 3 15 e 13 12 e 13 5 - 5 min 130 °C 1 3 50 12 DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO DIC/DMAP com MO No espectro de RMN de 1H do produto majoritário (12) (Figura 27, pág. 63) verificou-se a presença de um duplo dupleto duplo em H 5,13-5,05 (J1 = 2,2, J2 = 3,2, J3 = 10), integrando para um hidrogênio, atribuído ao hidrogênio do carbono carbinólico (H2). Em H 8,02 (J = 9 Hz), observou-se um dupleto, integrando para dois hidrogênios, o qual corresponde aos hidrogênios do anel aromático (H13 e H13’). Em H 6,93 (J = 8,8 Hz), verificou-se a presença de um dupleto, integrando para dois hidrogênios, que foi atribuído aos hidrogênios H14 e H14’ do anel aromático. O simpleto em H 3,86, integrando para três hidrogênios, corresponde aos hidrogênios H16 do grupo metoxila. O espectro de RMN de 13 C (Figura 85, pág. 129) revelou a presença de dezesseis sinais, sendo dois destes sinais com maior intensidade, e o subespectro de 13 C DEPT135 (Figura 86, pág. 130) mostrou a presença de onze sinais. Assim, a Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 63 molécula apresentou quatro sinais correspondentes a carbono metílico, três a carbono metilênico, quatro a carbono metínico e cinco a carbono não hidrogenado. Portanto, a análise dos espectros não deixaram dúvidas quanto a obtenção do produto desejado 1.388 1.349 1.317 1.308 1.288 1.256 1.222 1.152 1.134 1.083 1.066 0.907 0.964 1.453 1.442 1.725 1.635 5.052 1.774 1.747 5.078 5.068 5.063 1.813 1.795 5.102 5.128 5.117 5.112 1.849 1.834 2.057 1.880 2.112 2.086 2.150 7.261 6.950 6.906 1.00 2.10 2.13 8 2.130 2.404 2.383 2.193 2.432 2.422 2.472 2.452 8.039 7.994 2.500 2.491 2.540 2.522 3.862 12. 9 7 6 10 1 8.00 O 7.50 7.00 ppm (t1) 5.150 5.100 5.050 5.000 ppm (t1) 13' 2 O 14' 11 4 15 13 14 OMe 16 6.02 3.15 1.43 1.50 1.20 1.38 2.00 1.12 2.50 0.95 3.00 1.09 1.06 3.14 3.50 1.00 ppm (t1) Figura 27: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 12 em CDCl3. Após a obtenção dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT135 (Figuras 28, 29 e 30, págs. 64 e 65) do composto obtido com menor rendimento (13), observou-se que estes não apresentavam sinais correspondentes aos hidrogênios e carbono aromáticos; no entanto, apresentavam os sinais referentes ao borneol esterificado, indicando a formação de um subproduto. No espectro de RMN de 1H de 13 (Figura 28, pág. 64) observou-se a presença de um multipleto em H 3,91-3,68, integrando para um hidrogênio, cujo sinal não era compatível com a estrutura esperada de 12. Verificou-se um dupleto em H 1,16 (J = 6,4 Hz), integrando para seis hidrogênios, indicando a presença de duas metilas. Também se observou a presença um sinal largo em H 4,48, integrando para um hidrogênio e a ausência do sinal dos hidrogênios do anel aromático e da metoxila. 50 18.854 13.462 19.747 23.108 27.218 1.50 13' H 1.819 1.887 1.849 1.945 2.258 2.278 2.305 2.326 2.344 2.372 2.395 2.411 3.683 3.714 3.747 3.781 3.815 3.848 3.881 3.908 4.489 4.483 4.851 4.813 4.803 1.035 0.981 0.966 0.902 0.863 0.845 1.051 1.146 1.178 1.228 1.256 1.634 1.654 1.674 1.707 1.728 2.70 3.00 2.88 2.00 1.33 100 2.50 6.15 3.00 2.37 3.50 12 28.113 N 36.886 14 45.015 43.080 2 1.795 1.791 1.748 13 1.26 4.00 11 47.770 4 O 48.798 1 76.365 O 0.85 150 9 1.18 4.50 10 77.000 7 77.635 8 1.01 Figura 29: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 13 em CDCl3. ppm (t1) 79.932 6 1.02 0.98 1.00 156.332 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 64 ppm (t1) 1.00 Figura 28: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 13 em CDCl3. 0 13.450 19.740 18.847 23.104 28.108 27.214 36.882 45.013 8 65 43.076 79.932 Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 9 7 10 13 O 6 1 4 2 O 11 14 N 12 13' H 80 ppm (t1) 70 60 50 40 30 20 10 Figura 30: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 13 em CDCl3. A análise do espectro de RMN de 13 C (Figura 29, pág. 64) e do subespectro DEPT135 (Figura 30) de 13 indicou a presença de apenas treze sinais de carbono. Destes, quatro sinais correspondem a carbono metílico, três a carbono metilênico, três a carbono metínico e três a carbono não hidrogenado. O sinal intenso em C 23,11 foi atribuído a dois carbonos metílicos. Como os dados dos espectros de RMN de 1H e de 13 C indicavam a formação de um éster diferente do já obtido (composto 12), procedeu-se a uma análise detalhada dos espectros de RMN 1D e 2D de 13 a fim de se elucidar a estrutura química do composto. Os sinais de carbono de 1 a 10 foram atribuídos por comparação com o material de partida (borneol) e estão descritos na Tabela 7 (pág. 71). Observou-se que o composto 13 apresentou apenas 13 sinais de carbono, sendo dez correspondentes ao anel bicíclico. Os sinais de hidrogênio de H1 a H10 foram atribuídos aos seus respectivos átomos de carbono no mapa de contornos HSQC, uma vez que os sinais de carbono do borneol já eram conhecidos. No mapa de correlações HSQC (Figura 31 e 32, págs. 66 e 67), o sinal em H 4,82 mostrou correlação com o sinal em C 79,9. Esses sinais foram atribuídos a H2 e Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 66 C2. O sinal em C 36,9 (C3) mostrou correlação com sinal em H 2,32 e 1,01 (H3), sinal em C 45,0 (C4) mostrou correlação com sinal em H 1,65 (H4), sinal em C 28,1 (C5) mostrou correlação com sinal em H 1,75 e 1,24 (H5), sinal em C 27,2 (C6) mostrou correlação com sinal em H 1,88 e 1,24, sinal em C 18,8 (C8) mostrou correlação com sinal em H 0,90 (H8), sinal em C 19,7 (C9) mostrou correlação com sinal em H 0,86 e, por fim, sinal em C 13,5 (C10) mostrou correlação com sinal em H 0,84 (H10). 10 20 C-6/H-6 C-5/H-5 C-3/H-3 40 C-12/H-12 C-4/H-4 8 9 7 1 4 50 60 10 13 O 6 30 70 2 O 11 14 N 12 13' 80 C-2/H-2 H ppm (t1) 4.50 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 ppm (t2) Figura 31: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 8 67 9 7 10 13 O 6 1 4 10.0 2 O 11 14 N 12 13' C-10/H-10 15.0 H 20.0 C-5/H-5 C-6/H-6 C-13/H-13 25.0 C-6/H-6 30.0 C-5/H-5 35.0 C-3/H-3 40.0 ppm (t1) 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 ppm (t2) Figura 32: Expansão do mapa de contornos HSQC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3. No mapa de contornos HMBC (Figuras 33 e 34, pág. 68), o sinal do carbono em C 156,3 (C11) apresentou correlação com o sinal em H 4,82 (H2). O sinal de hidrogênio H2 também apresentou correlações com um carbono metílico em C 13,5 (C10) e com um carbono metilênico em C 27,2 (C6), conforme esperado. O sinal em H 1,16 (H13 e H13’) correlacionou-se com o sinal do carbono metílico em C 23,1 (C13 e C13’) e com o sinal do carbono metínico em C 43,1 (C12). Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 68 H-2/C-10 H-2/C-6 50 8 9 7 10 13 O 6 H-10/C-2 2 1 11 O 4 14 N 100 12 13' H 150 H-2/C-11 ppm (t1) 5.0 ppm (t2) 4.0 3.0 2.0 1.0 Figura 33: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3. 10 H-9/C-8 20 H-10/C-8 H-13'/C-13 H-13/C-13' 30 40 H-13/C-12 H-8/C-1 50 H-10/C-1 ppm (t1) H-10/C-2 1.30 ppm (t2) 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 0.70 Figura 34: Expansão do mapa de contornos HMBC (400 MHz) do composto 13 em CDCl3. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 69 No mapa de contornos COSY (Figura 35), o sinal de hidrogênio em H4,48 (H14) apresentou correlação com o sinal em H3,80 (H12) e este último por sua vez, correlacionou-se com os sinais da metila H13 e H13’ (H 1,16). O sinal de hidrogênio em H4,82 (H2) apresentou correlação com os sinais de hidrogênio em H 2,32 (H3) e 1,01 (H3). O sinal de hidrogênio em H2,32 (H3) apresentou correlação com o hidrogênio em H1,65 (H4). 0.0 H-2/H-3 1.0 H-12/H-13 e H-13' H-3/H-4 2.0 H-2/H-3 8 9 7 10 6 1 2 O 4 3.0 13 O 11 14 N 12 13' 4.0 H-14/H-12 H 5.0 ppm (t1) 5.0 ppm (t2) 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 Figura 35: Mapa de contornos COSY (400 MHz) do composto 13 em CDCl3. O sinal largo em H 4,48 (H14) corresponde a hidrogênio ligado a átomo de nitrogênio, uma vez que este sinal não apresenta correlação com nenhum carbono no mapa de contornos HSQC. Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 70 Após a análise dos mapas de contornos HSQC, HMBC e COSY foi possível definir a estrutura abaixo, do composto 13. 8 9 7 10 13 O 6 2 1 4 14 11 O N 12 13' H Figura 36: Estrutura proposta para o composto 13. A formação deste produto só pode ser justificada pela presença de água residual na reação. O intermediário 6 pode ter sofrido um ataque nucleofílico pelo borneol no carbono nitrogenado (altamente eletrofílico), originado o composto A (Esquema 7). Em seguida, há prototropismo e eliminação do ácido, conduzindo a formação do composto B, que por sua vez sofre hidrólise, levando a formação do composto C. Após a transferência de próton (prototropismo) neste intermediário, ocorre eliminação de isopropilamônio D e formação do éster 13. H R 1 R OH O O NH N C O R NH C NH NH pt R O 6 C NH O R1 H O O O R1 RCOOH -RCOOH A H NH O C 1 R pt O H H C R1 NH NH NH O O H2O N H O 1 R O R C HN Composto 13 HN H H C O 1 C + H3N D Esquema 7: Proposta de mecanismo para formação do composto 13. B Capítulo 1: Síntese dos ésteres do borneol 71 O composto 13 também foi obtido na reação com ácido 3,5-dinitrobenzoico com 17% de rendimento e com o ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico, com 12% de rendimento (Tabela 1, pág. 41). Tabela 7: Dados de RMN 1D e 2D (400 MHz, CDCl3) do composto 13 e comparação com dados de RMN 13C do borneol Nº Borneol Composto 13 Tipo de carbono 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 47,8 77,3 38,7 44,9 28,1 25,7 49,3 18,5 20,0 13,1 47,8 79,9 36,9 45,0 28,1 27,2 48,8 18,8 19,7 13,5 156,3 43,1 23,1 C CH CH2 CH CH2 CH2 C CH3 CH3 CH3 C CH 2CH3 H HMBC COSY 4,85-4,80 2,41-2,26; 1,01 1,67-1,63 1,79-1,71; 1,25-1,23 1,88; 1,25-1,23 6, 10, 11 3 4 0,90 0,86 0,84 1 8 1, 8 3,91-3,68 1,16 13, 13’, 12 13, 13’ 14 Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 72 2 ESTUDO DA ATIVIDADE BIOLÓGICA 2.1 Introdução Geral Os ésteres derivados do borneol foram submetidos aos seguintes estudos de atividade biológica:  atividade antimicrobiana (antibacteriana e antifúngica);  atividade antiproliferativa;  atividade anti-inflamatória;  atividade leishmanicida. Para os testes realizados, não foram avaliadas as atividades de todos os ésteres, uma vez que os ensaios foram realizados de acordo com a disponibilidade dos laboratórios parceiros. Assim, muitas substâncias ainda não haviam sido sintetizadas e/ou caracterizadas, e por isso não foram enviadas para os estudos de atividade biológica. As estruturas, os rendimentos e as metodologias utilizadas para a obtenção dos compostos testados estão descritos na Parte Experimental, item 1.1.3, pág. 16. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 73 2.2 Atividade Antimicrobiana 2.2.1 Introdução As infecções bacterianas e fúngicas são responsáveis por um enorme número de doenças e encargos sociais. Há milhões de pessoas afetadas por doenças infecciosas atribuídas a bactérias e fungos em todo o mundo (DANISHUDDIN et al., 2012). O grande marco no tratamento das infecções bacterianas ocorreu com a descoberta da penicilina, em 1928, por Alexander Fleming. Entretanto, o seu uso como agente terapêutico somente foi introduzido nos anos 1940. Após o processo de industrialização da penicilina, especialmente em consequência da Segunda Guerra Mundial, foi observado um rápido crescimento na descoberta e desenvolvimento de novos antibióticos (sintéticos e naturais) (WHO, 2013c; GUIMARÃES et al., 2010). Diversos antibióticos foram descobertos no período de 1940 a 1960. A maior parte foi obtida a partir de triagens de produtos naturais, como os -lactâmicos (cefalosporina), aminoglicosídeos (estreptomicina), tetraciclinas (clortetraciclina), macrolídeos (eritromicina), entre outros. Neste mesmo período, apenas três derivados sintéticos foram introduzidos no mercado: isoniazida, trimetropim e metronidazol (GUIMARÃES et al., 2010). O período de 1960 a 1980 foi marcado pela entrada no mercado dos antibióticos semi-sintéticos, análogos aos antibióticos naturais já existentes. A maioria deles foram obtidos a partir de protótipos naturais microbianos, como derivados -lactâmicos (análogos de penicilina e cefalosporina, ácido clavulânico, aztreonam), análogos da tetraciclina e derivados aminoglicosídicos (gentamicina, tobramicina, amicacina). (FERNANDES, 2006; GUIMARÃES et al., 2010). A partir dos anos 1980 houve uma redução na identificação de novos protótipos antibióticos. Muitas publicações recentes têm documentado o fato de que, apesar dos problemas crescentes relacionados à resistência dos agentes patogênicos aos antimicrobianos, o número de novos antibióticos introduzidos no mercado tem mostrado uma queda acentuada ao longo das últimas décadas, com apenas cinco Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 74 novos agentes antibacterianos aprovados para uso clínico nos EUA entre 2003 e 2007 (MOELLERING JR, 2011). A falta de interesse dos grandes laboratórios farmacêuticos em agentes antibacterianos está relacionada a inúmeros fatores, incluindo a diversidade de antimicrobianos genéricos disponível no mercado, que ainda são considerados primeira opção de terapia por muitas autoridades de saúde pública. Além disso, a duração do tratamento com agentes antibacterianos é limitada, quando comparado a drogas utilizadas para o tratamento do câncer, doenças neurológicas ou cardiovasculares; o que significa uma menor rentabilidade para a indústria farmacêutica. Além disso, algumas doenças, em geral, apresentam medicamentos com preços mais elevados, como é o caso daqueles utilizados no tratamento do câncer (MOELLERING JR, 2011; BUSH et al., 2011). Além do declínio na descoberta de novos fármacos, outro grande problema associado à terapia antimicrobiana é o aumento crescente da resistência dos patógenos. Prescrições de antibióticos inadequados ou desnecessários, o uso excessivo de antibióticos na pecuária e na agricultura e a falta de adesão dos pacientes ao período de tratamento são os principais contribuintes para o surgimento de resistência a antibióticos (GLICKMAN E SAWYERS, 2012; BOLOGA et al., 2013). Devido à crescente ameaça de patógenos multirresistentes há uma necessidade cada vez maior de desenvolver novas terapias para o tratamento de doenças microbianas. Assim, buscando a identificação de novas substâncias com atividade antimicrobiana, os ésteres derivados do borneol foram submetidos a testes frente a diferentes micro-organismos. 2.2.2 Teste antimicrobiano O teste foi realizado pelo grupo da Professora Drª Jacqueline Aparecida Takahashi no Laboratório Biotecnologia e Bioensaios, do Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais. Para a realização dos experimentos foram utilizadas culturas das bactérias Gram-negativas Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e bactérias Gram-positivas Staphylococcus Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 75 aureus (ATCC 25923) e Streptococcus sanguinis (ATCC 49456), e do fungo leveduriforme Candida albicans (ATCC 18804) (Figura 37). Escherichia coli1 Staphylococcus aureus3 Pseudomonas aeruginosa2 Streptococcus sanguinis4 Candida albicans5 Figura 37: Fotos dos micro-organismos avaliados. Fonte:, acesso: 17/01/2014 1 http://www.wired.co.uk/news/archive/2013-04/23/e-coli-fuel 2 http://globalmedicaldiscovery.com/key-scientific-articles/the-effects-of-hyperosmosis-or-high-ph-on-adual-species-biofilm-of-enterococcus-faecalis-and-pseudomonas-aeruginosa-an-in-vitrostudy/attachment/pseudomonas-aeruginosa-bacteria-sem/ 3 http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&id=11181 4 http://stepha.myweb.uga.edu/strepsanguisjpg.jpg 5 http://albicans-candida.blogspot.com.br/2008/11/oi.html 2.2.2.1 Avaliação da atividade antimicrobiana em ensaio de CIM (Concentração Inibitória Mínima) Os testes foram realizados em meio de cultura caldo BHI (Broth Heart Infusion) utilizando placas de 96 micropoços e um leitor de placa de Elisa (492 nm). Avaliou-se a inibição do crescimento dos micro-organismos desafiados comparando a turbidez do Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 76 meio com aquela obtida no meio em que não houve adição dos compostos (controle positivo: inóculo + meio BHI). Utilizou-se concentrações crescentes de cada uma das amostras testadas. 2.2.2.2 Metodologia As amostras foram pesadas e solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO), resultando em uma solução com concentração de 12,5 mg/mL. Pipetaram-se 40 µL desta solução para um frasco contendo 960 µL de meio de cultura BHI (solução de trabalho). Foi preparado um pré-inóculo no qual as bactérias (leveduras) estocadas em tubos de ensaio foram transferidas com alça de platina e inoculadas em tubos de ensaios contendo 3,0 mL de meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion, Infuso de cérebro e coração). Em seguida, os tubos foram incubados em estufa a 37 ºC por 18 h. Com o auxílio de uma micropipeta, 500 µL do pré-inóculo bacteriano foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4,5 mL de água destilada estéril. Os tubos foram homogeneizados e a concentração ajustada comparando-se com o tubo 0,5 da escala de McFarland de turbidez padrão (108 UFC/mL), obtendo-se assim, os inóculos bacterianos utilizados no teste. Os testes foram realizados em placas de 96 micropoços, em triplicata. Em cada poço foram adicionados 100 µL do meio de cultura BHI. No poço 1 foram adicionados também 100 µL da solução de trabalho. Homogeneizou-se a solução e 100 µL foram transferidos para o próximo poço e assim sucessivamente. Desprezaram-se os 100 µL finais. Foram testadas 8 concentrações de cada amostra (500 g, 250g, 125 g, 62,5g, 31,2g, 15,6g, 7,8g, 3,9g). A seguir, 100 µL do inóculo do microorganismo a ser testado foram adicionados a cada poço. Foram realizados dois controles, um para controle de crescimento do micro-organismo, no qual não houve adição da solução de trabalho (para verificar a viabilidade celular) e o branco, em que não se adicionou o inóculo bacteriano (para se eliminar o efeito da coloração da solução de trabalho). Uma placa controle contendo 100 µL de meio de cultura BHI e 100 µL de água destilada estéril foi adicionada ao experimento como de controle de esterilidade do meio de cultura BHI. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 77 As microplacas foram submetidas à primeira leitura em leitor de placa de Elisa (492 nm) imediatamente após a execução do experimento (leitura a 0h). Posteriormente, foram incubadas em estufa a 37 ºC e após 24 h foi realizada nova leitura das mesmas, encerrando o teste. Tabela 8: Amostras utilizadas no teste antimicrobiano Composto Identificação 1 Hexanoato de bornila 2 Octanoato de bornila 3 Decanoato de bornila 4 Dodecanoato de bornila 5 Tetradecanoato de bornila 6 Hexadecanoato de bornila 7 Octadecanoato de bornila 8 Monossuccinato de bornila 9 Succinato de bis-bornila 10 4-{Isopropil[isopropilamino)carbonil]amino}-4-oxobutanoato de bornila 11 Benzoato de bornila 12 4’-Metoxibenzoato de bornila 14 3’,4’-Dimetoxibenzoato de bornila 15 3’,4’,5’-Trimetoxibenzoato de bornila 16 3’,5’-Dinitrobenzoato de bornila 17 3’,5’-Dinitrosalicilato de bornila 18 Nicotinato de bornila 21 Borneol O grau de resistência ou sensibilidade das bactérias e da levedura frente às amostras testadas foi determinado pela presença ou ausência de inibição; quanto maior a inibição, menor a turbidez do meio. Os resultados encontrados para as amostras testadas na leitura de 24 h estão apresentados na forma de Tabela (Tabela 9 pág. 79) onde está descrito os valores de CIM50 (concentração da amostra necessária para inibir 50% do crescimento dos micro-organismos). Os testes foram realizados em triplicata e a percentagem de inibição dos compostos foi calculada a partir da comparação das médias de absorção das amostras com o branco. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 78 2.2.2.3 Resultados e discussão No resultado do teste biológico foi observada a menor concentração dos compostos que inibiu 50% do crescimento do microrganismo (CIM50). Eles estão descritos na Tabela 9 (pág. 79), onde é possível verificar que os melhores resultados (com CIM50 menor) são dos compostos 12, 14 e 15, que correspondem aos ésteres contendo anel benzênico com substituinte doador de densidade eletrônica (grupo metoxila). Logo, pressupõe-se que esse grupo deve ser o responsável pela eficácia do composto contra o micro-organismo. Da série dos ésteres graxos, apenas o composto 4 apresentou atividade, com uma CIM50 igual a 500 g/mL contra Pseudomonas aeruginosa. O composto 10 manifestou CIM50 igual a 500 g/mL para Candida albicans, não mostrando atividade significativa para nenhuma das bactérias testadas. Os compostos 12, 14 e 15 foram os que apresentaram os resultados mais significativos. Para o composto 12 foi observado baixo valor de CIM contra todos os micro-organismos testados. A substância 12 mostrou ter menor valor de CIM contra Streptococcus sanguinis, onde apresentou mesmo valor que a droga de referência (CIM = 62,5 g/mL). Contra Staphylococcus aureus (CIM = 125 g/mL), Escherichia coli (CIM = 250 g/mL) e Candida albicans (CIM = 250 g/mL), também foi observado atividade do composto 12. O composto 14 manifestou mesmo valor de CIM que o controle positivo contra Escherichia coli (CIM = 62,5 g/mL). Para este composto também foi observado atividade contra Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis e Pseudomonas aeruginosa (CIM = 125 g/mL). O composto 15 apresentou resultado promissor contra Escherichia coli (CIM = 250 g/mL). Contra Staphylococcus aureus (CIM = 62,5 g/mL) e Streptococcus sanguinis (CIM = 62,5 g/mL) o composto 15 apresentou o mesmo valor de inibição que a droga de referência. De acordo com os resultados obtidos, foi possível observar que o tamanho na cadeia graxa não exerce influência na atividade biológica, uma vez que os ésteres de cadeia graxa não tiveram resultados satisfatórios no teste realizado. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 79 Tabela 9: Avaliação biológica do borneol e seus ésteres Valores de CIM50 (μg/mL) Amostra S. aureus E. coli P. aeruginosa S. sanguinis C. albicans 1 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 2 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 3 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 4 > 500 > 500 500 > 500 > 500 5 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 6 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 7 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 8 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 9 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 10 > 500 > 500 > 500 > 500 500 11 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 12 125 250 500 62,5 250 14 125 62,5 125 125 125 15 62,5 250 > 500 62,5 > 500 16 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 17 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 18 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 21 > 500 > 500 > 500 > 500 > 500 AMP 62,5 62,5 > 500 62,5 - CIM - - - - 62,5 S. aureus = Staphylococcus aureus (ATCC 25923), E. coli = Escherichia coli (ATCC 25922), P. aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), S. sanguinis = Streptococcus sanguinis (ATCC 49456), C. albicans = Candida albicans (ATCC 18804). AMP = ampicilina (controle positivo para bactérias, exceto P. aeruginosa, pois apresenta resistência), MIC = miconazol (controle positive para C. albicans). Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 80 2.3 Atividade Antiproliferativa 2.3.1 Introdução O câncer é uma doença que se caracteriza pelo crescimento desordenado das células do corpo. Quando estas células sofrem mutações que afetam na regulação da divisão celular, elas passam a se multiplicar de maneira ilimitada, levando a formação de tumores. Essas células em proliferação, consequentemente, se transformam em células malignas, que invadem outros tecidos (metástase) (SAHA E KHUDA-BUKHSH, 2013). Apesar dos avanços significativos na pesquisa biomédica durante as últimas décadas, o câncer continua a ser uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo, com uma probabilidade de prevalência crescente. Estima-se que a incidência de 12,7 milhões de novos casos em 2008 (FERLAY et al., 2010) vai subir para 21,4 milhões de casos em 2030 (WHO, 2011). Assim, é necessário encontrar novos medicamentos e tratamentos para ultrapassar esta projeção. O investimento do Ministério da Saúde na assistência aos pacientes com câncer no Brasil foi de R$ 2,1 bilhões no ano de 2012, crescimento de 26% em relação a 2010. A previsão é que, até 2014, o valor alocado no fortalecimento do atendimento em oncologia chegue a R$ 4,5 bilhões (INCA, 2013a). No Brasil, estima-se que em 2014 haverá 576 mil novos casos de câncer. Destes, a região onde há maior previsão de incidência é a Sudeste, representada por cerca de 300 mil casos (Figura 38, pág. 81). São esperados que 70% dos casos descritos para homens sejam correspondentes a câncer de próstata e 56% dos casos nas mulheres seja de câncer de mama (INCA, 2013b). Por causa dos efeitos secundários observados com múltiplos quimioterápicos de origem sintética, pesquisadores estão se concentrando cada vez mais em medicamentos derivados de produtos naturais. De 1981 a 2010, produtos naturais e seus derivados foram a fonte de 41% de novos medicamentos, destes 79,8% correspondem a drogas aprovadas para o tratamento do câncer (NEWMAN E CRAGG, 2012). Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 81 Entre as substâncias derivadas de produtos naturais aprovadas para o tratamento do câncer está o paclitaxel (Taxol®, Figura 39), um derivado terpenoide obtido a partir das cascas do caule de espécies de Taxus (LI E VEDERAS, 2009). O paclitaxel é empregado em tratamentos de neoplasias como o câncer de mama e de ovário (AJIKUMAR et al., 2008). Outra substância utilizada é a vincristina (Oncovin®), um alcaloide obtido da planta Catharanthus roseus que, atualmente, é de grande utilidade no tratamento de linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário, testículos e leucemia (BRANDÃO et al. 2010) Incidência em homens Incidência em mulheres Figura 38: Estimativa de incidência de câncer no Brasil em 2014 por região. Fonte: MS/INCA/ Estimativa de Câncer no Brasil, 2013. Figura 39: Medicamento Taxol® (Paclitaxel). Fonte: https://ttc.nci.nih.gov/about/success_taxol.php. Acesso em: 18/01/2014. Muitos estudos mostram que vários monoterpenos são eficazes na prevenção e tratamento de câncer. Entre estes, os monoterpenos monocíclicos D-limoneno e o Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 82 álcool perílico são conhecidos por inibir o desenvolvimento do câncer de mama, fígado, pele, pulmão e cólon. Monoterpenos, tais como carveol, uroterpenol, e sobrerol mostraram atividade contra carcinomas mamários. (AJIKUMAR, et al. 2008). Devido à relativa semelhança entre as células malignas e as células normais do corpo, o grande desafio para o tratamento do câncer é a busca de medicamentos que apresentem seletividade para células tumorais. Assim, como não existem estudos que relatem o efeito de ésteres de borneol contra células cancerígenas, decidiu-se testar estas moléculas e avaliar o seu potencial. 2.3.2 Teste antiproliferativo Os testes de atividade antiproliferativa foram realizados pelo grupo de pesquisa da Dra. Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz, do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Unicamp. Foram avaliados nove compostos frente a seis linhagens de células cancerígenas: MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário resistente a múltiplos fármacos), 786-0 (rim), OVCAR-3 (ovário), HT29 (colorretal), K562 (medula óssea) e uma linhagem de célula humana normal: HaCaT (queratinócito). Os compostos foram testados em quatro concentrações distintas (0,25; 2,5; 25 e 250 g/mL) e a doxorrubicina (DOX) foi empregada como controle positivo (DOX 0.25– 250 μg/mL). A proliferação celular foi determinada através da quantificação do conteúdo protéico das amostras através de um teste com sulforrodamina B (MONKS et al., 1991). Em cada avaliação foram realizadas medidas espectrofotométricas no tempo zero (T0; início da incubação) e 48 horas após a incubação, tanto das células-controle (C; não-tratadas) quanto das células expostas aos compostos-teste (T). A proliferação celular foi determinada empregando-se a equação 100x[(T-T0)/(C-T0)]. Os resultados do teste são apresentados em forma de gráfico de porcentagem de crescimento em função da concentração da amostra testada, para cada uma das linhagens de células testadas. As concentrações efetivas denominadas GI50 (do inglês growth inhibition, concentração necessária para interromper em 50% o crescimento celular), foram calculadas para todas as amostras através da regressão não linear, utilizando-se software Origin (SHOEMAKER, 2006). Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 83 2.3.2.1 Resultados e discussão O ensaio antiproliferativo permite avaliar a atividade antitumoral através da exposição de células tumorais humanas, em fase exponencial de crescimento, a diferentes concentrações da amostra e verificar se essa exposição induziu uma interrupção na taxa de crescimento sem morte celular (atividade citostática, valores positivos no gráfico) ou se provocou a morte celular (atividade citotóxica, valores negativos no gráfico). São considerados seletivos os compostos que apresentarem comportamento diferenciado sobre uma determinada linhagem celular em detrimento das demais testadas. Na Tabela 10 (pág. 84) estão descritos os valores de GI50 determinados para os compostos testados. Os compostos 5, 6, 7 e 16 não apresentaram efeito relevante contra nenhuma das linhagens de células testadas (GI 50 > 250 μg/mL). Os derivados 2, 11 e 15 foram mais seletivos contra K562. O composto 11 foi 9 vezes mais potente para linhagem de célula cancerígena (K562) do que para célula humana normal (HaCaT). O éster 15 foi o derivado mais potente para todas as linhagens de células avaliadas. Como pode ser observado na Tabela 10, ele foi 2,4 vezes mais potente do que a droga de referencia DOX em inibir o crescimento de células NCI-ADR/RES e 120 vezes menos seletivo do que a DOX para a linhagem de células humanas normais (HaCat). Isto mostra uma maior seletividade do composto 15 para a célula cancerígena. Uma comparação entre o composto 11 e o borneol contra as células NCIADR/RES e 786-0 mostra que o composto não esterificado (borneol) foi inativo, porém a introdução de anel aromático na sua estrutura resultou em um aumento de 4 vezes na sua atividade antiproliferativa. Quando comparamos o composto 11 com o composto 15, que apresenta grupos doadores de densidade eletrônica no anel aromático (-OMe), verificamos um aumento de 9 vezes na atividade contra as células cancerígenas. Na Figura 40 (págs. 84 e 85) são mostrados os gráficos da porcentagem de crescimento celular após 48 horas de incubação das células cancerígenas com os compostos-teste. Os compostos 1, 5, 6, 7 e 16 apresentaram somente efeito citostático Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 84 contra todas as linhagens de células em todas as concentrações empregadas. Diferentemente, os ésteres 2, 11 e 15 apresentaram efeitos citotóxicos na concentração de 250 mg/mL para algumas linhagens estudadas (Figuras 39; págs. 8485). Tabela 10: Valores de concentração (GI50 em μg/mL) necessários para inibir a proliferação de células em 50% Linhagem a Celular DOX b Borneol Éster 1 Éster 2 Éster 5 Éster 6 Éster 7 Éster 11 Éster 15 Éster 16 MCF-7 0,044 >250 7,4 29,2 >250 >250 >250 25,3 18,1 >250 NCIADR/RES 6,7 >250 250 25,7 >250 >250 >250 26,1 2,8 >250 786-0 0,092 >250 >250 29,4 >250 >250 >250 25,3 3,1 >250 OVCAR-3 0,27 5,3 19,7 25,4 >250 >250 >250 26,6 3,0 >250 HT29 0,26 111,5 >250 108,4 >250 >250 >250 12,1 8,5 >250 K562 0,31 83,7 10,2 9,5 >250 >250 >250 2,8 2,6 >250 HaCat 0,040 >250 17,0 26,6 >250 >250 >250 25,9 4,8 >250 a Células tumorais: MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 786-0 (rim); OVCAR-3 (ovário); HT-29 (colorretal); K562 (medula óssea). Célula normal: HaCat (queratinócitos); b Controle positivo. A2 A3 100 100 75 50 Growth Percentage Growth Percentage 75 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 10 -3 10 -2 10 Composto 1 50 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -1 0,25 10 0 2,5 10 1 25 Concentration (g/mL) 10 2 250 10 -3 10 -2 10 Composto 2 -1 0,25 10 0 2,5 10 1 Concentration (g/mL) 25 10 2 250 85 A5 A4 100 100 75 75 50 50 Growth Percentage Growth Percentage Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 10 -3 10 -2 10 Composto 5 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -1 0,25 10 0 2,5 10 1 25 10 2 250 10 -3 10 -2 Composto 6 10 Concentration (g/mL) -1 0,25 10 0 2,5 10 1 25 10 2 250 Concentration (g/mL) A1 A7 100 100 75 50 Growth Percentage Growth Percentage 75 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 10 -3 10 -2 10 Composto 7 50 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 -1 0,25 10 0 2,5 10 1 25 10 2 250 10 -3 10 -2 10 A6 A8 100 100 75 75 50 50 25 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -75 -100 10 -3 10 -2 10 Composto 15 0 MCF7 NCI/ADR-RES 786-0 OVCAR-3 HT29 K-562 HaCaT -25 -50 -100 10 0 2,5 10 1 Concentration (g/mL) 25 10 0 2,5 10 1 25 10 2 250 25 -75 -1 0,25 -1 0,25 Concentration (g/mL) Growth Percentage Growth Percentage Concentration (g/mL) Composto 11 10 2 250 10 -3 10 -2 10 Composto 16 -1 0,25 10 0 2,5 10 1 25 10 2 250 Concentration (g/mL) Figura 40: Efeito do borneol e seus ésteres na proliferação de células tumorais humanas. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 86 2.4 Atividade Anti-inflamatória 2.4.1 Introdução A inflamação é uma reação do organismo a infecções e danos teciduais. Quando não há um equilíbrio entre os efeitos benéficos da cascata inflamatória e o seu potencial para destruição de tecidos, pode ocorrer o desenvolvimento de doenças, tais como: a asma crônica, artrite reumatóide, esclerose múltipla e psoríase (SIMMONS, 2006). As principais drogas utilizadas clinicamente são os fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (AINEs) e os corticóides. Mesmo sendo as drogas mais comumente utilizadas em doenças inflamatórias, os AINEs podem causar efeitos adversos graves no trato gastrointestinal, além de insuficiência renal e broncoespasmos (RANG et al., 2007). Na maior parte, eles atuam inibindo a atividade de ciclo-oxigenases (COX-1 e COX-2), inibindo assim a síntese de prostaglandinas (PG) e tromboxano (TX) (VASCONCELOS, et al., 2012). Na literatura são descritos diversos monoterpenos com atividade antiinflamatória, como linalol e seu éster acetato de linalila (PEANA et al., 2002). Recentemente, Vasconcelos e colaboradores (2012) descreveram a atividade antiinflamatória de um éster derivado do borneol (salicilato de bornila). Foi mostrado que o éster sintetizado apresentou propriedades anti-inflamatórias, como: redução na produção de mediadores eicosanoides, inibição da via da bradicinina e redução dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-1β e IL-6), sem interferir nos níveis de IL-10. O éster também reduziu a migração dos neutrófilos para o foco inflamatório, através de redução da síntese de NO (óxido nítrico) pelos macrófagos. Contudo, não existem relatos da atividade anti-inflamatória de outros ésteres do borneol. Assim, decidiu-se investigar a atividade do borneol e de 10 derivados como potenciais agentes anti-inflamatórios. Para avaliar a atividade dos ésteres foi realizado o estudo de edema de pata em camundongos, que utiliza como agente inflamatório a carragenina. A resposta edematogênica é um dos sinais do processo inflamatório decorrente do aumento da Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 87 permeabilidade vascular, que ocorre na microcirculação, devido à ação dos mediadores liberados (RANG et al., 2007). A carragenina é um polissacarídeo extraído de algas, que induz resposta inflamatória local mensurável. É o modelo de edema de pata mais utilizado para se avaliar o efeito anti-inflamatório de drogas. Apresenta duas fases inflamatórias e uma terceira não característica. Na primeira hora, logo após injeção da carragenina, há aumento da permeabilidade vascular mediada por histamina e serotonina. Na segunda hora, o aumento da permeabilidade é resultado da liberação de cininas. Na terceira hora, o aumento da permeabilidade vascular ocorre devido à ação das prostaglandinas (DI ROSA, GIROUD e WILLOUGHBY, 1971). 2.4.2 Teste anti-inflamatório Inicialmente, avaliou-se a atividade anti-inflamatória de 10 ésteres sintetizados e do borneol. A indometacina, um conhecido anti-inflamatório, foi empregado como controle positivo. Esses experimentos foram realizados no Laboratório de Fitoquímica e Química Medicinal da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Alfenas, em colaboração com o Professor Dr. Marcelo Henrique dos Santos. 2.4.2.1 Metodologia Para realização do teste foram utilizados camundongos Swiss (25-35g) obtidos no biotério da Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG) e concedidos após aprovação do trabalho pelo Comitê de Ética dessa Instituição (Protocolo 488/2013). Os animais foram tratados com ração comercial e água “ad libitum”, garantida sua adaptação por 7 dias em sala climatizada a 23  2 ºC, com ciclo claro-escuro de 12 h, e em caixas de polipropileno adequadas à sua manutenção. Foram privados de comida durante cerca de 12 horas antes do experimento. Ao término dos experimentos, os animais foram sacrificados por inalação de halotano. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 88 As substâncias testadas foram suspensas em solução de carboximetilcelulose (CMC; 0,5% p/V). A indometacina foi solubilizada em tampão TRIS e solução salina na proporção 1:1. 2.4.2.1.1 Avaliação da atividade anti-inflamatória: edema de pata induzido por carragenina O edema de pata dos animais foi induzido pela injeção de 40 µL de carragenina (2% p/v) em salina estéril e administrada na região subplantar da pata direita de camundongos swiss machos (n = 8). Uma hora antes da injeção de carragenina os animais receberam tratamento com o borneol e seus ésteres (1, 2, 5, 6, 7, 8, 11, 15, 16 e 18). As substâncias testadas foram administrados (v.o.) na dose de 20 mg/kg, ou indometacina (10 mg/kg, v.o.), ou veículo (10 mL/kg de CMC). O volume da pata direita do animal foi determinado antes da administração da carragenina, e após uma, duas, três e quatro horas da administração da carragenina, pela imersão da pata até a região tíbio-társica com o uso de um pletismômetro. Os resultados foram demonstrados através da média e erro padrão da média. Análise de variância (ANOVA) seguida do teste Scott-Knott foi utilizada para medir o grau de significância (p < 0,05). 2.4.2.2 Resultados e discussão Na Tabela 11 (pág. 89) está apresentado o resultado do edema induzido por carragenina. Na primeira hora os compostos 1, 2, 5, 6, 7, 11 e 18 foram capazes de inibir o edema de pata. Na hora 2 os ésteres 1, 2, 11, 16 e a indometacina (controle positivo) reduziram o edema da pata. Já na terceira hora, os ésteres 5, 6, 11 e 18 e a indometacina foram capazes de inibir o edema. Na última hora testada, apenas os compostos 6, 11 e a indometacina apresentaram inibição no edema de pata. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 89 Tabela 11: Média, erro padrão da média e percentual de inibição do edema de pata em relação ao controle negativo (P<0,05) Volume da pata (mL) Tratamento 1h 2h 3h 4h Veículo 0,049±0,004a 0,058±0,007b 0,067±0,006b 0,065±0,010a Borneol 0,038±0,005a (23) 0,051±0,005a (12) 0.055±0,006a (18) 0,055±0,004a (15) Composto 1 0,026±0,006a (47) 0,029±0,006a (49) 0,041±0,005a (39) 0,043±0,05a (33) Composto 2 0,026±0,005a (47) 0,034±0,006a (41) 0,051±0,003a (24) 0,046±0,005a (29) Composto 5 0,028±0,010a (43) 0,052±0,010b (9) 0,038±0,008a (43) 0,053±0,009a (18) Composto 6 0,029±0,007a (41) 0,038±0,007a (34) 0,037±0,009a (44) 0,034±0,010a (47) Composto 7 0,027±0,007a (45) 0,046±0,007b (20) 0,049±0,006a (28) 0,053±0,007a (18) Composto 8 0,037±0,004a (25) 0,062±0,006b (0) 0,057±0,008b (16) 0,053±0,005a (18) Composto 11 0,025±0,007a (49) 0,022±0,005a (63) 0,040±0,007a (41) 0,024±0,004a (63) Composto 15 0,032±0,004a (34) 0,058±0,008b (0) 0,065±0,009b (4) 0,049±0,010a (25) Composto 16 0,031±0,005a (36) 0,033±0,006a (43) 0,048±0,006a (29) 0,042±0,008a (35) Composto 18 0,021±0,006a (57) 0,036±0,004a (37) 0,40±0,005a (41) 0,039±0,009a (39) Indometacina 0,030±0,006a (39) 0,031±0,005 (46) 0,041±0,004a (39) 0,031±0,008a (53) Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de significância de 5%. O número entre parênteses indica o percentual de inibição do aumento do volume em relação ao veículo (controle negativo). Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 90 O borneol e os compostos 8 e 15 não foram capazes de inibir o edema em nenhuma das horas testadas. Já os ésteres de cadeia graxa apresentaram porcentagens de redução do edema bem parecidas nas horas avaliadas, o que indica que o tamanho da cadeia não influenciou na atividade biológica destes compostos. Dentre todos os compostos testados, o composto 11 (benzoato de bornila) foi o éster mais promissor, apresentando porcentagem de inibição do edema maior que a droga referência em todas as horas avaliadas. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 91 2.5 Atividade Leishmanicida 2.5.1 Introdução As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania. Existem três tipos principais de leishmaniose: visceral, muitas vezes conhecida como calazar, que representa a forma mais grave da doença, com aproximadamente 100% de taxa de mortalidade em indivíduos não tratados; leishmaniose cutânea, a forma mais comum, sendo caracterizada por lesões ulcerativas em áreas expostas (braços, pernas, entre outras) e a mucocutânea, compreendendo lesões que destroem parcial ou totalmente a mucosa nasal e oral, gerando deformidades (SOARES-BEZERRA et al., 2004). A doença afeta principalmente pessoas na África, Ásia e América Latina e está associada à desnutrição, deslocamento da população, condições precárias de habitação, sistema imunológico fraco e falta de recursos (WHO, 2013a). Uma análise recente mostra que mais de 98 países e territórios são endêmicos para leishmaniose. Os dez países com as maiores contagens de casos de leishmaniose cutânea são: Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Etiópia, Irã, Peru, Sudão e Síria, e, juntos, representam 70 a 75% da incidência global estimada. No Brasil, apenas no ano de 2012, foram reportados 23.793 novos casos de leishmaniose cutânea (WHO, 2013b). A transmissão da doença para o homem (e também a outros mamíferos) ocorre através da picada de um mosquito-palha, que pertence ao gênero Lutzomia. Parasitas da Leishmania sp. existem sob duas fases morfológicas: uma forma amastigota intracelular, dentro dos fagócitos mononucleares dos hospedeiros mamíferos e uma forma promastigota extracelular, no trato digestivo de seu inseto vetor (MITROPOULOS et al. 2010; ZUCCA E SAVOIA, 2011). Por mais de 60 anos os antimoniais pentavalentes (Sb5+) tem sido os fármacos de primeira escolha no tratamento da leishmaniose, mas o surgimento de cepas resistentes tem limitado a sua utilidade. Alternativamente, a anfotericina B lipossomal, pentamidina, miltefosina e paromomicina (CROFT E COOMBS, 2003) estão Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 92 disponíveis, mas a sua utilização é limitada devido à toxicidade e alto custo do tratamento (CHAWLA E MADHUBALA, 2010). A procura por novas drogas com atividade elevada e específica é muito importante, especialmente nos países onde essa doença constitui um grave problema de saúde pública (DA SILVA MOTA et al., 2009). Assim, buscando a identificação de novas substâncias com atividade leishmanicida, o borneol e seus ésteres foram submetidos a testes frente ao parasita causador da doença. 2.5.2 Teste leishmanicida O teste foi realizado pelo grupo da Professora Drª. Ana Lúcia Teles Rabello do Laboratório de Pesquisas Clínicas do Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz). Na realização dos experimentos foram testados o borneol e 10 ésteres na concentração de 20 μg/mL contra formas amastigotas de Leishmania (L.) amazonensis. 2.5.2.1 Metodologia Formas amastigotas de L. amazonensis (cepa IFLA/BR/196/PH-8) foram obtidas a partir de lesões de hamsters experimentalmente infectados. Os parasitas foram incubados durante 9 dias a 26 °C em meio Schneider, tamponado a pH 7,2. As formas promastigotas foram estimuladas a se diferenciarem em formas amastigotas com o aumento da temperatura de incubação para 32 °C e a redução do pH do meio para 6,0. Após 7 dias, sob estas condições, mais de 90% dos parasitas encontravam-se na forma amastigota. A concentração dos parasitas foi ajustada para 1×108 cells mL-1. Em placas de 96 poços foram adicionados 90 L da solução contendo os parasitas e 10 L das soluções contendo as amostras e a droga padrão (0.2 g mL-1 Anfotericina B Fungisone Bristol-Myers Squibb, Brasil). As placas foram incubadas a 32 °C durante 72 h e o número de parasitas foi estimado utilizando o método colorimétrico do MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) (TEIXEIRA et al., 2002). Os resultados foram calculados a partir das Absorvância medidas, usando a fórmula [1- Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 93 (Absexp/Abscontr)]×100, que expressa a porcentagem de morte do parasita em relação ao grupo controle (sem droga). Todas as amostras foram testadas em duplicata. 2.5.2.1.1 Método colorimétrico empregando o reagente MTT O ensaio de MTT é utilizado para determinar a viabilidade celular, quantificando o quanto o MTT (um sal de coloração amarela) presente no meio foi reduzido pela atividade metabólica celular de enzimas desidrogenases mitocondriais, levando a formação de cristais de formazan de cor azul-púrpura, que se acumulam no citoplasma celular (Figura 41) (DENIZOT E LANG, 1986). Dessa maneira, a quantidade de formazan medida por espectrofotometria é diretamente proporcional ao número de células viáveis. Desidrogenase Mitocondrial N N N Br N NH N N N N N S S MTT amarelo Figura 41: Reação de redução do MTT a Formazan. Formazan azul-púrpura Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 94 2.5.2.2 Resultados e Discussão O dados mostraram que nenhum dos ésteres testados apresentou resultados satisfatórios. Os ésteres testados e as porcentagens de morte dos parasitas estão listados na Tabela 12 (pág. 95). As substâncias avaliadas não apresentaram porcentagens elevadas de morte do parasita. Todos os resultados estão abaixo do obtido para a droga padrão (AMB, 85% de morte). O éster que obteve maior porcentagem de morte foi o 11, com resultado igual a 18%. O ensaio trata-se de uma triagem, feito com dose única de 20 μg/mL das amostras. Assim, como nenhuma das amostras mostrou atividade maior que 70%, não foi realizado outro teste para avaliar o CE50 (Concentração Efetiva que causa a morte de 50% dos parasitas) das amostras. Capítulo 2 : Estudo da atividade biológica 95 Tabela 12: Atividade biológica do borneol e seus ésteres testados em dose única 20 g mL-1 Composto Absorvância 1 Absorvância 2 Média Morte Parasita (%) Borneol 0,821 0,850 0,836 8 1 0,811 0,808 0,810 11 2 0,787 0,786 0,787 14 5 0,769 0,808 0,788 13 6 0,765 0,756 0,760 16 7 0,801 0,799 0,800 12 8 0,853 0,827 0,840 8 11 0,729 0,765 0,747 18 15 0,825 0,799 0,812 11 16 0,808 0,864 0,836 8 18 0,823 0,825 0,824 10 0,135 85 ANF a a Anfotericina B: controle positivo do teste (20 g mL-1) Conclusão 96 CONCLUSÃO Neste trabalho foram sintetizados 20 ésteres derivados do borneol, sendo 18 inéditos. Dentre essas substâncias, 10 foram obtidas a partir de ácidos graxos e 10 a partir de ácidos aromáticos. Duas metodologias (SOCl2 e DIC/DMAP) foram utilizadas na obtenção dos derivados do borneol. Além disso, para as reações conduzidas utilizando-se DIC/DMAP, foi avaliado o efeito do uso da irradiação de micro-ondas, na ausência de solvente, na obtenção dos ésteres. Foram observados melhores rendimentos e menor tempo de reação quando se utilizou o reagente DIC/DMAP com irradiação de microondas. As sínteses conduzidas com SOCl2 apresentaram menores rendimentos e maior tempo de reação. Todos os ésteres obtidos foram caracterizados utilizando métodos espectrométricos e espectroscópicos. Para as reações feitas na ausência de solvente, foi observada a formação de produtos obtidos por rearranjo, cujas estruturas foram elucidadas através das técnicas de RMN de 1H e 13C, HMBC, HSQC e COSY. Alguns produtos obtidos foram submetidos a teste de atividade antimicrobiana, antiproliferativa, anti-inflamatória e leishmanicida. No teste antimicrobiano foram avaliadas 18 substâncias frente a 5 micro-organismos (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, S. sanguinis, C. albicans). Os ésteres 4’-metoxibenzoato de bornila e 3’,4’,5’-trimetoxibenzoato de bornila apresentaram atividade promissora contra S. aureus e S. sanguinis. O éster 3’,4’-dimetoxibenzoato de bornila mostrou bons resultados contra todos os micro-organismos testados. Para o teste leishmanicida (contra formas amastigotas de L. amazonensis) nenhuma das substâncias avaliadas apresentou porcentagens elevadas de morte do parasita. No teste anti-inflamatório, dos 11 compostos testados, aqueles que apresentaram atividade foram os ésteres: hexanoato de bornila, octanoato de bornila, tetradecanoato de bornila, hexadecanoato de bornila, octadecanoato de bornila, benzoato de bornila, 3’,5’-dinitrobenzoato de bornila e nicotinato de bornila. Dentre estes, o composto benzoato de bornila foi o mais eficiente em inibir o processo edematogênico, apresentando resultados mais satisfatórios que a droga de referência (indometacina). Para atividade antiproliferativa, Conclusão 97 foram avaliadas nove substâncias frente a seis linhagens de células tumorais humanas e uma linhagem de célula humana normal. As substâncias hexanoato de bornila, tetradecanoato de bornila, hexadecanoato de bornila, octadecanoato de bornila e 3’,5’dinitrobenzoato de bornila apresentaram somente efeito citostático contra todas as linhagens de células. Já os ésteres octanoato de bornila, benzoato de bornila e 3’,4’,5’trimetoxibenzoato de bornila apresentaram efeitos citotóxicos para as linhagens de células de câncer de ovário (OVCAR-3), ovário-resistente (NCI-ADR/RES), mama (MCF-7), medula óssea (K562) e rim (786-0). De modo geral observou-se que o aumento da cadeia carbônica nos ésteres graxos não influenciou a atividade biológica. Já na série dos ésteres aromáticos, a presença de grupo doador de elétrons favoreceu a atividade biológica. Como os testes de atividade biológica não foram realizados com todas as substâncias sintetizadas, pretende-se posteriormente avaliar a atividade destes derivados. Referências Bibliográficas 98 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ajikumar, P. K.; Tyo, K.; Carlsen, S.; Mucha, O.; Phon, T. H.; Stephanopoulos, G. Terpenoids: Opportunities for Biosynthesis of Natural Product Drugs Using Engineered Microorganisms. Mol. Pharmaceutics, 167-190, 2008. Barbosa L. C. A.; Espectroscopia no infravermelho na caracterização de compostos orgânicos. Viçosa: Ed. UFV, 2007. 189p. Barreto, R. S. S. ―Efeito cicatrizante do (-)- borneol incorporado ao filme bioativo de quitosana em roedores‖. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Sergipe. Aracaju, SE. 2013. Bologa, C. G.; Ursu, O.; Oprea, T. I.; Melançon III, C. E.; Tegos, G. P. Emerging trends in the discovery of natural product antibacterials. Curr. 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28.127 1.50 O 15 1.227 1.255 1.238 1.268 1.280 1.293 1.315 1.298 1.336 1.351 1.601 1.565 1.641 1.623 1.688 1.668 1.780 1.759 1.741 1.874 1.903 1.998 1.965 1.944 1.927 2.010 2.275 2.383 2.349 2.313 2.410 2.393 2.433 2.416 Figura 44: Expansão do espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 1 em CDCl3. 1 0.827 1.160 0.995 0.978 0.927 0.906 0.873 2 1.214 1.181 3.04 2.00 3.31 ppm (t1) 31.379 13 36.931 34.749 11 45.081 O 47.849 4 48.832 10 5.99 9 0.80 150 1 76.406 6 77.041 7 6.45 79.633 77.676 8 4.42 Figura 45: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 1 em CDCl3. ppm (t1) 1.13 3.00 174.136 Anexos 109 1.00 0.000 13.492 18.891 13.894 22.348 19.750 24.875 28.130 27.239 31.381 36.933 45.084 8 34.750 110 79.634 Anexos 9 7 10 O 6 2 1 11 O 4 80 ppm (t1) 70 13 15 60 50 40 30 20 10 0 Figura 46: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 1 em CDCl3. 101,0 95 90 1418 915 1820 824 887 85 733 940 1306 1378 981 1140 80 2873 1455 %T 995 1097 75 2933 1246 1113 70 2954 65 8 9 7 1160 10 1024 O 60 6 1 4 1175 2 O 11 13 15 17 1732 55 53,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 Figura 47: Espectro na região do IV do éster 2 (ATR). 1400 1200 1000 800 650,0 6 4 1 O 150 11 13 15 100 50 9 10 2 O 17 0 4.922 4.848 4.863 4.873 4.897 4.907 4.912 0.873 0.977 0.906 0.994 1.290 1.603 1.645 1.631 1.668 1.688 1.740 1.874 1.759 1.902 1.927 1.945 1.962 2.008 1.998 2.275 2.313 2.414 2.349 2.431 4.873 4.863 4.848 4.922 4.912 4.907 4.897 0.00000 0.000 Figura 48: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 2 em CDCl3. 13.503 0.0 0.827 4.800 14.065 18.861 1.0 19.722 22.611 27.148 25.178 28.071 29.133 28.961 2.0 31.715 36.865 34.753 44.942 47.792 48.754 3.0 76.391 4.0 3.07 9.06 1.07 7 4.850 10.51 8 4.900 4.63 5.0 ppm (t1) 4.950 77.025 5.000 ppm (t1) 1.19 Figura 49: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 2 em CDCl3. ppm (t1) 3.13 79.570 77.660 1.00 1.00 174.222 Anexos 111 14.064 13.502 19.722 18.860 25.179 22.612 31.715 29.132 28.960 28.070 27.149 36.866 44.942 8 34.752 112 79.570 Anexos 9 7 10 O 6 1 2 O 4 80 ppm (t1) 70 11 13 15 60 17 50 40 30 20 10 Figura 50: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 2 em CDCl3. 40 35 996 25 2856 15 1114 1160 1178 1248 1456 20 1026 1306 1376 %Transmittance 30 10 9 7 1736 2928 2956 8 10 O 5 6 1 4 3500 3000 2 O 11 13 2500 2000 Wavenumber (cm-1) Figura 51: Espectro na região do IV do éster 3 (KBr). 15 1500 17 19 1000 500 1 4 O 150 11 13 15 17 100 50 1.0 Figura 52: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 3 em CDCl3. 9 10 2 O 19 0 2.432 0.827 0.873 0.906 0.977 0.994 1.269 1.594 1.619 1.645 1.667 1.688 1.719 1.741 1.759 1.874 1.902 1.927 1.945 1.964 2.009 1.998 2.274 2.311 2.363 2.347 0.906 2.392 2.382 2.414 0.873 0.977 0.994 4.874 4.863 4.857 4.846 4.923 4.913 4.906 4.896 4.874 4.863 4.857 4.846 4.923 4.913 4.906 4.896 0.000 0.827 0.0 0.000 1 13.509 0.750 18.864 14.104 19.725 22.676 27.155 25.188 28.075 29.470 29.302 29.279 29.179 2.0 31.875 34.758 36.872 3.0 44.947 0.800 47.795 0.850 48.757 0.900 76.394 0.950 77.029 79.573 77.664 4.0 1.000 ppm (t1) 3.08 9.13 1.05 6 4.750 14.43 5.0 ppm (t1) 4.800 4.40 7 4.850 1.24 3.16 8 4.900 3.08 Figura 53: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 3 em CDCl3. ppm (t1) 4.950 9.13 5.000 ppm (t1) 1.05 1.00 1.00 174.222 Anexos 113 -0.00000 13.508 18.862 14.103 22.675 19.723 29.467 29.301 29.276 29.176 28.073 27.153 25.186 36.870 44.943 8 34.756 31.873 114 79.572 Anexos 9 7 10 O 6 1 2 O 4 80 ppm (t1) 11 13 70 60 15 17 19 50 40 30 20 10 0 Figura 54: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 3 em CDCl3. d 19 100 90 80 995.1 60 1455.4 30 8 400 0 350 0 300 0 1736.3 -0 6 200 0 W av enu mber s ( c m- 1) Figura 55: Espectro na região do IV do éster 4. 11 13 10 1 2 O 4 250 0 O 9 7 2854.3 2925.4 10 1180.0 1159.7 20 1113.4 1377.1 40 1025.5 1305.1 50 1252.2 % Trans mittance 70 150 0 15 100 0 17 19 21 500 1 4 O 11 13 15 17 ppm (t1) Figura 57: Espectro de RMN de 19 150 13 100 9 10 2 O 21 50 C (50 MHz) do éster 4 em CDCl3. 1.0 22.649 19.704 18.843 14.018 13.448 25.179 27.204 28.088 29.584 29.484 29.288 29.180 2.0 34.744 31.899 36.890 45.050 47.805 48.792 76.366 77.000 2.77 8.74 1.10 7 3.0 17.78 6 4.0 4.38 5.0 ppm (t1) 4.900 77.635 4.950 ppm (t1) 1.31 8 3.00 79.571 0.84 0.84 174.046 4.925 4.848 4.859 4.865 4.875 4.897 4.908 4.914 0.873 0.827 0.000 0.906 0.978 0.995 1.262 1.593 1.628 1.645 1.670 1.688 1.720 1.741 1.759 1.875 1.779 1.904 1.929 1.947 1.966 2.011 2.000 2.273 2.310 2.346 2.364 2.392 2.382 2.415 2.432 4.875 4.865 4.859 4.848 4.925 4.914 4.908 4.897 Anexos 115 4.850 0.0 Figura 56: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 4 em CDCl3. 13.445 19.703 18.844 28.090 27.210 25.180 29.291 29.175 29.584 29.480 34.744 36.892 45.056 8 31.897 116 79.571 Anexos 9 7 10 O 6 1 2 O 4 80 ppm (t1) 11 13 15 70 17 60 19 21 50 40 30 20 Figura 58: Expansão do subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 4 em CDCl3. 101,0 95 916 886 956 824 90 1081 981 721 1376 1305 85 80 1455 994 1247 1024 %T 1113 75 2953 2853 8 70 1177 1159 9 7 10 O 6 65 2923 1734 1 2 O 4 13 11 15 17 19 60 58,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 Figura 59: Espectro na região do IV do éster 5 (ATR). 1400 1200 1000 800 650,0 21 23 4 11 13 15 17 19 21 0.827 0.873 0.906 1.0 3.07 8.84 Figura 61: Expansão do espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 5 em CDCl3. 1 0.92 1.50 0.977 2.0 0.994 1.259 1.615 1.687 1.667 1.874 1.903 1.928 3.0 22.08 2.00 1.945 1.964 1.999 2.009 2.273 2.310 4.0 4.20 1.12 3.15 2.50 ppm (t1) O 2.346 5.0 ppm (t1) 4.850 3.07 8.84 0.92 1 4.900 22.08 6 4.950 4.20 7 2.381 5.000 ppm (t1) 1.12 8 3.15 2.413 2.410 2.391 1.00 1.00 2.431 4.923 4.913 4.864 4.848 4.874 4.907 4.897 0.000 0.827 0.873 0.994 0.977 0.906 1.615 1.259 1.667 1.874 1.687 1.903 1.928 1.945 1.964 2.009 1.999 2.273 2.310 2.346 2.391 2.381 2.413 2.410 2.431 4.874 4.864 4.848 4.923 4.913 4.907 4.897 Anexos 117 4.800 Figura 60: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 5 em CDCl3. 1 0.0 9 10 2 O 23 1.00 80 ppm (t1) 8 7 6 1 4 O 70 11 13 15 60 17 50 19 21 40 30 20 Figura 63: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 5 em CDCl3. 13.499 19.749 18.890 14.080 25.227 22.705 28.132 27.247 100 29.673 29.530 29.372 29.323 29.220 Figura 62: Espectro de RMN de 31.961 150 34.795 ppm (t1) 36.933 45.084 79.619 50 13 0 C (50 MHz) do éster 5 em CDCl3. 9 10 2 O 23 10 -0.00000 13.501 18.892 14.082 19.751 22.705 27.244 25.226 28.131 29.674 29.536 29.365 29.224 31.961 34.795 45.080 36.932 47.849 48.832 76.403 77.038 79.619 77.673 174.132 Anexos 118 Anexos 119 101,0 95 886 956 823 90 981 1305 1377 994 721 85 1250 1455 80 1024 %T 1113 75 1177 1159 70 8 9 7 2853 10 O 1 O 4 60 2922 11 13 19 21 1000 800 650,0 0.993 0.976 0.905 65 2 1.256 6 15 17 1734 57,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1.00 4.950 ppm (t1) 4.900 4.850 4.800 3.15 9.32 0.91 2.0 26.66 3.0 4.36 4.0 1.16 3.12 1.00 5.0 ppm (t1) 1.0 Figura 65: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 6 em CDCl3. 0.0 0.826 0.000 0.872 1.603 1.626 1.646 1.666 1.873 1.687 1.901 1.943 1.926 1.963 1.997 2.273 2.310 2.346 2.392 2.383 2.430 2.413 2.410 4.846 4.857 4.862 4.872 4.906 4.896 4.911 4.921 4.872 4.862 4.857 4.846 4.921 4.911 4.906 4.896 Figura 64: Espectro na região do IV do éster 6 (ATR). 23 25 8 7 6 1 4 80 ppm (t1) O 11 70 13 15 60 17 19 50 21 23 40 30 20 10 Figura 67: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 6 em CDCl3. 0.004 13.512 18.863 14.127 100 22.708 19.723 Figura 66: Espectro de RMN de 29.692 29.621 29.513 29.377 29.305 29.180 28.076 27.154 25.188 150 34.760 31.944 ppm (t1) 36.870 44.942 79.572 13 50 0 C (50 MHz) do éster 6 em CDCl3. 9 10 2 O 25 0 13.510 0.00000 18.862 14.125 22.705 19.721 25.187 27.152 28.073 29.675 29.620 29.512 29.375 29.304 29.179 31.943 34.760 36.869 44.941 47.793 48.755 76.390 77.025 77.660 79.572 174.234 Anexos 120 Anexos 121 101,0 95 885 957 824 90 981 994 1376 1305 720 85 1249 1023 1455 80 1113 %T 1176 1159 75 70 2852 8 65 9 7 10 O 6 60 1 2922 1734 2 11 O 4 13 15 17 21 19 25 23 27 56,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 1.00 4.950 4.900 4.850 4.800 ppm (t1) 3.22 9.28 1.01 2.0 1 30.10 3.0 4.39 4.0 1.12 3.14 1.00 5.0 ppm (t1) 1.0 Figura 69: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 7 em CDCl3. 0.0 0.000 0.826 0.873 0.906 0.977 0.994 1.256 1.592 1.628 1.666 1.687 1.719 1.740 1.875 1.758 1.903 1.928 1.945 1.965 2.010 1.999 2.272 2.309 2.345 2.363 2.391 2.382 2.414 2.431 4.848 4.859 4.864 4.875 4.897 4.914 4.908 4.925 4.875 4.864 4.859 4.848 4.925 4.914 4.908 4.897 Figura 68: Espectro na região do IV do éster 7 (ATR). 650,0 Figura 71: Espectro de RMN de 13 50 C (50 MHz) do éster 7 em CDCl3. 0 13.500 0.00000 14.074 18.895 22.708 19.754 25.232 1.50 3.22 2.00 9.28 100 25 1.01 ppm (t1) 23 27.259 21 28.140 19 29.714 29.540 29.377 29.231 17 30.10 150 15 4.39 2.50 ppm (t1) 13 34.796 31.971 11 47.857 45.105 36.942 O 48.844 4 76.404 1 77.039 6 77.673 7 79.621 8 1.12 3.14 174.097 2.431 0.826 0.873 0.906 0.977 0.994 1.256 1.592 1.687 1.666 1.628 1.758 1.740 1.719 1.875 1.903 1.928 1.965 1.945 1.999 2.010 2.345 2.309 2.272 2.382 2.363 2.414 2.391 Anexos 122 9 10 2 O 27 Figura 70: Expansão do espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 7 em CDCl3. 1 1.00 9 7 10 O 6 2 1 11 O 4 80 ppm (t1) 13 15 70 17 21 19 60 25 23 50 27 40 30 20 8 13.407 18.798 19.664 27.044 27.965 29.249 29.062 44.812 36.589 47.782 48.760 76.365 77.000 77.635 80.491 172.338 178.145 Figura 72: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 7 em CDCl3. 9 7 10 O 6 1 2 O 4 11 OH 13 O 150 ppm (t1) Figura 73: Espectro de RMN de 100 13 50 C (50 MHz) do éster 8 em CDCl3. 0 14.071 13.495 25.232 22.707 19.753 18.893 28.141 27.263 31.970 29.724 29.535 29.382 29.326 29.229 36.944 45.110 8 34.796 123 79.621 Anexos 8 7 6 1 4 O 11 2 O O 12' O 10' 1' 9' 7' 2.00 4.944 4.933 4.950 4.900 4.867 4.878 4.883 1.0 9 10 4' 2' 6' 8' ppm (t1) 4.850 0.0 0.975 0.950 0.932 0.897 0.827 0.869 0.000 1.001 1.164 1.018 1.184 20 1.212 1.241 1.255 1.272 1.646 1.598 1.363 1.351 1.340 1.293 1.287 1.667 1.689 1.717 1.737 1.755 1.776 30 6.78 5.97 6.26 2.90 2.0 4.894 4.917 4.928 1.859 1.800 40 6.43 3.0 7.92 Figura 75: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 9 em CDCl3. 1 1.887 50 2.19 4.0 1.912 60 1.929 13 1.949 2.267 1.994 1.984 70 2.289 11 2.317 2.307 80 ppm (t1) 2.337 4 O 2.357 1 2.385 2.376 7 2.407 6 2.652 2.425 8 3.78 2.00 5.0 ppm (t1) 4.894 4.883 4.878 4.867 4.944 4.933 4.928 4.917 13.406 19.665 18.796 27.963 27.042 29.248 29.061 36.587 44.812 80.491 Anexos 124 9 10 2 O OH O 10 Figura 74: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 8 em CDCl3. -0.00000 18.860 13.497 27.204 19.727 29.667 28.065 44.986 36.756 48.849 47.851 77.032 76.397 80.281 8 77.666 125 172.448 Anexos 9 7 10 O 1' 12' 6' 2' 10' 7' 9' 100 80 ppm (t1) 70 60 50 0 C (50 MHz) do éster 9 em CDCl3. 44.987 80.280 Figura 76: Espectro de RMN de 50 13 40 30 20 -0.00000 ppm (t1) 13.498 150 8' 18.860 O 19.726 11 27.205 O 28.066 4 4' O 29.668 1 2 36.756 6 10 Figura 77: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 9 em CDCl3. 0 Anexos 126 100,0 95 3064 1585 1602 90 1479 1390 1377 1367 2879 85 1045 916 780 956 857 937 825 888 805 80 1175 75 987 1016 978 2953 1300 1313 1451 675 70 1069 %T 686 65 1026 60 55 50 1112 45 1714 40 1270 34,5 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 650,0 8 1.325 1.317 1.296 1.267 1.149 0.971 0.000 1.098 1.256 1.166 1.081 0.918 1.359 1.402 1.467 1.457 1.611 1.758 1.738 1.858 1.843 1.823 1.804 1.783 2.071 2.101 2.164 2.145 2.128 2.206 5.158 5.148 5.143 5.132 5.109 5.099 5.094 5.083 2.559 2.542 2.520 2.511 2.492 2.472 2.451 2.443 2.424 2.402 7.259 7.412 7.446 7.484 7.527 7.563 7.600 7.593 8.050 8.084 8.042 Figura 78: Espectro na região do IV do éster 11 (ATR). 9 7 6 10 1 O 13' 2 14` 11 O 4 13 15 14 3.0 6.14 2.92 1.13 4.0 2.42 1 0.43 5.0 2.07 6.0 1.07 7.0 1.05 1.00 3.11 2.01 8.0 ppm (t1) 2.0 Figura 79: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 11 em CDCl3. 1.0 0.0 1 O 2 11 13 100 1.50 50 0.000 18.937 13.622 19.740 27.419 28.111 36.931 2.00 45.024 ppm (t1) 5.050 47.900 5.100 49.114 5.150 76.391 2.50 5.200 77.026 7.40 77.661 80.540 128.333 129.521 132.741 130.932 7.50 6.14 10 7.60 2.92 7 7.70 1.13 8 7.80 2.36 150 7.90 2.19 6 1.07 1.05 Figura 81: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 11 em CDCl3. ppm (t1) 8.00 1.00 8.20 8.10 ppm (t1) 3.11 2.01 166.828 5.083 5.094 5.099 5.132 5.109 5.143 5.148 5.158 7.412 7.446 7.527 7.484 7.563 7.593 7.600 8.042 8.050 8.084 2.559 Figura 80: Expansão do espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 11 em CDCl3. 1 9 O 13' 4 14` 14 15 0 0.918 0.971 1.081 1.098 1.149 1.166 1.256 1.267 1.317 1.296 1.325 1.402 1.359 1.457 1.467 1.804 1.783 1.758 1.738 1.611 1.823 1.843 1.858 2.071 2.128 2.101 2.145 2.206 2.164 2.424 2.402 2.443 2.472 2.451 2.492 2.511 2.542 2.520 Anexos 127 ppm (t1) 5.000 1.00 0.000 13.619 19.739 18.933 28.108 36.928 45.020 80.537 8 27.416 128 128.330 132.739 129.518 Anexos 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14` 11 4 13 15 14 100 50 0 ppm (t1) Figura 82: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 11 em CDCl3. 60 55 50 45 9 7 25 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 4 15 13 14 O 16 1582 15 616 696 770 848 980 1032 988 1102 1118 1168 1234 1258 1280 1302 1420 1376 1456 1316 1510 1606 20 512 798 8 30 634 35 2838 %Transmittance 582 888 40 2880 10 5 3500 3000 1712 2954 0 2500 2000 Wavenumber (cm-1) Figura 83: Espectro na região do IV do éster 12 (NaCl). 1500 1000 500 1 2 O 150 11 13 14 O 100 50 0.000 18.955 13.619 2.0 19.764 27.479 28.150 36.988 45.113 47.898 49.129 55.435 76.402 77.037 77.672 80.169 113.621 123.512 131.517 163.294 3.0 6.02 3.15 1.43 1.20 1.38 6 10 4.0 1.12 0.95 7 5.0 1.09 8 6.0 1.06 7.0 3.14 8.0 ppm (t1) 1.00 Figura 85: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 12 em CDCl3. ppm (t1) 2.10 2.13 166.586 8.039 Figura 84: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 12 em CDCl3. 1 1.0 9 O 13' 4 14' 15 16 0 1.317 1.308 1.288 1.256 1.222 0.907 1.066 1.134 0.964 1.083 1.152 1.349 1.388 1.747 1.725 1.635 1.453 1.442 1.849 1.834 1.813 1.795 1.774 2.057 1.880 2.086 2.150 2.130 2.112 2.193 2.540 2.522 2.500 2.491 2.472 2.452 2.432 2.422 2.404 2.383 3.862 5.128 5.117 5.112 5.102 5.078 5.068 5.063 5.052 6.906 6.950 7.994 7.261 Anexos 129 0.0 -0.00000 13.618 19.766 18.956 28.152 27.484 45.116 55.436 80.169 113.623 8 36.990 130 131.515 Anexos 9 7 6 10 1 O 13' 2 14' 11 O 4 15 13 O 14 16 100 50 0 ppm (t1) Figura 86: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 12 em CDCl3. * d7 b s ol 2 100 95 1344.8 3297.8 2875.9 85 1454.5 90 1259.2 8 9 7 10 65 13 O 6 60 1 2 O 4 55 11 14 N 12 13' H 1708.5 50 1683.0 70 45 400 0 1087.5 1546.4 75 2954.3 % Trans mittance 80 350 0 300 0 250 0 200 0 W av enu mber s ( c m- 1) Figura 87: Espectro na região do IV do éster 13 (ATR). 150 0 100 0 500 7 86 6 10 1 O 2 O 300 0 11 13 4 14 17 16 O 15 1223.7 8 O 82 250 0 Figura 89: Espectro na região do IV do éster 14. 1301.7 1290.3 1271.4 88 9 18 W av enu mber s ( c m- 1) 200 0 150 0 1025.5 763.2 1133.5 991.3 2.0 1177.5 1114.2 92 2.70 3.00 2.88 1.33 94 6.15 350 0 3.0 2.37 90 4.50 1.26 0.85 4.0 1.02 5.00 ppm (t1) 1.18 84 12 1345.4 N 1.01 400 0 14 0.98 1.00 5.0 ppm (t1) 11 1415.8 O 1462.1 1452.6 O 1513.7 4 1601.1 1 1.02 100 10 1709.9 7 2878.1 8 2953.6 6 0.98 1.00 % Trans mittance 3.683 3.714 3.747 3.781 3.815 3.848 3.881 3.908 4.483 4.489 4.803 4.851 4.813 100 0 1.0 0.863 0.000 0.845 0.902 0.966 1.035 0.981 1.146 1.051 1.228 1.178 1.256 1.634 1.654 1.674 1.707 1.728 1.748 1.795 1.791 1.819 1.849 1.887 1.945 2.258 2.278 2.305 2.326 2.344 2.372 2.395 2.411 3.683 3.714 3.747 3.781 3.815 3.848 3.881 3.908 4.489 4.483 4.813 4.803 4.851 Anexos 131 9 13 2 13' H 4.00 Figura 88: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 13 em CDCl3. 1 0.0 * A 41 so l 98 96 19 500 7.50 7.00 1.150 1.100 1.50 1.0 1.358 1.325 1.316 1.296 1.257 1.227 1.162 1.145 0.916 0.972 1.093 1.076 1.436 1.400 1.453 1.464 2.0 1.475 1.485 1.659 1.714 1.735 5.050 5.92 3.08 2.00 1.076 1.093 3.0 1.756 1.783 1.803 5.100 1.18 Figura 91: Expansão do espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 14 em CDCl3 1 1.822 5.150 2.73 2.50 1.842 4.0 1.145 2.048 2.079 2.105 2.123 O 2.13 1.05 3.00 2.142 5.0 1.10 ppm (t1) 2.184 ppm (t1) 2.390 16 2.412 15 1.162 6.922 6.880 6.0 2.430 2.439 2.460 17 5.92 3.08 1.10 2.480 14 2.73 7.271 11 2.13 2.499 5.058 5.068 5.074 5.084 5.107 5.117 5.124 5.134 9 1.05 7.0 2.508 13 1.03 1.03 3.50 2.530 2 1.00 2.548 O 7.569 O 6.15 7.689 10 1.01 0.98 0.99 6.15 4.00 ppm (t1) 1 7.680 7.579 6 1.00 7.731 7 7.722 8 1.02 0.98 0.99 3.941 1.400 1.358 1.325 1.316 1.076 0.916 1.227 1.145 1.296 0.972 0.000 1.257 1.093 1.162 1.659 1.485 1.475 1.464 1.453 1.436 1.756 1.735 1.714 1.842 1.822 1.803 1.783 2.048 2.079 2.142 2.123 2.105 2.184 2.548 2.530 2.508 2.499 2.480 2.460 2.439 2.430 2.412 2.390 5.134 5.124 5.117 5.107 5.084 5.074 5.068 5.058 3.941 6.880 6.922 7.271 7.722 7.689 7.731 7.680 7.579 7.569 Anexos 132 18 O 4 19 ppm (t1) 5.000 Figura 90: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 14 em CDCl3. 1 0.0 ppm (t1) 1.050 1.00 100 15 16 150 100 ppm (t1) 50 Figura 93: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 14 em CDCl3. -0.00000 17 13.631 14 18.981 11 19.778 O 27.549 13 28.184 2 37.015 1 O 45.188 10 56.092 7 80.386 8 110.557 6 112.481 123.451 -0.00000 18.981 13.634 19.777 27.546 28.182 37.012 45.184 47.937 49.202 56.090 76.424 77.059 77.694 80.385 112.470 110.548 123.743 123.448 148.892 153.112 166.606 Anexos 133 9 18 O 4 O 19 ppm (t1) 50 0 Figura 92: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 14 em CDCl3. 0 Anexos 134 98,0 95 1991 90 2836 1280 85 1433 826 887 919 847 958 944 80 75 2952 8 70 9 7 10 %T 65 6 O 14' 11 1174 1586 13' 2 1 745 1044 1456 1504 1465 O O 60 1377 1366 676 1188 873 726 16 4 1020 15 13 55 17 O 14 1415 767 1708 997 O 50 1333 18 45 1122 1228 40,0 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 1.084 0.922 0.976 0.000 1.152 1.259 1.320 1.363 1.407 1.474 1.652 1.748 2.048 1.809 2.156 2.422 2.482 2.474 2.468 2.538 2.533 3.918 2.096 2.0 5.69 3.07 1.45 3.0 2.44 4.0 2.21 5.0 1.00 6.0 8.87 0.92 1.94 7.0 ppm (t1) 5.077 5.120 7.268 7.325 Figura 94: Espectro na região do IV do éster 15 (ATR). 1.0 Figura 95: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 15 em CDCl3. 0.0 650,0 0.000 19.734 18.947 13.660 28.109 27.470 44.992 36.924 49.120 47.884 60.933 56.239 77.037 76.401 80.702 106.792 125.970 142.167 152.939 8 77.672 135 166.424 Anexos 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 O 16 4 15 13 O 14 17 O 18 150 100 50 0 ppm (t1) 100 13.657 18.948 19.736 27.478 28.112 36.928 45.007 56.250 60.931 80.702 106.836 Figura 96: Espectro de RMN de 13C (50 MHz) do éster 15 em CDCl3. 50 ppm (t1) Figura 97: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 15 em CDCl3. 0 Anexos 136 98,9 98 96 1599 94 3108 2879 92 842 1628 886 90 1045 773 1455 88 1113 2956 822 926 1013 988 975 86 8 %T 9 84 7 10 1071 O 913 1172 82 6 1 80 1302 13' 2 O 14' 11 NO2 1286 4 78 15 13 76 729 14 1723 NO2 74 1541 1343 72 69,5 4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 cm-1 1600 1400 1200 1000 800 4.0 1.371 1.361 1.210 1.193 1.141 0.951 1.124 0.995 0.000 1.416 1.581 1.489 1.826 1.805 1.883 1.864 2.138 2.121 2.117 2.093 2.073 2.055 2.029 2.011 3.0 9.06 1.06 5.0 1 2.70 6.0 2.02 7.0 1.06 8.0 1.04 1.00 1.74 0.91 9.0 ppm (t1) 2.616 2.599 2.577 2.568 2.548 2.529 2.508 2.499 2.480 2.459 5.271 5.262 5.257 5.246 5.223 5.213 5.198 7.267 9.153 9.143 9.245 9.235 9.224 Figura 98: Espectro na região do IV do éster 16 (ATR). 2.0 Figura 99: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 16 em CDCl3. 1.0 0.0 650,0 100 Figura 101: Espectro de RMN de 13 8 7 6 1 10 O 2 11 13 1.50 13' 14' -0.00000 13.665 18.895 27.444 19.713 28.100 36.793 44.905 2.00 48.148 49.309 76.398 1.150 9.06 ppm (t1) 77.033 9.100 1.06 2.50 83.206 77.668 9.150 2.70 122.229 9.200 1.06 129.299 1.124 1.141 1.193 1.210 9.143 9.153 9.224 9.235 50 C (50 MHz) do éster 16 em CDCl3. 0.951 0.995 1.124 1.141 1.193 1.210 1.361 1.371 1.416 1.489 1.581 2.011 1.883 1.864 1.826 1.805 2.029 2.055 2.093 2.073 2.121 2.117 2.138 2.499 2.480 2.459 9.250 2.02 1.06 150 134.561 2.568 2.548 2.529 2.508 9.245 2.616 9.300 ppm (t1) 1.74 148.713 1.200 2.599 2.577 0.91 1.04 162.757 Anexos 137 ppm (t1) 1.100 ppm (t1) 1.00 Figura 100: Expansão do espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 16 em CDCl3. 9 O NO2 4 14 15 NO2 0 -0.00000 13.663 19.709 18.893 28.096 36.790 44.901 83.203 8 27.440 138 122.224 129.293 Anexos 9 7 6 10 1 O 13' 2 O NO2 14' 11 4 15 13 14 NO2 100 50 0 ppm (t1) Figura 102: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 16 em CDCl3. 70 65 60 524 2360 55 50 40 6 10 1 O OH 2 13 14 11 NO2 3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 Wavenumber (cm-1) 1800 Figura 103: Espectro na região do IV do éster 17 (KBr). 1600 1178 3600 1262 1338 1352 3800 1546 NO2 0 1454 16 1622 1682 1710 15 17 2958 5 1086 10 1390 4 742 806 O 710 720 2884 15 9 7 920 936 8 20 1232 3098 25 694 30 976 1140 35 1768 %Transmittance 45 1400 1200 1000 800 600 10 1 O 150 2 O 13 11 14 17 ppm (t1) 100 Figura 105: Espectro de RMN de 13 9 OH NO2 4 16 15 NO2 50 C (50 MHz) do éster 17 em CDCl3. 18.811 13.622 19.636 27.312 27.979 36.572 48.157 44.738 49.302 76.365 77.000 77.635 84.598 116.246 126.510 129.726 138.180 137.787 10.0 5.87 2.79 1.01 7 8.90 2.44 8 9.00 2.30 1.29 6 9.10 1.00 1.08 1.16 159.895 9.20 1.08 1.16 1.00 168.308 8.884 8.970 9.031 9.116 1.450 1.423 1.407 1.398 1.373 1.370 1.237 1.140 0.988 -0.00000 0.961 1.551 1.518 1.829 1.892 1.878 2.041 2.024 1.996 1.979 2.095 2.482 2.480 2.599 2.582 2.576 2.571 2.547 2.535 5.232 7.268 5.279 8.884 8.970 9.031 9.116 12.927 Anexos 139 ppm (t1) 8.80 ppm (t1) 5.0 0.0 Figura 104: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 17 em CDCl3. 8 13.619 19.634 18.807 27.976 27.308 36.569 44.735 84.598 129.730 140 126.514 Anexos 9 7 6 10 1 O OH 2 13 O NO2 14 11 4 15 17 16 NO2 100 50 ppm (t1) Figura 106: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 17 em CDCl3. 45 40 30 826 888 25 1574 3040 3054 %Transmittance 620 782 35 8 9 7 13 O 11 N 14 4 15 17 16 1718 2880 2954 10 1 O 2 740 6 702 15 10 978 1014 1024 1088 1124 1194 1234 1286 1326 1302 1420 1454 1476 1590 20 5 3500 3000 2500 2000 Wavenumber (cm-1) Figura 107: Espectro na região do IV do éster 18 (NaCl). 1500 1000 500 O 150 2 11 N 17 ppm (t1) 100 Figura 109: Espectro de RMN de 13 18.877 13.562 19.691 3.0 27.416 5.194 5.119 5.128 5.134 5.145 5.168 5.178 5.184 7.400 28.075 36.897 45.032 4.0 47.967 5.0 49.192 76.371 77.000 81.256 77.639 126.793 123.225 136.900 150.894 6.0 7.450 5.95 3.03 1.23 10 5.150 8.300 2.47 1 7.0 8.350 ppm (t1) 2.38 153.256 5.200 8.750 1.13 6 8.800 1.09 8.0 1.00 7 ppm (t1) 0.99 9.300 9.290 9.280 9.270 9.260 9.250 9.240 9.230 9.220 ppm (t1) 0.96 1.00 8 1.03 1.01 9.0 ppm (t1) 0.92 0.91 1.01 0.99 165.472 9.264 9.261 7.374 7.398 7.414 7.438 8.281 8.292 8.301 8.321 8.331 8.340 8.765 8.773 8.789 8.798 9.254 2.0 1.0 Figura 108: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 18 em CDCl3. 9 O 13 4 14 16 15 50 C (50 MHz) do éster 18 em CDCl3. 1.446 1.427 1.422 0.926 1.111 1.093 1.370 1.273 1.180 1.256 1.162 0.977 1.331 1.322 1.301 0.000 1.498 1.487 1.476 1.805 1.779 1.757 1.737 2.030 1.839 2.172 2.145 2.128 2.109 2.090 2.064 2.574 2.556 2.533 2.524 2.505 2.486 2.464 2.455 2.437 2.415 5.194 5.184 5.178 5.168 5.145 5.134 5.128 5.119 9.264 8.798 9.261 9.254 8.789 8.773 8.765 8.340 8.331 8.321 8.301 8.292 8.281 7.438 7.414 7.398 7.374 7.272 Anexos 141 ppm (t1) 7.350 ppm (t1) 5.100 0.0 19.697 18.889 13.554 28.089 36.897 45.054 81.254 123.222 136.903 8 27.420 142 150.904 153.251 Anexos 9 7 6 10 O 13 2 1 O 11 N 14 4 15 17 16 150 100 50 ppm (t1) Figura 110: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 18 em CDCl3. 100 * A 13 so l 95 80 2954.0 75 1519.1 3478.3 60 6 35 1 O 13' 2 O 30 14' 11 4 13 NH2 14 20 350 0 300 0 250 0 1321.1 1300.5 1286.4 15 25 400 0 1311.2 10 40 1630.4 9 7 1172.2 8 1598.5 45 1681.2 50 1120.1 55 3369.0 % Trans mittance 70 65 1379.9 1453.6 1571.3 85 773.6 90 200 0 W av enu mber s ( c m- 1) Figura 111: Espectro na região do IV do éster 19. 150 0 100 0 500 1 150 2 O 11 13 14 ppm (t1) 100 Figura 113: Espectro de RMN de 13 50 C (50 MHz) do éster 19 em CDCl3. -0.00000 2.0 13.612 18.966 19.778 27.506 3.0 28.165 37.016 45.155 47.877 49.119 76.404 77.038 79.781 77.673 113.845 120.758 131.559 4.0 6.04 2.93 1.22 10 5.0 1.100 2.51 6 6.0 1.150 ppm (t1) 2.35 7 4.950 1.07 7.0 5.000 1.06 8 5.050 1.94 8.0 ppm (t1) 5.100 1.00 2.09 150.713 5.150 ppm (t1) 1.22 1.00 2.09 166.895 5.101 1.052 1.069 1.121 1.138 5.025 5.035 5.041 5.074 5.052 5.084 5.090 1.362 1.341 1.325 1.309 1.299 1.279 1.254 1.233 1.138 1.121 1.069 0.905 0.896 1.052 0.000 0.956 1.396 1.448 1.437 1.426 1.734 1.712 2.058 1.802 1.783 1.763 2.087 2.150 2.131 2.113 6.629 5.101 5.090 5.084 5.074 5.052 5.041 5.035 5.025 4.057 2.523 2.505 2.483 2.474 2.455 2.435 2.414 2.405 2.387 2.365 2.195 2.186 6.672 7.262 7.852 7.895 Anexos 143 1.050 1.0 0.0 Figura 112: Espectro de RMN de 1H (200 MHz) do éster 19 em CDCl3. 9 O 13' 4 14' 15 NH2 0 13.614 19.779 27.509 28.167 37.019 45.157 79.781 113.846 8 18.967 144 131.558 Anexos 9 7 6 10 1 O 13' 2 O 14' 11 4 15 13 NH2 14 100 50 ppm (t1) Figura 114: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 19 em CDCl3. 102 a 11 101 14 11 94 15 17 1767.1 16 93 400 0 350 0 300 0 250 0 200 0 W av enu mber s ( c m- 1) Figura 115: Espectro na região do IV do éster 20. 703.7 751.6 1011.5 1134.5 1722.4 4 669.0 13 O 677.9 19 1080.9 2 18 1160.5 1304.6 O 1114.1 1 O 1262.7 10 1193.7 6 O 1712.1 7 96 95 9 1776.6 8 1367.4 1483.8 97 1043.3 1451.2 1606.9 2881.7 98 2955.2 % Trans mittance 99 914.4 100 150 0 100 0 500 O O O 2 11 17 18 ppm (t1) 150 Figura 117: Espectro de RMN de 13 100 9 O 13 19 14 4 16 15 50 C (50 MHz) do éster 20 em CDCl3. 1.0 18.889 13.560 19.714 21.088 27.447 2.0 28.108 36.840 45.027 47.942 3.0 49.075 4.0 76.365 77.000 77.635 80.770 133.433 131.418 125.868 124.044 123.809 150.786 164.541 7.20 5.92 2.98 1.25 10 5.0 7.30 2.52 1 6.0 7.40 2.17 7.0 7.50 1.11 7 7.60 ppm (t1) 3.00 1.08 8 8.000 1.00 8.050 1.00 6 1.00 8.0 ppm (t1) 1.02 0.96 1.00 1.00 1.02 0.96 169.516 7.082 7.087 7.122 7.127 7.260 7.275 7.281 7.313 7.319 7.351 7.357 7.510 7.549 7.518 7.587 7.557 7.596 8.009 8.001 8.048 8.040 8.048 8.040 8.009 8.001 1.302 1.051 0.904 1.120 1.256 0.952 0.000 1.068 1.137 1.336 1.379 1.610 1.443 1.433 1.725 1.746 1.808 1.790 1.769 2.001 2.032 2.094 2.076 2.057 2.361 2.138 2.422 2.413 2.395 2.464 2.444 2.531 2.514 5.060 5.050 5.044 5.034 7.087 7.082 5.110 5.100 5.094 5.083 7.127 7.122 7.281 7.275 7.260 7.319 7.313 7.518 7.510 7.357 7.351 7.557 7.549 7.596 7.587 Anexos 145 ppm (t1) 7.10 Figura 116: Espectro de RMN de H (200 MHz) do éster 20 em CDCl3. 1 0.0 O 8 9 7 6 10 1 O O 2 18 19 13 O 14 11 4 15 17 16 100 50 ppm (t1) Figura 118: Subespectro DEPT135 (50 MHz) do éster 20 em CDCl3. 18.888 13.562 21.089 19.716 28.108 27.447 36.841 80.770 45.027 125.869 146 123.809 133.435 131.419 Anexos