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DISS. ETH NO. 23036
Genetic and BRAF inhibition-induced vulnerability to transcription inhibitors in malignant melanoma
A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zurich)
presented by Dr. med. Lukas Alexander Frischknecht Medizinisches Staatsexamen 2010, University of Zurich born on 05.02.1986 citizen of Schwellbrunn AR
accepted on the recommendation of Prof. Dr. Wilhelm Krek Prof. Dr. Josef Jiricny Prof. Dr. med. Reinhard Dummer 2015
Abstract In recent years the therapeutic landscape of advanced melanoma has changed dramatically. Several new drugs, either activating the anti-melanoma immune response or targeting the oncogenic activated ERK-signaling cascade, have revolutionized the therapy and improved patient outcome significantly. Thanks to these great successes, melanoma has become a ‘paradigm’ for modern cancer medicine. Nevertheless, as predictive markers for the response to immunotherapy are missing and responses to targeted therapies are of limited duration, there is a need to further increase the therapeutic options in case of resistance to the established therapies. Genome instability is a general feature of cancer cells and frequently causes deletions of regions containing tumor suppressor genes. This loss of tumor suppressors creates a selective growth and/or survival advantage for the cell clones affected. However, usually it also causes a copy loss of several flanking genes. This “wasteful” loss of genes involved in normal cellular functions might cause cancer specific vulnerabilities. With the help of the Achilles database (http://www.broadinstitute.org/achilles), containing information from a loss-of-function screen in 216 cancer cell lines, we identified a network of genes involved in transcription, whose depletion caused differential dependencies across cancer cell lines. The observed increased dependency on transcription of certain cancer cell lines could be predicted by the copy number of twelve genes with a central role in gene expression, in combination with the transcriptional burden of the cell. We detected several genes encoding RNA polymerase subunits to be frequently deleted in melanoma as they are flanking the most important melanoma tumor suppressors. These deletions, if around the twelve predictive genes, caused a reduced availability of RNA polymerase holoenymes and an increased sensitivity to drugs inhibiting the transcription machinery. The assembly of RNA polymerase holoenzymes plays a central role in determining the transcription capacity of a cell. Several chaperone proteins are critically involved in this process. In this study we present evidence for a critical involvement of oncogenic activated ERK-signaling in the process of chaperone-mediated assembly of RNA polymerase II. Treatment with a small
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molecule inhibitor of BRAFV600, the most frequently activated oncogene in melanoma, caused a strong reduction in the availability of assembled RNA polymerase II holoenzymes and thereby increased the sensitivity to transcription inhibition. In summary, our results propose RNA polymerases as interesting novel therapeutic targets for cancers that have developed a dependency on transcription. This transcription dependency can either be an intrinsic feature of cancer cells caused by genetic deletions or it can be induced exogenously by inhibiting key oncogenic signaling pathways.
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Zusammenfassung In den letzten Jahren hat sich das therapeutische Spektrum für fortgeschrittene Melanome radikal verändert. Mehrere neue Medikamente, die entweder die anti-Tumor Immunantwort stimulieren oder den durch Onkogene aktivierten ERK-Signalweg inhibieren, haben die Therapie revolutioniert und das Patientenüberleben signifikant verbessert. Trotz all diesen Erfolgen gibt es bisher keine Möglichkeit, das Ansprechen auf eine Immuntherapie vorherzusagen und gegen die zielgerichtete Therapie entwickeln sich in der Regel nach kurzer Dauer Resistenzen. Dies macht es nötig, die vorhandenen Therapieoptionen zu erweitern, um im Falle von Resistenzen Alternativen zur etablierten Therapie zur Verfügung zu haben. Genomische Instabilität ist ein Merkmal fast aller Krebszellen und führt häufig zur Deletion von Tumorsuppressorgenen. Dieser Verlust von Tumorsuppressoren verleiht den betroffenen Zellklonen einen Wachstumsund/oder Überlebensvorteil, kann jedoch auch zum Verlust von benachbarten Genen führen. Dieser „verschwenderische“ Verlust von Genen, die in normale zelluläre Prozesse involviert sind, kann zu einer Schwachstelle für den jeweiligen Tumor werden. Mit Hilfe der Achilles Datenbank (http://www.broadinstitute.org/achilles), die Information von einem RNA-Interferenz Screen in 216 Krebszelllinien enthält, haben wir ein Gen-Netzwerk identifiziert, von dem die untersuchten Zelllinien in unterschiedlichem Ausmass abhingen. Diese erhöte Transkriptions-Abhängigkteit gewisser Krebszelllinien, konnte vorhergesagt werden mit Hilfe der Information über die Anzahl der Kopien von zwölf Genen, die eine zentrale Funktion in der Gen Expression innehaben, sowie der Transkriptions-Arbeit die eine Zelle erledigen muss. Es zeigte sich, dass RNA-Polymerase Untereinheiten codierende Gene im Melanom häufig einen Verlust einer Kopie aufwiesen. Diese Deletierung konnte in der Regel durch den Verlust eines benachbarten Tumorsuppressorgenes begründet werden. Wenn dieser Verlust eine Kopie eines der zwölf Gene betraf, die eine Transkriptions-Abhängigkeit verursachen, erhöhte dies die Sensitivität gegenüber einem RNA-Polymerase Inhibitor. Um in einer Zelle genügend RNA-Polymerase Moleküle zur Verfügung zu haben spielt deren Zusammenbau eine wichtige Rolle. Verschiedene
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sogenannte Chaperon-Proteine sind in den Prozess des Zusammenbaus von RNA-Polymerasen aus den jeweiligen Untereinheiten involviert. In unserer Studie konnten wir aufzeigen, dass der Zusammenbau von RNA-Polymerase II Komplexen vom ERK-Signalweg beeinflusst werden kann. Der ERKSignalweg ist in 90% aller Melanome konstitutiv aktiviert. Am häufigsten geschieht dies durch eine aktivierende BRAFV600-Mutation. Wurden nun BRAFV600-mutierte Melanomzellen mit einem BRAFV600-spezifischen Inhibitor behandelt, konnten sie nur noch wenig RNA-Polymerase II Komplexe zusammenbauen. Dies machte die Zellen empfindlich auf die Behandlung mit einem RNA-Polymerase II Inhibitor. Zusammengefasst zeigen unsere Resultate, dass RNA-Polymerasen ein interessanter neuer Therapieansatzpunkt für Tumoren sein können, die eine starke Transkriptions-Abhängigkeit aufweisen. Diese Abhängigkeit von RNAPolymerasen kann dabei entweder intrinsisch durch genetische Veränderungen der Tumorzellen bedingt sein oder exogen durch Hemmer von onkogenen Signalwegen induziert werden.
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