Untersuchung Des Immunmodulatorischen Effekts Von Ipse/alpha

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Aus dem Forschungszentrum Borstel Forschungsgruppe Experimentelle Pneumologie Programmbereich Asthma und Allergie Direktor: Prof. Dr. H. Fehrenbach Untersuchung des immunmodulatorischen Effekts von IPSE/alpha-1 aus Schistosoma mansoni-Eiern auf humane B-Zellen und Monozyten Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Universität zu Lübeck Aus der Sektion Naturwissenschaften vorgelegt von Kristina Langhans aus Heide Lübeck 2015 1 1. Berichterstatter/Berichterstatterin: Prof. Dr. rer. nat. Heinz Fehrenbach 2. Berichterstatter/Berichterstatterin: Prof. Dr. rer. nat. Tamás Laskay Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2016 Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 17.02.2016 2 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung ................................................................................................................. 7 Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................... 9 1 Einleitung ..................................................................................................................... 12 1.1 Regulation der T-Helfertyp 2 (Th2)-Immunantwort durch ......................................... Schistosoma mansoni ............................................................................................... 12 1.1.1 T-Helfertyp 2 (Th2)-Immunantwort bei Allergie ............................................... 12 1.1.2 Schistosoma mansoni als Modellorganismus der Immunregulation ................... 13 1.1.3 Der Helminth Schistosoma mansoni ................................................................... 14 1.1.4 T-Zell-Immunantwort während der Infektion mit S. mansoni ............................ 15 1.1.5 Das Schistosomen-Ei als Modulator des Immunsystems des Wirts ................... 16 1.1.6 IPSE/alpha-1 ....................................................................................................... 16 1.1.7 Das Granulom ..................................................................................................... 18 1.1.7.1 B-Zellen .............................................................................................................. 19 1.1.7.2 IL-10-produzierende B-Zellen ............................................................................ 19 1.1.7.3 Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen ........................................... 20 1.1.8 Zytokine .............................................................................................................. 21 1.1.8.1 Interleukin-4 ........................................................................................................ 22 1.1.8.2 Interleukin-10 ...................................................................................................... 22 1.1.8.3 Interleukin-6 ........................................................................................................ 23 1.1.8.4 Tumornekrosefaktor (TNF)-α ............................................................................. 23 1.2 Zielsetzung ............................................................................................................... 24 3 Inhaltsverzeichnis 2 3 Material ........................................................................................................................ 26 2.1 Reagenzien und Verbrauchsmittel ........................................................................... 26 2.2 Geräte und Software ................................................................................................ 28 Methoden ...................................................................................................................... 29 3.1 Aufreinigung von humanen Immunzellen aus dem peripheren Blut ....................... 29 3.1.1 Aufreinigung von mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC) ........... 30 3.1.2 Aufreinigung von humanen Lymphozyten und Monozyten aus PBMC ............ 30 3.1.3 Aufreinigung von humanen B-Zellen aus isolierten Lymphozyten ........................ (FZ Borstel) ......................................................................................................... 31 3.1.4 Aufreinigung von humanen B-Zellen (LUMC, Leiden) ..................................... 32 3.2 Zellkulturexperimente mit aufgereinigten, humanen Immunzellen ........................ 33 3.2.1 Bindung von IPSE/alpha-1 an humane mononukleäre Blutzellen ...................... 33 3.2.2 Blockierung der Bindung von IPSE/alpha-1 an humane B-Zellen ..................... 34 3.2.3 Aufnahme von IPSE/alpha-1 in humane B-Zellen ............................................. 35 3.2.4 Stimulation der humanen B-Zellen ..................................................................... 35 3.2.5 Sortierung der SEA- bzw. HEK-IPSE-bindenden B-Zellen mit anschließender .... Stimulation (LUMC, Leiden) .............................................................................. 36 3.2.6 Monozytenkultur ................................................................................................. 37 3.2.7 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten (moDCs) ...................... 37 3.3 Fluoreszenzzytometrische und –mikroskopische Arbeiten ..................................... 38 3.3.1 Markierung von IPSE/alpha-1, Omega-1 und anti-IgG/IgM .............................. 38 3.3.2 Mikroskopischer Nachweis von IPSE/alpha-1 in humanen B-Zellen ................ 40 3.3.3 Durchflusszytometrische Untersuchung von Immunzellen (FZ Borstel) ........... 40 3.3.4 Intrazelluläre Färbung der B-Zellen (LUMC, Leiden) ....................................... 41 4 Inhaltsverzeichnis 4 3.4 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA) ................................... 42 3.5 Statistik .................................................................................................................... 44 Ergebnisse .................................................................................................................... 45 4.1 IPSE/alpha-1 bindet an B-Zellen und Monozyten ................................................... 45 4.2 Interaktion von IPSE/alpha-1 mit humanen B-Zellen ............................................. 46 4.2.1 IPSE/alpha-1 bindet an bis zu 80% der humanen B-Zellen ................................ 47 4.2.2 Die Bindung von IPSE/alpha-1 lässt sich mit anti-IgG/IgM blockieren ............ 49 4.2.3 IPSE/alpha-1 wird in die B-Zellen aufgenommen – FACS Analyse .................. 50 4.2.4 IPSE/alpha-1 wird in die B-Zellen aufgenommen – Lebendzell-Mikroskopie .. 52 4.2.5 Der Einfluss von IPSE/alpha-1 auf die Funktion von humanen B-Zellen .......... 55 4.2.6 Nur B-Zellen, die IPSE/alpha-1 binden, produzieren IL-10 ............................... 59 4.2.7 IPSE/alpha-1-bindende B-Zellen exprimieren für .................................................. IL-10-produzierende B-Zellen typische Oberflächenmarker .............................. 61 4.3 Pilotstudien zur Expression der IgE-Rezeptoren und deren Beladung ........................ mit IgE auf Monozyten ............................................................................................ 65 5 Diskussion .................................................................................................................... 70 5.1 Humane B-Zellen und ihre Interaktion mit IPSE/alpha-1 ....................................... 70 5.1.1 IPSE/alpha-1 bindet an den B-Zell-Rezeptor der B-Zellen ................................ 70 5.1.2 IPSE/alpha-1 wird von humanen B-Zellen aufgenommen ................................. 71 5.1.3 In der Gesamtpopulation der CD19-positiven B-Zellen ist nach Stimulation ........ mit IPSE/alpha-1 keine Freisetzung von IL-10 nachweisbar.............................. 74 5.1.4 Nur B-Zellen, die IPSE binden, produzieren IL-10 und weisen eine ..................... erhöhte Expression von Oberflächenmarkern charakteristisch für ....................... regulatorische B-Zellen auf................................................................................. 75 5 Inhaltsverzeichnis 5.2 Pilotversuche zur IgE-Rezeptor Expression und Beladung mit IgE ............................ auf Monozyten ......................................................................................................... 75 5.3 6 Ausblick ................................................................................................................... 77 Literaturverzeichnis ...................................................................................................... 78 Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................................... 86 Veröffentlichungen .............................................................................................................. 87 Danksagung ......................................................................................................................... 88 6 Zusammenfassung Zusammenfassung Epidemiologische Studien und Tierexperimente belegen, dass Infektionen mit parasitären Würmern (Helminthen) vor allergischen Erkrankungen schützen. Helminthen induzieren zwar im Wirt eine auch für Allergien typische Th2-Immunantwort, diese beinhaltet allerdings im Gegensatz zur allergischen Reaktion auch eine regulatorische Komponente. Letztere ist u. a. gekennzeichnet durch die Induktion IL-10-produzierender B-Zellen und sogenannter alternativ-aktivierter Makrophagen (AAM), die ebenfalls IL-10 produzieren und wundheilende Eigenschaften besitzen. Der Pärchenegel Schistosoma mansoni ist ein parasitärer Wurm mit hoher immunmodulatorischer Kapazität. Verantwortlich für Th2-Induktion und Immunsuppression sind die Eier des Parasiten. Diese sezernieren Proteine, die mit den rekrutierten Immunzellen im Ei-Granulom interagieren können. Das Glykoprotein IPSE/alpha-1 stellt mit ca. 80% die Hauptkomponente der sezernierten Proteine dar. IPSE/alpha-1 bindet an Immunglobuline und induziert über Bindung an FcεRI-gebundenes IgE die Freisetzung der Interleukine (IL)-4 und-13 aus basophilen Granulozyten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 auch mit anderen Immunzellen, die an der regulatorischen Immunantwort beteiligt sind, insbesondere B-Zellen und Monozyten/Makrophagen, interagiert. Eine Charakterisierung der Interaktion mit B-Zellen ergab, dass IPSE/alpha-1 über den B-Zellrezeptor (membranständiges IgG/IgM) an B-Zellen bindet, von ihnen aufgenommen und in die Nähe des Zellkerns transportiert wird. B-Zellen, die IPSE/alpha-1 gebunden hatten, exprimierten verstärkt für regulatorische B‑Zellen charakteristische Oberflächenmarker und produzierten vermehrt das anti‑inflammatorische Zytokin IL-10. IPSE/alpha-1 könnte somit an der Induktion einer regulatorischen B-Zell-Antwort beteiligt sein. Da Monozyten Rezeptoren für IgE exprimieren können und damit ein potentielles Ziel für IPSE/alpha-1 darstellen, wurden in dieser Arbeit in Vorversuchen zunächst die Bedingungen für eine optimale Rezeptorexpression und damit auch IgE-Beladung ermittelt. Während beide IgE-Rezeptoren für eine optimale Expression IL-4 benötigten, unterschieden sie sich 7 Zusammenfassung deutlich in der zeitlichen Expressionsabfolge: Der niedrig-affine Rezeptor wurde bereits nach 24h, der hoch-affine Rezeptor erst nach 6 d hochreguliert. Diese hier ermittelten Bedingungen bilden die Grundlage für zukünftige Untersuchungen zum Einfluss von IPSE/alpha-1 auf Monozyten/Makrophagen während einer Schistosomen-Infektion. Zusammenfassend konnte hier gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 mit B-Zellen und Monozyten interagiert. B-Zellen zeigen nach Kontakt mit IPSE/alpha-1 einen regulatorischen Phänotyp, der als protektiv bei allergischer Atemwegsinfektion gilt. Somit ist IPSE/alpha-1 ein potentieller Kandidat für eine mögliche therapeutische Intervention bei chronischen Entzündungen, wie z.B. Allergien und Asthma. 8 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Neben den SI-Einheiten wurden folgende Abkürzungen verwendet: 7-AAD 7-Aminoactinomycin A. dest Aqua destillata AAM alternativ-aktivierte Makrophagen ADAM a disintegrin and metalloproteinase AF488 Alexa Fluor 488 APC Allophycocyanin APZ Antigen-präsentierende Zelle Breg regulatorische B-Zellen (IL-10-produzierende B-Zellen) BSA bovines Serumalbumin BSF B-cell stimulating factor biot. Biotinyliert BZR B-Zell-Rezeptor c Konzentration CCL2 CC-Chemokin-Ligand-2 CD cluster of differentiation CLR c-type lectin-Rezeptor d Tage (englisch days) DC DMSO dendritische Zellen (englisch dendritic cell) Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (englisch deoxyribonucleic acid) EDTA Ethylendiamintetraazetat EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay ER endoplasmatisches Retikulum ESP exkretorische/sekretorische Proteine FACS fluorescence-activated cell sorting FCS fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat DC-SIGN 9 Abkürzungsverzeichnis FMO fluorescence minus one Foxp3 Forkhead-Box-Protein P3 FSC Vorwärtsstreulicht (englisch Forward Scatter) GM-CSF granulocyte macrophage colony-stimulating factor h Stunde (englisch hour) HBSS Hank's Balanced Salt Solution HEK Human Embryonic Kidney HRP Meerrettichperoxidase (englisch horseradish peroxidase) Ig Immunglobulin IL Interleukin IPSE Interleukin-4-induzierendes Prinzip aus Schistosoma mansoni-Eiern ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif kDa Kilodalton LNFPIII Lacto-N-fucopentaose III LPS Lipopolysaccharid LUMC Leiden University Medical Center MACS magnetic-activated cell sorting MEG min micro exon gene Haupthistokompatibilitätskomplex (englisch Major Histocompatibility Complex) Minute moDC monocyte-derived dendritic cell MR Mannose Rezeptor MW Molekulargewicht (englisch molecular weight) NHS N-Hydroxysuccinimid n.d. nicht detektierbar nIPSE natürliches IPSE NKT-Zelle natürliche Killer-T-Zelle NLS nuclear localization sequence nm Nanometer NO Stickstoffmonoxid (englisch nitric oxide) ns nicht signifikant ODnm Optische Dichte gemessen bei X nm mononukleäre Zellen des peripheren Blutes ( englisch Peripheral Blood Mononuclear Cell) phosphatgepufferte Salzlösung (englisch phosphate buffered saline) MHC PBMC PBS 10 Abkürzungsverzeichnis PE Phycoerythrin PerCP Peridinin Chlorophyll Protein PF488 Promo Fluor 488 PFA Paraformaldehyd PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat PRR Pattern-Recognition Rezeptor RT Raumtemperatur S. mansoni Schistosoma mansoni SD Standardabweichung (englisch standard deviation) SEA soluble egg antigen SIGLEC sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins SSC Seitwärtsstreulicht (englisch Side Scatter) Th-Antwort T-Helferantwort TLR Toll-ähnlicher Rezeptor (englisch toll-like receptor) TMB Tetramethylbenzidin TNF-α Tumornekrosefaktor-α Treg regulatorische T-Zellen u. a. unter anderem vs. versus WHO World Health Organization 11 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Regulation der T-Helfertyp 2 (Th2)-Immunantwort durch Schistosoma mansoni Die Inzidenz von allergischen Erkrankungen, wie allergische Rhinitis, allergisches Asthma und Dermatitis, hat in den letzten drei Jahrzehnten stark zugenommen. Laut WHO (World Health Organization) sind weltweit ungefähr 235 Millionen Menschen betroffen (WHO, 2013). Die steigende Anzahl an allergischen Erkrankungen in urbanisierten Bevölkerungen legt die Vermutung nahe, dass Faktoren des westlichen Lebensstils mit dieser Zunahme assoziiert sind (Review von Yazdanbakhsh et al., 2002). Neben allergischen Erkrankungen ist auch die Infektion mit Helminthen durch eine Th2vermittelte IgE-Synthese und Eosinophilie gekennzeichnet (Maizels und Yazdanbakhsh, 2003). Es kommt jedoch zu keinen allergischen Symptomen. Das könnte dadurch erklärt werden, dass die Helminthen zusätzlich entzündungshemmende Effekte besitzen (Aranzamendi et al., 2013). 1.1.1 T-Helfertyp 2 (Th2)-Immunantwort bei Allergie Allergische Reaktionen sind auf eine Th2-Antwort zurückzuführen. Die Th2-Zellen produzieren die Zytokine Interleukin (IL)-4, IL-5 und IL-13 (Robinson et al., 1992). IL-4 und IL-13 sind verantwortlich für den Klassenwechsel von Immunglobulin (Ig)G- zu IgEproduzierenden Plasmazellen (Romagnani, 1994). Mastzellen und basophile Granulozyten werden mit diesem IgE über den hoch-affinen IgE-Rezeptor (FcεRI) beladen (Kawakami und Galli, 2002). IL-5 lockt eosinophile Granulozyten an (Nakajima und Takatsu, 2007). 12 Einleitung 1.1.2 Schistosoma mansoni als Modellorganismus der Immunregulation Ein Beispiel für einen Helminthen mit hoher immunregulatorischer Kapazität ist der Pärchenegel Schistosoma mansoni, der daher ein sinnvolles Modell darstellt, die Mechanismen der Immunregulation zu untersuchen. Die Erkenntnisse könnten zur Therapie von Allergie und Asthma genutzt werden. In Abbildung 1-1 ist die Immunantwort der Infektion mit Helminthen und der allergischen Reaktion vergleichend dargestellt. Helminthen und Allergene induzieren eine Eosinophilie und eine Th2-vermittelte IgE-Synthese über dendritische Zellen (DC). Die Helminthen induzieren jedoch auch zusätzlich ein regulatorisches Netzwerk aus regulatorischen T-Zellen (Treg), IL-10-produzierenden B-Zellen (Breg) und alternativ-aktivierten Makrophagen (AAM). Abbildung 1-1: Vergleich der Immunantwort, die durch Helminthen oder Allergene ausgelöst wird (Aranzamendi et al., 2013). Sowohl die Infektion mit Helminthen als auch die Allergie lösen eine Th2Antwort mit IgE-produzierenden B-Zellen und Eosinophilie. Die Helminthen jedoch induzieren auch eine regulatorische Immunantwort mit regulatorischen T-Zellen (Treg), IL-10-produzierenden B-Zellen (Breg) und alternativ-aktivierten Makrophagen (AAM), die die Th2-Antwort moduliert. Im folgenden Abschnitt wird genauer auf den Helminthen S. mansoni, als Modellorganismus der Immunregulation, eingegangen. 13 Einleitung 1.1.3 Der Helminth Schistosoma mansoni S. mansoni, der im Deutschen auch als Pärchenegel bezeichnet wird, gehört zu den Trematoden. Laut WHO sind ungefähr 260 Millionen Menschen weltweit mit Schistosomen infiziert (WHO, 2015). Für den Lebenszyklus von S. mansoni, der in Abbildung 1-2 dargestellt ist, ist die Schnecke Biomphalaria glabrata als spezifischer Zwischenwirt von Bedeutung. Diese Schnecken leben in stehenden und langsam fließenden Gewässern. Im Wasser werden von den infizierten Schnecken Zerkarien in das Wasser abgegeben. Die Zerkarien können sich dann durch die Haut des Endwirtes (Mensch) bohren. Bei dem Eindringen in die Haut verlieren die Zerkarien den Gabelschwanz und entwickeln sich zum Schistosomulum. Von dort wandern die Schistosomula ins Blut und gelangen über die Lunge und das Herz zur Pfortader. Nach der Paarung wandern die Pärchen in die Mesenterialvenen des Darms. Das Weibchen legt ca. 300 Eier pro Tag. Etwa 50% der Eier gelangen in den Darm und werden mit dem Stuhl ausgeschieden. Wenn die ausgeschiedenen Eier ins Süßwasser gelangen und Lichtkontakt erhalten, schlüpfen aus den Eiern die Mirazidien, die dann wieder den Zwischenwirt infizieren können. Abbildung 1-2: Lebenszyklus von S. mansoni (Pearce und MacDonald, 2002). Die Zerkarien, die sich im Süßwasser befinden, penetrieren die Haut des Endwirts und transformieren beim Durchtritt zu Schistosomula. Diese wandern über das Blut in das Pfortadersystem, wo die Schistosomula zu adulten Würmern reifen, sich paaren und Eier legen. Die reifen Eier wandern durchs Gewebe in den Darm und werden über den Stuhl abgegeben. Wenn die Eier mit Süßwasser in Kontakt kommen, werden die Mirazidien frei, die den Zwischenwirt infizieren. In diesem entwickeln sich die Zerkarien, die dann wieder freigesetzt werden können. 14 Einleitung 1.1.4 T-Zell-Immunantwort während der Infektion mit S. mansoni Die T-Zellantwort verändert sich im Laufe der Infektion mit S. mansoni (Abbildung 1-3). Die ersten fünf bis sechs Wochen nach der Infektion werden als akute Phase der Schistosomiasis bezeichnet. In dieser Zeit ist die T-Zellantwort von Th1-Zellen geprägt. Nachdem sich die Schistosomen gepaart haben und die Eiablage begonnen hat, wird von der chronischen Phase gesprochen. In dieser Phase wird die Th1-Antwort von einer Th2Antwort abgelöst. Die Th2-Antwort wiederum wird ab Woche 9 – 12 durch die Induktion einer regulatorischen Antwort modifiziert (Pearce und MacDonald, 2002). Da die Th1-Antwort erst mit Beginn der Eiablage von einer Th2-Antwort abgelöst wird, und „single sex“ Infektion, z.B. nur mit Männchen, ohne Eiablage, weder eine Th2-Antwort noch eine Regulation induzieren, ist davon auszugehen, dass die Schistosomen-Eier für die Th2Antwort und die spätere Regulation verantwortlich sind. Abbildung 1-3: Entwicklung der T-Zellantwort während der Infektion mit S. mansoni (Pearce und MacDonald, 2002, modifiziert). Während der Infektion mit S. mansoni werden mindestens drei Phasen der Immunantwort durchlaufen. In den ersten 5 Wochen dominiert die Th1-Antwort, die mit Beginn der Eiablage von einer Th2-Antwort abgelöst wird. Ab Woche 9 - 12 wird diese Th2-Antwort durch die Induktion einer regulatorischen Immunantwort modifiziert. 15 Einleitung 1.1.5 Das Schistosomen-Ei als Modulator des Immunsystems des Wirts Reife Schistosomen-Eier sezernieren Proteine, die als exkretorische/sekretorische Proteine (ESP) bezeichnet werden. Die Anzahl der sezernierten Faktoren ist umstritten und reicht von 6 (Ashton et al., 2001) bis 188 (Cass et al., 2007). Bisher wurden vor allem zwei Glykoproteine im ESP (IPSE/alpha-1 und Omega-1) identifiziert und charakterisiert, wobei IPSE/alpha-1 rund 80% der gesamten ESP ausmacht (Mathieson und Wilson, 2010). Weitere Proteine, die bisher im ESP gefunden wurden, sind micro exon gene (MEG)3-Proteine, die möglicherweise an dem proteolytischen Abbau von Gewebe beteiligt sind (Ashton et al., 2001) und ESP15, das ein Mitglied der MEG2-Familie ist und dessen Funktion bisher noch nicht bekannt ist (Mathieson und Wilson, 2010). Omega-1 ist ein Glykoprotein, vermittelt hepatotoxische Effekte (Dunne et al., 1991) und besitzt eine Ribonuklease-Aktivität (Fitzsimmons et al., 2005). Diese scheint eine wichtige Rolle bei der Induktion einer Th2-Immunantwort durch Omega-1 in vitro und in vivo zu spielen (Everts et al., 2012). Omega-1 konditioniert dendritische Zellen, die von Monozyten abstammen, in vitro in einer Weise, dass naive CD4-positive T-Zellen in die Th2-Richtung differenzieren (Steinfelder et al., 2009; Everts et al., 2009). IPSE/alpha-1 ist Gegenstand dieser Arbeit und wird im nächsten Kapitel näher beschrieben. 1.1.6 IPSE/alpha-1 IPSE/alpha-1 steht für „IL-4-induzierendes Prinzip aus Schistosoma mansoni Eiern“ (Schramm et al., 2003). Es induziert die Freisetzung von IL-4 und IL-13 aus basophilen Granulozyten. Abgesehen davon wurde es als „Alpha-1“ zusammen mit Omega-1 und Kappa-5 als eines von drei Hauptantigenen aus Schistosomen-Eiern identifiziert (Dunne et al., 1991) und wird daher als „IPSE/alpha-1“ bezeichnet (Schramm et al., 2006). IPSE/alpha-1 wird ausschließlich im Eistadium des Parasiten produziert, reichert sich direkt unter der Eischale an (Abbildung 1-4) und wird von dort ins Granulom abgegeben. Hier kommt es mit den Immunzellen in Kontakt, kann an Rezeptoren binden und aufgenommen werden (Schramm et al., 2006). 16 Einleitung Abbildung 1-4: Immunhistologischer Nachweis von IPSE/alpha-1 (rot) in Eiern von S. mansoni (Schramm et al., 2006). In Schnitten von S. mansoni-infizierter Mausleber wurde IPSE/alpha-1 mit einem spezifischen monoklonalen anti-IPSE/alpha-1 Antikörper nachgewiesen. IPSE/alpha-1 wird ausschließlich im Eistadium produziert und reichert sich dort an. Es wird nach der Freisetzung auch in den Immunzellen im Granulom gefunden. Die strukturelle Charakterisierung des Glykoproteins IPSE/alpha-1 ergab, dass es ein Homodimer mit einer Größe von rund 40 kDa ist (Wuhrer et al., 2006). Ein Monomer (ca. 20 kDa) besteht jeweils aus 114 Aminosäuren und nimmt die Struktur eines βγ-Crystallins an (Meyer et al., 2015). βγ-Crystalline weisen eine extrem hohe Stabilität gegenüber einem niedrigen pH-Wert, hohen Temperaturen oder 6 M Harnstoff auf. Des Weiteren besitzt ein Monomer sieben Cysteine. Zwei Monomere bilden ein Dimer über eine Disulfidbrücke. Zusätzlich trägt jedes Monomer zwei N-Glykosylierungsstellen (Wuhrer et al., 2006). Diese N-Glykane sind in Abbildung 1-5 dargestellt und tragen das Lewis XMotiv. 70% der IPSE-Dimere sind an allen vier Stellen glykosyliert, während 30% nur an drei Stellen glykosyliert sind. Abbildung 1-5: Glykosylierung von IPSE/alpha-1 (Meevissen et al., 2012). Dreieck, Fukose; Quadrat, N-Acetylglucosamin; weißer Kreis, Galaktose; schwarzer Kreis, Mannose; LeX, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc. 17 Einleitung Die funktionelle Charakterisierung von IPSE/alpha-1 ergab, dass die Induktion der Zytokinfreisetzung aus Basophilen nicht-sensibilisierter gesunder Spender Antigenunabhängig erfolgt. Dabei bindet IPSE/alpha-1 an IgE, das an FcεRI-Rezeptoren auf der Oberfläche von Basophilen gebunden ist. Darüber hinaus bindet IPSE/alpha-1 nicht nur an IgE, sondern auch an andere Immunglobuline, ist also generell ein Immunglobulinbindender Faktor (Schramm et al., 2003). Neben Basophilen gibt es auch andere Immunzellen im Schistosomen-Ei-Granulom, die Immunglobuline auf der Oberfläche tragen, und somit ein potentielles Ziel für IPSE/alpha-1 darstellen wie z.B. B-Zellen und Monozyten. 1.1.7 Das Granulom Nach Ablage der Eier an der Venenwand, werden diese von Endothelzellen umschlossen und in das Gewebe integriert. Es bildet sich ein Granulom um das Schistosomen-Ei. Für die Granulombildung und die Ausscheidung der Eier aus dem Darm ist eine intakte Th2Antwort notwendig (Doenhoff et al., 1978, Cheever et al., 1993). Wenn auch noch nicht in allen Details vollständig verstanden, so scheint das Granulom eine doppelte Funktion zu haben: 1.) Es ist essentiell für die Wanderung der Eier durch das Gewebe und letztendlich für die Ausscheidung in das Darmlumen und somit Garant für die Vollendung des Lebenszyklus der Schistosomen. 2.) Es besteht größtenteils aus Th2-artigen Immunzellen mit entzündungshemmender Aktivität und scheint damit eine Schutzfunktion für den Wirt zu vermitteln. Das Granulom wird durch CD4-positive T-Zellen induziert, aber auch CD8-positive T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen spielen bei der Regulation der Granulombildung eine Rolle (Fallon et al., 1998; Jankovic et al., 1998, De‘Broski et al., 2004). Des Weiteren enthält das Schistosomen-Ei-Granulom viele eosinophile Granulozyten (Moore et al., 1977), und kürzlich konnten auch basophile Granulozyten nachgewiesen werden (Anyan et al., 2013). Nachdem IPSE/alpha-1 generell an Immunglobuline bindet, sollte in dieser Arbeit die Interaktion dieses Moleküls mit anderen Immunglobulin-tragenden Zellen des Granuloms, außer Basophilen, untersucht werden. Der Fokus lag auf B-Zellen, die den BZR auf der 18 Einleitung Oberfläche tragen und auf Monozyten, die die hoch- und niedrig-affinen Rezeptoren für IgE (FcεRI und CD23) exprimieren. 1.1.7.1 B-Zellen Die B-Zellen gehören zum erworbenen (= adaptiven) Immunsystem. Ihre bekannteste Funktion ist die Produktion von Antikörpern zur Abwehr von Pathogenen. B-Zellen zählen aber auch zu den Antigen-präsentierenden Zellen. Sie erkennen Pathogene über Antigenspezifische BZR. Der BZR ist ein membrangebundenes Immunglobulin und hat, wie andere Antikörper auch, eine spezifische Antigenbindungsstelle. Das an den BZR gebundene Antigen wird aufgenommen und zu Peptidfragmenten prozessiert. Diese Peptide können anschließend den CD4-positiv T-Zellen über Major Histocompatibility Complex (MHC)-II präsentiert werden (Yuseff et al., 2013). Des Weiteren ist bekannt, dass die B-Zellen Zytokine produzieren und in Zytokine-produzierende Untergruppen eingeteilt werden können (Bao und Cao, 2014). Besondere Aufmerksamkeit wird den IL-10-produzierenden B-Zellen gewidmet, da von ihnen eine suppressive Immunantwort ausgehen kann (Blair et al., 2010; Bouaziz et al., 2010; Iwata et al., 2011). 1.1.7.2 IL-10-produzierende B-Zellen IL-10, welches von B-Zellen freigesetzt wird, spielt eine Rolle bei der Suppression von ulzerativer Colitis und experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (Fillarteau et al., 2002; Mizoguchi et al., 2002). Des Weiteren senken IL-10-produzierende B-Zellen die pathologische Th2-Antwort im Allergie-Mausmodell (Smits et al., 2007; Hussaarts et al., 2011). Auch bei der Infektion mit S. mansoni werden IL-10-produzierende B-Zellen ab Woche 12 induziert (van der Vlugt et al., 2012). Zu diesem Zeitpunkt der Infektion sind die S. mansoni Eier reif und sezernieren unter anderem IPSE/alpha-1. Der Mechanismus der Induktion von IL-10-produzierenden B-Zellen ist jedoch bisher unbekannt. Bislang sind IL-10-produzierende B-Zellen nur durch die Fähigkeit IL-10 zu produzieren beschrieben. Es werden zurzeit noch Oberflächenmarker gesucht, die die ganze Population der IL-10-produzierenden B-Zellen (auch regulatorische B-Zellen genannt) beschreiben. 19 Einleitung Bisher bekannt sind CD1d-positive B-Zellen, CD24hi CD27hi-B-Zellen und CD38hi CD24hiB-Zellen, die die Population von IL-10-produzierenden B-Zellen teilweise umschreiben. CD1d-positive B-Zellen werden in S. mansoni infizierten Patienten gefunden (Correale et al., 2008; van der Vlugt et al., 2012). CD1d ist ein MHC-I-ähnliches Protein. Glykolipide können so den natürlichen Killer-T-Zellen (NKT-Zellen) präsentiert werden (Bendelac et al., 1995). CD1d-positive B-Zellen besitzen einen protektiven Effekt gegen allergische Atemwegserkrankungen, die aber nicht von NKT-Zellen abhängig sind (Amu et al., 2010). CD24hi CD27hi-B-Zellen wurden im Blut von gesunden Spendern oder Spendern mit Autoimmunerkrankungen charakterisiert (Iwata et al., 2011). CD24 und CD27 regulieren die Proliferation, Differenzierung und Reifung von B-Zellen (Murphy et al., 2012). CD24hi CD27hi-B-Zellen sind in Patienten mit allergischem Asthma funktionell in der Produktion von IL-10 reduziert (van der Vlugt et al., 2014b). CD38hi CD24hi-B-Zellen sind in Patienten mit systemischem Lupus erythematodes funktionell beeinträchtigt (Blair et al., 2010). CD38 wird auf Plasmazellen und aktivierten B-Zellen exprimiert (Murphy et al., 2012). 1.1.7.3 Monozyten, Makrophagen und dendritische Zellen Monozyten gehören zu den mononukleären Immunzellen und zirkulieren im Blut. Sie besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose und werden durch das Chemokin CCL2 aus dem Blut ins Gewebe gelockt. Dort differenzieren sie zu Makrophagen (Rollins, 1996; Shi und Pamer, 2011). In Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 können die Monozyten in vitro auch zu dendritischen Zellen (moDC) differenzieren (Sallusto und Lanzaveccia, 1994). Es ist bekannt, dass Monozyten Rezeptoren für Immunglobuline auf der Oberfläche tragen. Neben den Rezeptoren für IgG (FcγRI, FcγRIIA und B sowie FcγRIIIA), können Monozyten auch Rezeptoren für IgE (FcεRI und FcεRII (CD23)) exprimieren (Daëron, 2014). Die Expression von FcεRI ist jedoch hoch variabel. Bisher wurde derer hoch-affine FcεRI hauptsächlich auf Mastzellen und Basophilen untersucht. Auf diesen Zellen wird der FcεRI konstitutiv exprimiert und besteht aus einer IgE-bindenden α-Kette, einer β-Kette mit vier transmembranären Domänen und zwei Signal-transduzierenden γ-Ketten (αβγγ) (Metzger, 1992). Auf den Antigen-präsentierenden Zellen (APZ) wie Monozyten und dendritischen 20 Einleitung Zellen zeigte sich jedoch, dass die β-Kette fehlt (αγγ). Darüber hinaus kann der FcεRI von den APZ internalisiert werden (Bieber, 1996). Es ist beschrieben, dass Monozyten in Anwesenheit von IL-4 den IgE-niedrig-affinen Rezeptor CD23 exprimieren (Alderson et al., 1994; Aiba et al., 2003). Aber auch die Expression des FcεRI kann durch IL-4 induziert werden, wenn aus den Monozyten moDC generiert werden (van den Heuvel et al., 1998). In den APZ gibt es intrazellulär präformierte hoch-affine IgE-Rezeptoren, die nach Stimulation an der Oberfläche exprimiert werden (Bieber, 1996). Makrophagen können in klassisch-aktivierte Makrophagen und alternativ-aktivierte Makrophagen unterschieden werden. Während klassisch-aktivierte Makrophagen inflammatorische Mediatoren wie TNF-α freisetzen und intrazelluläre Pathogene durch Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) abtöten können, führt die Anwesenheit von IL-4 zu einer alternativen Aktivierung der Makrophagen, die kein NO produzieren (Stein et al., 1992; Modolell et al., 1995). Humane alternativ-aktivierten Makrophagen (AAM) exprimieren den Mannose-Rezeptor (MR) CD206 und DC-SIGN (CD209) (Mosser, 2003). Sie produzieren Arginase und setzen IL-10 frei. Eine Funktion von AAM ist die Neustrukturierung und Reparatur von Gewebe. 1.1.8 Zytokine Die Eier von S. mansoni induzieren unter Mitwirkung von Omega-1 eine Th2-Antwort (Steinfelder et al., 2009; Everts et al., 2009). Das Hauptzytokin von Th2-Zellen ist IL-4. Außerdem setzen basophile Granulozyten nach der Inkubation mit IPSE/alpha-1 sehr schnell große Mengen präformiertes IL-4 frei (Schramm et al., 2003). IL-4 spielt somit eine wichtige Rolle bei der Immunmodulation durch S. mansoni. IL-10 ist ein anti-inflammatorisches Zytokin und wird unter anderem von regulatorischen T-Zellen und alternativ-aktivierten Makrophagen produziert (Couper et al., 2008). IL-10 ist wichtig für das regulatorische Netzwerk, das durch S. mansoni induziert wird. IL-6 oder TNF-α werden als typische proinflammatorische Zytokine beispielhaft als Gegenspieler zu IL-10 betrachtet und damit in dieser Arbeit parallel zu IL-10 bestimmt. 21 Einleitung 1.1.8.1 Interleukin-4 Interleukin-4 wurde zunächst als B cell Stimulatory Factor-1 (BSF-1) beschrieben. Es führt zur Aktivierung und klonalen Expansion von B-Zellen (Mongini et al., 2005). Außerdem induziert IL-4 auch die Expression von MHC-II auf B-Zellen (Roehm et al., 1984). IL-4 ist wichtig für die Homöostase des Immunsystems. Durch IL-4 differenzieren naive CD4-positive T-Zellen (Th0) zu Th2-Zellen (Abehsira-Amar et al., 1992). Diese Th2-Zellen produzieren wie auch basophilen Granulozyten IL-4 (Brunner et al., 1993). Ein weiterer Effekt von IL-4 ist, dass in den Plasmazellen ein Klassenwechsel zu IgE induziert wird (Romagnani, 1994). Wichtig ist zudem, dass IL-4 alternativ-aktivierte Makrophagen (AAM) aktiviert (Mosser, 2003). Es spielt eine zentrale Rolle bei der Entstehung allergischer Reaktionen und bei der Infektion mit Helminthen. 1.1.8.2 Interleukin-10 IL-10 ist ein anti-inflammatorisches Zytokin. Anfangs wurde IL-10 als ein Th2-spezifisches Zytokin charakterisiert, welches Th1-Zellen inhibiert (Fiorentino et al., 1989). IL-10 wird von Makrophagen, dendritischen Zellen, B-Zellen und Populationen von CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen produziert (Kamanaka et al., 2006). Weitere Untersuchungen zeigten, dass IL-10 mit regulatorischen T-Zellen assoziiert ist (Moore et al., 2001). Das IL-10, das von regulatorischen T-Zellen produziert wird, supprimiert die Immunantwort, was mit der Expression von Forkhead box transcription factor 3 (Foxp3) verknüpft ist (Wan und Flavell, 2007). B-Zellen und auch Monozyten, die IL-10 produzieren, können auch nach Stimulation die pro-inflammatorischen Zytokine IL-6 oder TNF-α produzieren. Ein Beispiel hierfür sind B-Zellen, die nach TLR-Ligation nicht nur IL-10, sondern auch IL-6 produzieren (van der Vlugt et al., 2014a). Daher sollte auch IL-6 als pro-inflammatorisches Zytokin parallel bestimmt werden, um unterscheiden zu können, ob es sich wirklich um eine anti-inflammatorische Immunantwort handelt. 22 Einleitung 1.1.8.3 Interleukin-6 IL-6 wurde zunächst als B cell Stimulatory Factor-2 (BSF-2) beschrieben. Die Stimulation von B-Zellen mit BSF-2 führt zur Produktion von Immunglobulinen (Muraguchi et al., 1981; Yoshizaki et al., 1982). Später wurde IL-6 auch als ein Faktor beschrieben, der die Produktion von Akute-Phase-Proteinen in Hepatozyten induziert (Castell et al., 1988) und zytotoxische T-Zellen aktiviert (Okada et al., 1988). Von Bedeutung könnte IL-6 auch in Bezug auf das Gleichgewicht zwischen Th17-Zellen und Treg sein. IL-6 reguliert das Gleichgewicht zugunsten von Th17 (Kimura und Kishimoto, 2010). 1.1.8.4 Tumornekrosefaktor (TNF)-α TNF-α ist ein wie IL-6 ein pro-inflammatorisches Zytokin. Es ist ein Membran-gebundenes Homotrimer, kann aber auch von der Membran freigesetzt werden (Tang et al., 1996; Black et al., 1997). Es wird unter anderem in großen Mengen von Makrophagen freigesetzt, wenn diese Kontakt zu Bakterien hatten (Männel und Echtenacher, 2000). TNF-α aktiviert Lymphozyten und fördert so entzündliche Prozesse (Marcus et al., 1996). Es erhöht die vaskuläre Permeabilität und führt zur Expression von Adhäsionsmolekülen auf Endothelzellen, so dass Monozyten und neutrophile Granulozyten aus dem Blut ins Gewebe, zum Ort der Entzündung, wandern können. 23 Einleitung 1.2 Zielsetzung Die Eier des parasitären Wurms S. mansoni sind verantwortlich für die Modulation der Immunantwort im Wirt. Sie sezernieren immunmodulatorisch wirksame Substanzen und sind umgeben von sogenannten Granulomen bestehend aus Fibroblasten, Kollagen und Immunzellen, insbesondere eosinophilen Granulozyten, T- und B-Lymphozyten, Monozyten und basophilen Granulozyten. Im Granulom kommen die Immunzellen vor allem mit dem Glykoprotein IPSE/alpha-1 in Kontakt, da es mit rund 80% die Hauptkomponente der vom Schistosomen-Ei sezernierten Proteine darstellt. IPSE/alpha-1 ist ein Immunglobulin-bindender Faktor, der durch Bindung an Rezeptor-gebundenes IgE die Freisetzung von IL-4 und IL-13 aus Basophilen induziert. Da auch andere Immunzellen Immunglobuline auf der Oberfläche tragen, wie z.B. B-Zellen den BZR, stellen auch diese potentielle Interaktionspartner für IPSE/alpha-1 dar. Ziele der vorliegenden Arbeit waren es: 1. weitere Zielzellen von IPSE/alpha-1 zu ermitteln und 2. die Art der Interaktion von IPSE/alpha-1 mit diesen Zellen genauer zu untersuchen. Insbesondere folgende Fragen sollten geklärt werden: a. Interaktion mit B-Zellen: An welche Rezeptoren bindet IPSE/alpha-1? Wird es in die B-Zellen aufgenommen und wenn ja, in welches Zellkompartiment? Ist IPSE/alpha-1 an der Induktion IL-10-produzierenden B-Zellen beteiligt? Die Untersuchung der Interaktion von IPSE/alpha-1 mit B-Zellen wurde in Kooperation mit der Gruppe von Dr. H.H. Smits am LUMC in Leiden durchgeführt. b. Interaktion mit Monozyten: Da schon bekannt war, dass IPSE/alpha-1 mit Basophilen über IgE interagiert, lag das Interesse bei den Monozyten insbesondere auf der Interaktion mit IgE auf den hoch- bzw. niedrig-affinen IgE-Rezeptoren. Dazu sollte zunächst in Voruntersuchungen analysiert werden, ob und unter welchen Bedingungen diese Rezeptoren überhaupt auf der Oberfläche der Monozyten exprimiert werden, und ob sie mit IgE beladen sind. 24 Einleitung Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen dazu beitragen, die Frage zu klären, ob IPSE/alpha-1 für die immunregulatorische Wirkung von Helminthen mitverantwortlich ist. Die Zielsetzung ist in Abbildung 1-6 schematisch dargestellt. Abbildung 1-6: Welchen Effekt hat IPSE/alpha-1 auf humane B-Zellen und Monozyten? IPSE/alpha-1 ist ein Immunglobulin-bindender Faktor und kann an der BZR der B-Zellen oder an IgE, das über FcεRI oder CD23 an Monozyten gebunden ist, binden. Es ist möglich, dass so ein immunmodulierender Effekt auf die Immunzellen ausgelöst wird. 25 Material 2 Material 2.1 Reagenzien und Verbrauchsmittel Folgende in Tabelle 2-1 gelisteten Reagenzien und Verbrauchsmittel wurden für die Durchführung dieser Arbeit verwendet: Tabelle 2-1: Auflistung der verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmittel Produkt Hersteller 0.4 µ-slide VI Ibidi 24-well Platte Costar 6-well Platte Costar 7-Aminoactinomycin (7-AAD) Sigma-Aldrich 96-Well-Rundbodenplatte Costar 96-Well-V-Platte Costar AF488-Hydrazid Invitrogen anti-CD40 (clone 7) Bioceros B.V. anti-IgE Biosource anti-IgG/IgM Jackson ImmunoResearch APC-anti-human IgE BioLegend APC-anti-human IL-10 BD Bioscience Aqua destillata (A. dest.) Braun BD OptEIA IL-10 BD Bioscience BD OptEIA IL-6 BD Bioscience Biotin-anti-human TNF-α eBioscience Brefeldin A Sigma-Aldrich CASY®ton Innovatis CD19-MicroBeads Miltenyi Biotec CompBeads BD Bioscience CpG2006 Invivogen Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) Biowest EDTA (Titrierkomplex III) Roth EGTA Fluka eFluor780-anti-human CD27 eBioscience Eisessig Roth FACS-Röhrchen Falcon Fetales Kälberserum (FCS) PAA FITC-Streptavidin BD Bioscience GM-CSF ImmunoTools Hank’s balanced salt solution (HBSS) Biowest Hoechst 33342 Sigma-Aldrich Horizon V450-anti-human CD38 BD Bioscience Humanes IgE (DIA HE1A) BioPorto Diagnostics A/S 26 Material Interleukin-4 (IL-4) Ionomycin Kaliumchlorid (KCl) Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Kristallviolett L-Glutamin LPS (S. friedenau) LS Columns Lymphosep (Ficoll) LysoTracker Red MACS B cell isolation kit II Mannan Natrimacetat Natriumcarbonat (Na2CO3) Natriumchlorid (NaCl) Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Natriumperjodat Nunc MaxiSorp 96-F-Well Paraformaldehyd (PFA) PE-anti-human CD1d PECy7-anti-human CD24 PECy7-anti-human FcεR1α Penicillin/Streptomycin PerCP-anti-human CD19 PerCPCy5.5-anti human CD23 PF488 Premium Labeling Kit Phorbol-12-myristate-13-acetat (PMA) Qdot525-Streptavidin Rinderserumalbumin (BSA) RPMI 1640 Medium without L-Glutamin Saponin Schwefelsäure Tetramethylbenzidin (TMB) Trypanblau 0,4 % Tween®20 ZebaSpin Säule ImmunoTools Sigma-Aldrich Roth Merck Merck Biowest Prof. Dr. H. Brade, FZ Borstel Miltenyi Biotec Biowest Molecular Probes Miltenyi Biotec Sigma-Aldrich Roth Roth Roth Roth Merck Nunc Sigma-Aldrich BD Bioscience ITK diagnostics BioLegend Biowest BioLegend BioLegend PromoKine Sigma-Aldrich Invitrogen PAA Biowest Sigma-Aldrich Roth Tebu-bio Sigma-Aldrich Roth ThermoScientific 27 Material 2.2 Geräte und Software Tabelle 2-2: In dieser Arbeit verwendete Geräte und Software Produkt Hersteller Aria III (Cell Sorter) BD Bioscience BD Diva Software (Version 7) BD Bioscience BD FACSCanto II BD Bioscience CASY Cell Counter Schärfe System ELISA-Reader Sunrise Tecan ELISA-Washer Tecan FlowJo Software (Version 10.0.7 ) TreeStar Gegenstrom-Elutriator (Model J2-21) Beckman Coulter GraphPad Prism 6 (Version 6.01) GraphPad Software Konfokalmikroskop SP5 Leica LAS-AF Software Leica LSR II BD Bioscience Magellan Software (Version 4) Tecan 28 Methoden 3 Methoden 3.1 Aufreinigung von humanen Immunzellen aus dem peripheren Blut Die Immunzellen wurden aus dem Blut gesunder, freiwilliger Spender gewonnen (Ethikvotum AZ:06-188 des Ethikkomittees der Universität Lübeck: „Periphere Immunzellen als immunologische Indikatoren“). Dafür wurde zunächst eine 0,1 M EDTALösung (pH 7,4) als Antikoagulanz in einem sterilen Gefäß vorgelegt. Anschließend wurde eine periphere Vene punktiert und das gewünschte Volumen an Blut gesammelt, so dass nach der Abnahme ein 10% (v/v) Blut-EDTA-Gemisch für die Isolation von Immunzellen genutzt werden konnte. Abbildung 3-1 zeigt eine Übersicht über die Isolierung und die Verwendung der in dieser Arbeit untersuchten Immunzellen. Abbildung 3-1: Schema zur Aufreinigung und Verwendung der Immunzellen in dieser Arbeit. Aus dem Blut-EDTA-Gemisch wurden zunächst mit der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation die PBMC isoliert. Durch die Gegenstrom-Elutriation konnten die Lymphozyten von den Monozyten getrennt werden. Aus den Lymphozyten wurden die B-Zellen isoliert. Die Monozyten wurden nach der Plastikadhärenz für Versuche genutzt, oder es wurden moDC generiert. Am LUMC wurden die B-Zellen direkt aus den PBMC isoliert. In Klammern sind die entsprechenden Kapitel angegeben. 29 Methoden 3.1.1 Aufreinigung von mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC) PBMC wurden mit Hilfe der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Das FicollSeparationsmedium (1,077 g/ml) wurde mit dem frischen Blut-EDTA-Gemisch überschichtet und 15 min bei 200 x g und 20 °C zentrifugiert. Anschließend wurden 5-10 ml der oberen Plasmaschicht, die auch einen Großteil der Thrombozyten enthielt, vorsichtig entfernt und das Röhrchen mit dem überschichteten Blut-EDTA-Gemisch erneut 20 min bei 500 x g und 20 °C zentrifugiert. Die mit Monozyten und Lymphozyten angereicherte Interphase wurde abgenommen, in ein neues 50 ml Falconröhrchen überführt und mit kaltem PBS gewaschen. Entsprechend der weiteren Verwendung wurden die Zellen danach in HBSS/BSA-Puffer oder Zellkulturmedium aufgenommen. 3.1.2 Aufreinigung von humanen Lymphozyten und Monozyten aus PBMC Humane Lymphozyten und Monozyten wurden mit dem Verfahren der GegenstromElutriation aus den zuvor gewonnenen PBMC (Kapitel 3.1.1) isoliert. Bei der GegenstromElutriation werden die Zellen bei konstanter, niedriger Fließgeschwindigkeit mit Hilfe einer Pumpe in die Elutionskammer einer laufenden Zentrifuge eingespeist. Da die Fließrichtung der Zellen der Zentrifugalkraft entgegengesetzt ist, werden die Zellen entsprechend ihrer Größe aufgetrennt. Durch eine stufenweise Erhöhung der Fließgeschwindigkeit werden zuerst die kompakteren Lymphozyten und danach die größeren Monozyten aus der Elutionskammer gespült. Für die Elutriation wurden die zuvor isolierten PBMC in HBSS/BSA aufgenommen. Bei einer Umdrehungszahl von 3500 U/min und einer Strömungsgeschwindigkeit von 24 ml/min wurden die Zellen in das System eingespeist. Anschließend erfolgte die Sammlung der Zellsuspensionsfraktionen mit unterschiedlichen Volumina bei steigender Strömungsgeschwindigkeit, aber konstanter Zentrifugationsgeschwindigkeit. Nach einem für den hier verwendeten Elutriator (individuelle Zusammenstellung von Pumpe, Schlauchlängen und -durchmesser) zuvor etablierten Protokoll (Tabelle 3-1) eluierten die Lymphozyten in den Fraktionen 25-35 und die Monozyten in den Fraktionen 38-Stopp. Bei der Stopp-Fraktion handelte es sich um die Zellen, die beim Abstoppen der Zentrifuge aus der Elutionskammer gespült wurden. 30 Methoden Tabelle 3-1: Elutriationsprotokoll Geschwindigkeit [ml/min] Volumen [ml] 24 200 25 100 27 50 29 50 32 100 33 100 35 100 38 100 39 100 40 100 43 100 45 100 Stopp 50 Bemerkung verwerfen Lymphozyten Lymphozyten Lymphozyten Lymphozyten Lymphozyten Lymphozyten Monozyten Monozyten Monozyten Monozyten Monozyten Monozyten Die Reinheit und Zellzahl der verschiedenen Elutriationsfraktionen wurde mit Hilfe des CASY Cell Counters ermittelt. Dafür wurden die Fraktionen 1:100 mit Casy®ton verdünnt und am CASY gemessen. Monozyten mit einer Reinheit von über 90% wurden für weitere Versuche verwendet. Ausgewählte Fraktionen der Monozyten bzw. Lymphozyten wurden gepoolt und in HBSS/BSA-Puffer aufgenommen. HBSS/BSA-Puffer 0,1% (w/v) BSA in HBSS 3.1.3 Aufreinigung von humanen B-Zellen aus isolierten Lymphozyten (FZ Borstel) Zur Aufreinigung von humanen B-Zellen aus den zuvor gewonnenen Lymphozyten (Kapitel 3.1.2) wurde das MACS B cell isolation kit II (Miltenyi Biotec) verwendet. Das Kit wurde so entwickelt, dass die „Nicht-B-Zellen“ markiert werden und die B-Zellen „unberührt“ von der Säule (LS Column) gespült werden (negative Selektion). Im Folgenden ist das Prinzip detaillierter beschrieben: Zunächst wurde die Zellzahl der Lymphozyten nach Elutriation ermittelt. Dafür wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1:10 mit Türk’scher Lösung versetzt. Die Türk’sche Lösung färbt die Zellen mit Kristallviolett an, währenddessen noch eventuell vorhandene Erythrozyten lysiert werden. Die Zellzahl wurde in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Dabei wurden die Zellen in den vier Großquadraten der Zählkammer ausgezählt und der 31 Methoden Mittelwert gebildet. Die Großquadrate der Neubauer-Zählkammer haben eine definierte Fläche von 1 mm2 und eine Kammertiefe von 0,1 mm, so dass die Konzentration der Zellsuspension pro Milliliter berechnet werden kann. Nach der Berechnung der Zellzahl konnten die B-Zellen mit dem MACS B cell isolation kit II nach Angaben des Herstellers isoliert werden. Dabei wurden die Lymphozyten im ersten Schritt mit einem Gemisch aus monoklonalen, biotinylierten Antikörpern gegen Epitope von „Nicht-B-Zellen“ versetzt und inkubiert. Der zweite Inkubationsschritt erfolgte mit monoklonalen Antikörpern, die gegen Biotin gerichtet und mit magnetischen Beads gekoppelt sind. Anschließend wurde das Zellgemisch über eine Säule mit magnetisierter Matrix gegeben. Die markierten „Nicht-B-Zellen“ wurden in dem Magnetfeld festgehalten, während die unmarkierten B-Zellen aus der Säule gespült werden konnten. Die Zellzahl und Zellviabilität der isolierten B-Zellen wurde mit einer 0,15% Trypanblau-Lösung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Trypanblau-Lösung wird genutzt, um lebende von toten Zellen zu unterschieden. Lebende Zellen nehmen den Farbstoff nicht auf, während tote Zellen den Farbstoff anreichern und blau gefärbt werden. MACS-Puffer Türk’sche Lösung 0,5% (w/v) BSA 5 mg Kristallviolett 2 mM EDTA 0,5 ml Eisessig in PBS 49,5 ml A.dest. 3.1.4 Aufreinigung von humanen B-Zellen (LUMC, Leiden) Zur Aufreinigung von humanen B-Zellen aus den zuvor gewonnenen PBMC (Kapitel 3.1.1) wurden CD19-MicroBeads (Miltenyi Biotec) verwendet. Die CD19-MicroBeads binden an die B-Zellen. „Nicht-B-Zellen“ wurden von der Säule (LS Column) gespült. Danach wurde die Säule, die noch die B-Zellen enthielt aus dem magnetischen Feld entfernt und die B-Zellen wurden aus der Säule gespült (positive Selektion). Im Folgenden ist das Prinzip detaillierter beschrieben: Zunächst wurde die Zellzahl der PBMC ermittelt. Dafür wurden die Zellen in einem Verhältnis von 1:20 mit Türk’scher Lösung versetzt. Die Zellzahl wurde in der NeubauerZählkammer bestimmt. Nach der Berechnung der Zellzahl konnten die B-Zellen mit dem CD19-MicroBeads nach Angaben des Herstellers isoliert werden. Dabei wurden die PBMC mit den CD19-MicroBeads versetzt und inkubiert. Anschließend wurde das Zellgemisch 32 Methoden über eine Säule mit magnetisierter Matrix gegeben. Die markierten B-Zellen wurden in dem Magnetfeld festgehalten, während die unmarkierten „Nicht-B-Zellen“ aus der Säule gespült werden konnten. Danach wurde die Säule aus der magnetisierten Matrix genommen und die B-Zellen mit MACS-Puffer aus der Säule gespült. Die Zellzahl und Zellviabilität der isolierten B-Zellen wurde mit einer 0,15% Trypanblau-Lösung in der NeubauerZählkammer bestimmt. 3.2 Zellkulturexperimente mit aufgereinigten, humanen Immunzellen Für alle Zellkulturexperimente wurden die humanen Immunzellen zunächst wie in Kapitel 3.1 beschrieben, isoliert. Die Kultur erfolgte grundsätzlich in RPMI-Medium. RPMI-Medium 100 U/ml Penicillin G 100 µg/ml Streptomycin-Sulfat 300 µg/ml L-Glutamin Unmittelbar vor Gebrauch wurde das RPMI-Medium abhängig vom jeweiligen Versuch zusätzlich mit 1% (v/v) bzw. 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem FCS (30 min, 56 °C) versetzt. 3.2.1 Bindung von IPSE/alpha-1 an humane mononukleäre Blutzellen Die isolierten Immunzellen wurden auf eine Endkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml mit RPMI-Medium ohne FCS eingestellt. 100 µl der Zellsuspension wurden in eine 96-Well Rundbodenplatte ausgesät und für 30 min bei 4 °C mit 100 µl PF488-gelabeltem IPSE/alpha-1 (5-160 µg/ml) inkubiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit Medium allein bzw. mit PF488-gelabelten Kontrollproteinen versetzt. Anschließend wurden die Zellen in der Platte abzentrifugiert (200 x g und 4 min). Die Überstände wurden durch schwungvolles Umdrehen der Platte abgekippt und die Restflüssigkeit (ohne die Platte noch einmal zurückzudrehen!) durch kurzes Trocknen auf Handtuchpapier entfernt. In einem zweiten Färbeschritt wurden die B-Zellen mit 30 µl PerCP-anti-human CD19 für 30 min bei 4 °C markiert, danach auf 200 µl / Well mit FACS-Puffer aufgefüllt und wie oben beschrieben 33 Methoden zentrifugiert, gewaschen und in 100 µl FACS-Puffer aufgenommen Die Zellen wurden danach durchflusszytometrisch am LSRII (BD Bioscience) analysiert. FACS-Puffer 0,5% (w/v) BSA 2 mM EDTA in PBS, pH 7,4 3.2.2 Blockierung der Bindung von IPSE/alpha-1 an humane B-Zellen Für den Blockierungs-Assay wurden die zuvor isolierten B-Zellen auf eine Endkonzentration von 2 x 106 Zellen/ml mit HBSS + 0,5% BSA gebracht. 100 µl der B-ZellSuspension wurden in einer 96-Well Rundbodenplatte ausgesät. Es erfolgte die Zugabe von 10 µl des Blockierungsreagenz (Tabelle 3-2) mit anschließender Inkubation für 45 min bei 37 °C und 6% CO2. Tabelle 3-2: Blockierungsreagenzien Blockierungsreagenz anti-IgE anti-IgG/IgM EGTA Mannan Endkonzentration 40 µg/ml 20 µg/ml 10 mM 400 µg/ml Anschließend wurden 100 µl HBSS + 0,5% BSA zu den Zellen gegeben, die Platte zentrifugiert (200 x g für 4 min) und die Überstände wie unter 3.2.1 beschrieben entfernt. Danach wurden die B-Zellen in 100 µl HBSS + 0,5% BSA aufgenommen und mit 10 µl PF488-HEK-IPSE bzw. PF488-nIPSE (Endkonzentration: 10 µg/ml) inkubiert (45 min, 37 °C, 6% CO2). Nach einem weiteren Waschschritt (siehe Kapitel 3.2.1) wurden die Zellen in 100 µl PBS + 0,5% BSA + 7-AAD (Endkonzentration: 1 µg/ml) aufgenommen. 7-AAD wird genutzt, um die lebenden von den toten Zellen zu unterscheiden. Es lagert sich in die DNA von toten Zellen ein. Der 7-AAD/DNA-Komplex kann mit dem 488 nm Laser angeregt werden und hat das Emissionsmaximum bei 647 nm. Die durchflusszytometrische Untersuchung der B-Zellen erfolgte am LSRII (BD Bioscience). 34 Methoden 3.2.3 Aufnahme von IPSE/alpha-1 in humane B-Zellen Die Untersuchungen zur Aufnahme von IPSE/alpha-1 wurden mit biotinyliertem HEK-IPSE durchgeführt. FITC-Streptavidin diente zum Nachweis von Biotin, da Biotin mit einer hohen Affinität an Streptavidin bindet. Biotinyliertes HEK-IPSE, das an die Zelle bindet und sich auf der Oberfläche befindet, kann mit Streptavidin nachgewiesen werden, während HEK-IPSE nach Aufnahme in die Zelle nicht mehr nachgewiesen werden kann. Für die Versuche wurden 100 µl der aufgereinigten B-Zellen in einer Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml zusammen mit 2,3 µl biotinyliertem HEK-IPSE (Endkonzentration: 3 µg/ml) bei 4 °C bzw. 37 °C inkubiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation erfolgte ein Waschschritt wie unter 3.2.1 beschrieben und ein zweiter Färbeschritt mit FITC-Streptavidin und PerCP-anti-human CD19 (30 min, bei 4 °C). Nach einem weiteren Waschschritt wurden die B-Zellen anschließend durchflusszytometrisch am LSR II (BD Bioscience) untersucht. 3.2.4 Stimulation der humanen B-Zellen Für die Stimulation wurden die humanen B-Zellen in einer Endkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml in RPMI-Medium + 10% (v/v) FCS verwendet. 100 µl B-Zellen und 100 µl Stimulus wurden in eine Rundbodenplatte gegeben. Nach der Zugabe der Stimulanzien (Tabelle 3-3), oder Kombinationen aus diesen, wurde der Ansatz für 48 h bei 37 °C und 6% CO2 inkubiert. Tabelle 3-3: Stimulanzien für B-Zellen Stimulus Endkonzentration LPS 100 ng/ml CpG 1 µg/ml anti-CD40 10 µg/ml anti-IgG/IgM 20 µg/ml HEK-IPSE 10 µg/ml SEA 20 µg/ml Nach Inkubation wurde die Zytokinproduktion im Zellkulturüberstand mittels SandwichELISA bestimmt (Kapitel 3.4). 35 Methoden 3.2.5 Sortierung der SEA- bzw. HEK-IPSE-bindenden B-Zellen mit anschließender Stimulation (LUMC, Leiden) Für die Sortierung der SEA- bzw. HEK-IPSE-bindenden B-Zellen wurden die B-Zellen zunächst wie in Kapitel 3.1.4 beschrieben isoliert. Anschließend wurden die B-Zellen für 10 min bei 500 x g und 4 °C abzentrifugiert und das Zellpellet entsprechend der Zellzahl in RPMI-Medium ohne FCS aufgenommen. Die B-Zellen wurden auf eine Konzentration von 3 x 106 Zellen/ml eingestellt. Danach wurden die B-Zellen mit dem gleichen Volumen PF488-gelabeltem HEK-IPSE (Endkonzentration: 10 µg/ml) versetzt und 30 min bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen wie oben beschrieben erneut abzentrifugiert und in MACS-Puffer aufgenommen. Die Konzentration der B-Zellen sollte maximal 15 x 106 Zellen/ml betragen. Die B-Zellen wurden in ein steriles FACS-Röhrchen überführt. Für die Sortierung am Aria III wurden auch ungefärbte B-Zellen und PF488-gefärbte B-Zellen als Kontrollen und zum Setzen der Gates mitgeführt. Um die B-Zellen nach der Sortierung zu sammeln wurden zwei 15 ml Röhrchen mit 500 µl RPMI-Medium und 500 µl FCS vorbreitet. In diesen Röhrchen wurden jeweils die „IPSE-Binders“ und „IPSE-Nonbinders“ sortiert. Die Sortierung wurde von einem Mitarbeiter der Fluoreszenz-ZytometrieEinheit am LUMC durchgeführt. Anschließend wurden die Zellzahlen der „IPSE-Binders“ und „IPSE-Non-binders“ bestimmt und wie in Kapitel 3.2.4 beschrieben stimuliert. Die unsortierten B-Zellen, die „IPSEBinders“, bzw. die „IPSE-Non-binders“ wurden mit SEA (20 µg/ml) bzw. HEK-IPSE (10 µg/ml) oder LPS (100 ng/ml) + CpG (1 µg/ml) + SEA (20 µg/ml) bzw. HEK-IPSE (10 µg/ml) stimuliert. SEA bzw. HEK-IPSE wurden zu jedem Stimulationsansatz hinzugegeben. Da die B-Zellen schon bei der Sortierung mit SEA bzw. HEK-IPSE in Kontakt gekommen waren, waren diese schon mit SEA bzw. HEK-IPSE beladen. Nach Inkubation wurde die Zytokinproduktion im Zellkulturüberstand mittels SandwichELISA bestimmt (Kapitel 3.4). Die Zellen wurden intrazellulär für IL-10 und TNF-α, sowie Oberflächenmarker gefärbt (Kapitel 3.3.4). 36 Methoden 3.2.6 Monozytenkultur Für die Experimente mit humanen Monozyten wurden diese zunächst, wie in Kapitel 3.1.2 beschrieben, unter Zuhilfenahme der Gegenstrom-Elutriation isoliert. Es wurde eine Reinheit von über 90% erreicht. Bei der Monozytenkultur wurden die frisch-isolierten Zellen für 24 h stimuliert. Bevor jedoch die Stimulanzien (Tabelle 3-4) zu den Zellen gegeben wurden, wurde die Reinheit der Monozyten erhöht. Dazu wurde die Fähigkeit der Monozyten, an Plastik zu adhärieren, ausgenutzt. 250,000 Monozyten wurden mit einer Konzentration von 0,25 x 106 Zellen/ml in RPMI + 1% FCS (v/v) in eine 24-Well-Platte ausgesät und für 1 h bei 37 °C und 6% CO2 inkubiert. In dieser Zeit adhärieren die Monozyten. Nicht-adhärente Zellen wurden anschließend durch Absaugen des Mediums und Zugabe von 1 ml RPMI + 1% FCS (v/v) aus der Platte gewaschen. Dieser Waschschritt wurde 3 x wiederholt. Anschließend wurden die Stimuli in 1 ml RPMI + 10% FCS (v/v) einzeln oder in Kombinationen hinzugegeben. Die Monozyten wurden zusammen mit den Stimulanzien für 24 h bei 37 °C und 6% CO2 inkubiert. Tabelle 3-4: Stimulanzien für Monozyten Stimulus Endkonzentration GM-CSF 900 U/ml IgE 1 µg/ml IL-4 250 U/ml Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und durchflusszytometrisch untersucht (Kapitel 3.3.3). 3.2.7 Generierung von dendritischen Zellen aus Monozyten (moDCs) Aus humanen Monozyten lassen sich in vitro in Anwesenheit von GM-CSF und IL-4 immature dendritische Zellen generieren (so genannte monocyte-derived DC (moDC)) (Sallusto und Lanzaveccia, 1994; Romani et al., 1994). In der vorliegenden Arbeit wurden die Protokolle von Sallusto und Romani leicht modifiziert eingesetzt. Dafür wurde zunächst, wie schon in Kapitel 3.2.6 erwähnt, die Plastikadhärenz der Monozyten genutzt, um die Reinheit zu erhöhen. 2 ml der Monozyten-Suspension 37 Methoden wurden mit einer Konzentration von 0,8 x 106 Zellen/ml in RPMI-Medium + 1% (v/v) FCS in eine 6-Well-Flachbodenplatte ausgesät und für 1 h bei 37 °C und 6% CO2 inkubiert. Nicht-adhärente Zellen wurden anschließend durch Absaugen des Zellkulturmediums und Zugabe von 2 ml RPMI-Medium + 1% FCS (v/v) aus der Platte gewaschen. Dieser Waschschritt wurde 3 x wiederholt. Die adhärenten Monozyten wurden mit 3 ml RPMI-Medium + 10% (v/v) FCS + 900 U/ml GM-CSF + 250 U/ml IL-4 versetzt, um moDCs zu generieren. Die Kultivierung erfolgte für 6 Tage bei 37 °C und 6% CO2. An Tag 4 wurde das halbe Medium gewechselt und frisches RPMI-Medium mit 10% (v/v) FCS + 1800 U/ml GM-CSF + 500 U/ml IL-4 zu den Zellen gegeben. Humanes IgE (1 µg/ml bzw. 2 µg/ml) wurde zu einem Teil der Zellen gegeben, damit diese während der Generierung gleichzeitig mit IgE beladen wurden. 3.3 Fluoreszenzzytometrische und –mikroskopische Arbeiten 3.3.1 Markierung von IPSE/alpha-1, Omega-1 und anti-IgG/IgM Zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen wurden zwei verschiedene Methoden eingesetzt: über Amidbindung direkt an das Protein oder über Hydrazidbindung an die Kohlenhydratketten. Die Markierung der Proteinkette wurde mit PF488 mit Hilfe des PromoFluor488 Premium Labeling Kit von PromoKine nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Der Farbstoff liegt als reaktiver N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) vor. Dieser kann unter milden, alkalischen Bedingungen eine stabile, kovalente Amidbindung mit dem Protein bilden. Mit dieser Art der Markierung können primäre Amine (R-NH2) von Proteinen oder andere Amin-tragende Moleküle gelabelt werden. Zunächst wurde Natriumcarbonat-Puffer im Verhältnis 1:5 zu der Proteinlösung gegeben, um den pH-Wert der Lösung auf pH 8,5 zu bringen. Kurz vor der Reaktion wurde der reaktive Farbstoff in DMSO gelöst, da der gelöste Farbstoff nur für eine Stunde stabil bleibt. Ein nach der Formel 3.1 berechnetes Volumen an Farbstoff wurde zu der Proteinlösung gegeben und für 5 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Danach wurde die Proteinlösung mit einer ZebaSpin-Säule (ThermoScientific) umgepuffert und nicht gebundener Farbstoff entfernt. 38 Methoden 𝑉 [µ𝑙]𝑜𝑓 𝑑𝑦𝑒 𝑠𝑡𝑜𝑐𝑘 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 = 𝑐𝑚,𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 ∙𝑉𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 ∙1000 𝑐𝑎𝑐𝑡.𝑑𝑦𝑒 ∙𝑀𝑊𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 ∙ 𝑀𝑅 (3.1) cm, Protein = Konzentration der Proteinlösung in mg/ml cact. dye = 2 µMol/ml (Konzentration des Farbstoffs) VProtein = das Volumen der Proteinlösung 1000 = Korrekturfaktor für die Einheit MWProtein = Molekulargewicht des Proteins MR = Molares Verhältnis (empholen MR = 5) Die Proteinkonzentration wurde anschließend mit der Formel 3.2 berechnet. Dafür wurden die optischen Dichten bei 280 nm und 488 nm gemessen. cm, Protein [mg⁄ml] = [OD280 −(OD488 ∙K)] ε ∙ MWProtein (3.2) K = Korrekturfaktor (K = 0,09) ε = Molarer Extinktionskoeffizient bei 280 nm Die Markierung über die Kohlenhydrate erfolgte mit AF488-Hydrazid. Der reaktive Farbstoff reagiert mit Aldehyden oder Ketonen in Polysacchariden und Glykoproteinen. Zunächst wurden die potentiellen Bindungsstellen mit Hilfe einer Na-Perjodat-Lösung (20 mM Na-Perjodat in 0,1 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5) zu Aldehyden oder Ketonen oxidiert. An diese Aldehyde oder Ketone konnte dann das AF488-Hydrazid gebunden werden. Im Detail wurde die Markierung nach folgendem Protokoll durchgeführt: Zunächst wurden gleiche Volumina an Probe und Oxidationspuffer (0,1 M NatriumacetatLösung, pH 5,5) zusammengegeben und kurz auf Eis gestellt. Danach wurde die gleiche Menge einer Na-Perjodat-Lösung hinzugegeben und alles 30 min auf Eis gestellt. Nach dem Umpuffern der Probe mit einer ZebaSpin-Säule gegen PBS wurde AF488-Hydrazid in einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml dazugegeben und die Probe für 2 h bei RT unter Schütteln im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde die nun gelabelte Probe erneut mit einer ZebaSpin-Säule umgepuffert, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen. 39 Methoden 3.3.2 Mikroskopischer Nachweis von IPSE/alpha-1 in humanen B-Zellen Zum Nachweis von HEK-IPSE in den B-Zellen wurde eine Lebendzell-Mikroskopie am Konfokalmikroskop (Leica TCS SP5) durchgeführt. Dafür wurden die Zellen mit RPMIMedium ohne FCS auf eine Endkonzentration von 5 x 105 Zellen/ml gebracht, und 100 µl dieser Zellsuspension wurden in µ-slides VI0.4 (Ibidi) ausgesät. Zunächst wurden die B-Zellen teilweise mit Hoechst 33342 (Sigma; Endkonzentration: 1 µM) und in einigen Versuchen auch mit LysoTracker Red (Molecular Probes; 1: 10000) für 30 min bei 37 °C und 6% CO2 inkubiert. Direkt vor der Mikroskopie wurden 10 µl PF488-markiertes bzw. AF488-markiertes HEK-IPSE im Überschuss zu den Zellen gegeben. Die Aufnahmen wurden mit der Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF)-Software von Leica Microsystems erstellt, ausgewertet und bearbeitet. 3.3.3 Durchflusszytometrische Untersuchung von Immunzellen (FZ Borstel) Die Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) wurde verwendet, um die Expression der Oberflächenmoleküle quantitativ zu bestimmen. Dafür wurden die Zellen mit Fluoreszenz-gekoppelten Antikörpern, die gegen bestimmte Oberflächenmoleküle gerichtet sind, inkubiert. Bei der Messung werden die Zellen in einer Einzelzellsuspension, wie an einer Perlenkette aufgereiht, an einem Laser geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet. Der Fluoreszenzfarbstoff wird durch diesen Laser angeregt und emittiert Fluoreszenz einer höheren Wellenlänge (Stokes Shift). Die emittierte Fluoreszenz wird anschließend detektiert. Die Messung erfolgte am LSRII von BD Bioscience. Die Bedienung des LSRII und Analyse erfolgte mit der BD Diva-Software, während die Auswertung mit FlowJo durchgeführt wurde. Die FACS-Analyse wurde für Monozyten und moDCs verwendet. Die Zellen wurden extrazellulär gefärbt, was im Folgenden beschrieben ist: Nach der Ernte der Zellen wurden diese in eine 96-Well-V-Boden Platte überführt. Die Zellsuspensionen in den einzelnen Vertiefungen wurden auf 200 µl mit FACS-Puffer aufgefüllt. Nach einem Waschschritt, wie unter 3.2.1 beschrieben, wurde das restliche Medium entfernt. Die Färbung erfolgte in einem Volumen von 30 µl für 30 min bei 4 °C und im Dunkeln. Die Kombination der markierten Nachweisantikörper ist in Tabelle 3-5 gelistet. 40 Methoden Tabelle 3-5: verwendete Antikörper-Kombinationen Zellen Spezifität Fluoreszenz Monozyten/moDCs anti-human FcεRIα PE-Cy7 anti-human CD23 PerCP-Cy5.5 anti-human IgE APC Verdünnung 1:20 1:20 1:20 Als Kontrollen wurden ungefärbte Zellen und FMO (fluorescence minus one)-Kontrollen verwendet. Bei den FMO-Kontrollen wurde jeweils ein Fluoreszenz-markierter Antikörper bei der Färbung weggelassen. Kompensiert wurde mittels CompBeads (BD Bioscience), sofern es möglich und notwendig war. Die Beads wurden genauso wie die Zellen behandelt. 3.3.4 Intrazelluläre Färbung der B-Zellen (LUMC, Leiden) Nach der Stimulation der B-Zellen (Kapitel 3.2.5) wurde der Zellkulturüberstand für die Bestimmung von IL-10 mittels ELISA abgenommen. Die B-Zellen wurden in 150 µl RPMIMedium + 10% FCS (hi) resuspendiert und für 3 min bei 200 x g bei RT abzentrifugiert. Das Medium wurde mit einer Mehrkanal-Pipette entfernt und die B-Zellen wurden in 100 µl RPMI + 10% FCS (hi) + PMA (100 ng/ml) + Ionomycin (1 µg/ml) resuspendiert. PMA steht für Phorbol-12-myristate-13-acetat und ist ein kleines Molekül, das im Zytoplasma der Zelle direkt die Proteinkinase C aktiviert. Die Proteinkinase C hat eine zentrale Bedeutung bei der Signaltransduktion inne. Ionomycin ist ein Calcium-Ionophor und führt zur Freisetzung von Calcium, was auch für die Signaltransduktion von Bedeutung ist. Zusammenfassend führt die Inkubation mit PMA und Ionomycin dazu, dass Proteine im hohen Maße produziert werden. Anschließend wurden die B-Zellen für 2 h bei 37°C und 6% CO2 inkubiert. Nach der Inkubation wurde 4 µl Brefeldin A (Endkonzentration: 10 µg/ml) zu den B-Zellen gegeben und weitere 4 h bei 37°C und 6% CO2 inkubiert. Brefeldin A ist ein Antibiotikum und induziert den retrograden Transport vom Golgi-Apparat zum endoplasmatischen Retikulum. Die Proteine akkumulieren dort und können später in der Färbung nachgewiesen werden. Nach den 4 h wurde 100 µl PBS zu den B-Zellen gegeben und die B-Zellen wurden für 3 min bei 200 x g bei RT abzentrifugiert. Der Überstand wurde wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben aus der Platte entfernt. 41 Methoden Im Anschluss wurden die B-Zellen mit Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Dafür wurden 200 µl kaltes 1,9% PFA in PBS zu den B-Zellen gegeben und vorsichtig mit der Mehrkanal-Pipette resuspendiert. Nach einer Inkubation für 15 min bei RT wurden die B-Zellen für 3 min bei 200 x g und RT abzentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Nach zwei Waschschritten mit 200 µl PBS, die wie zuvor durch Zentrifugation und Entfernen des Überstandes durchgeführt wurden, wurden die B-Zellen in FACS-Puffer aufgenommen. Die anschließende intrazelluläre Färbung erfolgte in einem Volumen von 30 µl für 30 min bei 4 °C und im Dunkeln. Die Kombination der markierten Nachweisantikörper ist in Tabelle 3-6 gelistet. Die Färbung erfolgte in 0,5% Saponin in FACS-Puffer. Saponin interagiert mit der Plasmamembran so, dass Löcher in der Membran entstehen. So können die Antikörper auch in die B-Zellen gelangen und dort z.B. an IL-10 binden. Für den Nachweis von TNF-α waren zwei Färbeschritte notwendig. Die Messung erfolgte in FACSPuffer am BD FACSCanto II. Tabelle 3-6: verwendete Antikörper-Kombinationen Zellen Spezifität Fluoreszenz B-Zellen anti-human CD38 Horizon V450 anti-human CD1d PE anti-human CD24 PECy7 anti-human IL-10 APC anti-human CD27 eF780 anti-human TNF-α Biotin Streptavidin Qdot525 Verdünnung 1:200 1:40 1:50 1:250 1:300 1:200 1:150 3.4 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Sandwich-ELISA) Die Konzentrationen humaner Zytokine im Zellkulturüberstand wurden mit Hilfe der BD OptEIA™ Human ELISA Sets für IL-6 und IL-10 ermittelt. Der Sandwich-ELISA funktioniert mit zwei Antigen-spezifischen Antikörpern, die an unterschiedliche Epitope binden. Der ELISA wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die Antikörper und das Enzym wurden zusätzlichen 1:2 verdünnt, was zuvor im Labor etabliert wurde. 42 Methoden Im ersten Schritt wurde der „Coating Antibody“ an eine 96-Well-Patte (Maxisorp; Nunc) gebunden. Dafür wurden 100 µl „Coating Antibody“ in Kopplungspuffer in die Platte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde der nicht-gebundene „Coating Antibody“ mit dem ELISA-Washer durch dreimaliges Waschen mit 300 µl Waschpuffer aus der Platte entfernt. Restflüssigkeit wurde durch Umdrehen der Platte und Ausklopfen auf Handtuchpapier aus den Vertiefungen entfernt. Nachdem unspezifische Bindungsstellen durch die Inkubation mit 200 µl Blockierungspuffer für 1 Stunde blockiert wurden und dieser, wie zuvor beschrieben, aus der Platte gewaschen wurde, wurden die Proben (100 µl) in die Platte gegeben und das nachzuweisende Zytokin konnte während der 2-stündigen Inkubation an den spezifischen Antikörper binden. Die überschüssige Probe wurde anschließend mit Hilfe eines ELISA-Washers mit Waschpuffer entfernt (siehe oben) und eine Mischung aus Streptavidin-HRP (horseradish peroxidase) und dem zweiten spezifischen, biotinylierten Antikörper in die Platte gegeben. Am Ende des Nachweises setzt das Enzym HRP das Substrat TMB (Tetramethylbenzidin) direkt proportional zum Gehalt an Zytokin um. Es entsteht eine blaue Farbereaktion. Mit der Stopp-Lösung (1 M H2SO4) wird der pH-Wert gesenkt und somit die Reaktion gestoppt. Die Farbe wechselt von blau zu gelb. Die Absorption wurde bei 450 nm am ELISA-Reader (Sunrise, Tecan) gemessen und mit der Software Magellan ausgewertet. Alle Waschschritte wurden mit Hilfe des ELISAWashers von Tecan durchgeführt. Waschpuffer Blockierungspuffer Kopplungspuffer, pH 9,5 147 mM NaCl 10% (v/v) FCS (hi) 85 mM NaHCO3 2,7 mM KCl in PBS, pH 7,4 15 mM Na2CO3 10 mM Na₂HPO₄ 2 mM KH₂PO₄ 0,05% Tween®20 43 Methoden 3.5 Statistik Für die statistische und grafische Auswertung wurde GraphPad Prism verwendet. Sämtliche Werte wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) angegeben. Wurden mehr als zwei Versuche durchgeführt, so konnten die gefundenen Unterschiede auf Signifikanz untersucht werden. Da für eine Überprüfung, ob eine Normalverteilung vorliegt, mindestens 6 Replikate notwendig waren, wurde die Normalverteilung angenommen, da auch nichts dagegen sprach. Die Datensätze der B-Zellen wurden mit dem gepaarten t-Test bzw. 2-Wege ANOVA-Test mit dem Mehrfach-Vergleichstest nach Tukey auf statistische Signifikanz untersucht. Die Daten der Monozyten wurden mit dem gepaarten t-Test auf statistische Signifikanz untersucht, da nur die Werte einer Gruppe miteinander verglichen wurden. Signifikante Unterschiede wurden mit Sternen gekennzeichnet und wie folgt definiert, * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001. 44 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 IPSE/alpha-1 bindet an B-Zellen und Monozyten Aus vorhergehenden Untersuchungen ist bekannt, dass IPSE/alpha-1 ein Immunglobulinbindender Faktor ist, der basophile Granulozyten über die Bindung an IgE auf der Oberfläche der Basophilen aktiviert (Schramm et al., 2003). Da auch andere Immunzellen Immunglobuline auf der Oberfläche tragen, stellen diese ein potentielles Ziel für IPSE/alpha-1 dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine mögliche Interaktion von IPSE/alpha-1 mit den mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMC) zu analysieren. Zunächst wurde untersucht, ob und an welche PBMC IPSE/alpha-1 bindet. Alle Versuche wurden mit rekombinant in HEK-Zellen hergestelltem IPSE/alpha-1 (HEK-IPSE) durchgeführt, da das natürlich vorkommende aus S. mansoni-Eiern aufgereinigte IPSE/alpha-1 (nIPSE) nur in sehr limitierten Mengen verfügbar ist. HEK-IPSE und nIPSE unterscheiden sich zwar in der Glykosylierung, jedoch konnte in früheren Untersuchungen gezeigt werden, dass die Glykosylierung für die Immunglobulin-bindende Aktivität von IPSE/alpha-1 keine Rolle spielt (Schramm et al., 2003). Daher wurde nIPSE nur in einigen Versuchen gezielt zum Vergleich eingesetzt. Zum durchflusszytometrischen Nachweis der Bindung von IPSE/alpha-1 an die Zellen wurde zunächst HEK-IPSE mit PF488 über Amidbindung markiert (Kapitel 3.3.1). Im nächsten Schritt wurden PBMC, bestehend aus Lymphozyten und Monozyten, aus dem peripheren Blut gesunder Spender isoliert (Kapitel 3.1.1) und, wie in Kapitel 3.2.1 beschrieben, behandelt. Die isolierten PBMC (Endkonzentration: 1,5 x 106 Zellen/ml RPMIMedium ohne FCS) wurden 30 min bei 4 °C ohne bzw. mit 10 µg/ml PF488-HEK-IPSE inkubiert. Der Nachweis der B-Zellen erfolgte über die Markierung mit PerCP-anti-human CD19. Abbildung 4-1 zeigt die Gating-Strategie und exemplarisch das Ergebnis der FACSAnalyse für einen Spender. Die Lymphozyten (FSClow, SSClow) konnten mittels FSC/SSC Dotplot von den Monozyten (FSChigh, SSChigh) unterschieden werden. Innerhalb der Lymphozyten-Population wurden die CD19-positiven B-Zellen (8%) von den CD19negativen „Nicht-B-Zellen“ (92%) unterschieden. In dem hier gezeigten Versuch hatte 45 Ergebnisse PF488-HEK-IPSE sowohl an 5% der Monozyten als auch an 7% der B-Zellen gebunden. „Nicht-B-Zellen“ im Lymphozyten-Gate zeigten nur eine minimale Bindung von 0,3%. Abbildung 4-1: PF488-HEK-IPSE bindet an 5% der Monozyten und 7% der B-Zellen. Im FSC/SSC Dotplot (links) ließen sich die Monozyten (FSChigh, SSChigh) von den Lymphozyten (FSClow, SSClow) unterscheiden. Die Monozyten repräsentierten 18% und die Lymphozyten 77% der PBMC. Anschließend konnten innerhalb der Lymphozyten-Population die CD19-positiven B-Zellen (8%) von den CD19-negativen „Nicht-B-Zellen“ (92%) unterschieden werden (Mitte). Die Dotplots rechts zeigten die Bindung von PF488HEK-IPSE an 5% der Monozyten, 7% der B-Zellen und 0.3% der “Nicht-B-Zellen“. Dargestellt ist exemplarisch eines von drei durchgeführten Experimenten. Der Mittelwert aus drei durchgeführten Experimenten ergab, dass HEK-IPSE in der hier eingesetzten Konzentration von 10 µg/ml, die aus früheren Versuchen zur Stimulation von dendritischen Zellen als physiologisch erachtet wurden, an 3,4% ± 2,2% der Monozyten, 7,7% ± 0,9% der B-Zellen und 0,2% ± 0,1% der „Nicht-B-Zellen“ gebunden hat. 4.2 Interaktion von IPSE/alpha-1 mit humanen B-Zellen Im folgenden Kapitel wurde die Interaktion von IPSE/alpha-1 mit humanen B-Zellen detaillierter bezüglich Bindung, Aufnahme und Funktion untersucht. 46 Ergebnisse 4.2.1 IPSE/alpha-1 bindet an bis zu 80% der humanen B-Zellen In FACS-Analysen wurde zunächst die Bindung von IPSE/alpha-1 an isolierten B-Zellen genauer untersucht. Als Positivkontrolle wurde anti-IgG/IgM verwendet. Diese Antikörper detektieren membranständiges IgG und IgM auf der Oberfläche der B-Zellen. Als Negativkontrolle diente HEK-Omega-1. Hierbei handelt es sich um ein weiteres Glykoprotein aus dem Schistosomen-Ei, das rekombinant in HEK-Zellen exprimiert wurde, aber nicht an Immunglobuline bindet. IPSE/alpha-1 sowie die beiden Kontrollproteine wurden zunächst mit PF488 gelabelt (Kapitel 3.3.1). Anschließend wurden die isolierten B-Zellen (Endkonzentration: 1,5 x 106 Zellen/ml RPMI-Medium ohne FCS) für 30 min bei 4 °C ohne bzw. mit einer steigenden Konzentration von 5 - 160 µg/ml PF488-markiertem Protein inkubiert. Der Nachweis der B-Zellen erfolgte über die Markierung mit PerCP-antihuman CD19. Innerhalb der Lymphozyten-Population wurden die B-Zellen anhand der Expression von CD19 identifiziert (Abbildung 4-2). Im Weiteren wurden die CD19-positiven B-Zellen auf die Bindung von PF488-IPSE untersucht. Abbildung 4-2: Gating-Strategie zur Untersuchung der Bindung von PF488-markiertem IPSE/alpha-1 an humane B-Zellen. Die Lymphozyten wurden im FSC/SSC Dotplot als FCSlow, SSClow identifiziert (links). Anschließend wurden die B-Zellen anhand der Expression von CD19 erfasst (rechts). 81% der Lymphozyten waren CD19-positiv. Dargestellt ist exemplarisch eines von drei durchgeführten Experimenten. Abbildung 4-3 stellt ein exemplarisches Ergebnis der FACS-Analyse dar. Das Gate für die IPSE-bindenden Zellen wurde anhand der Zellen, die ohne gelabeltes HEK-IPSE (0 µg/ml) inkubiert wurden, gesetzt. In den Dotplots ist zu erkennen, das HEK-IPSE bei steigender Konzentration an immer mehr B-Zellen bindet, bis eine Sättigung bei 80% ± 13% der B-Zellen eintritt. 47 Ergebnisse Die Positivkontrolle anti-IgG/IgM bindet schon bei niedrigen Konzentrationen (≤ 2,5 µg/ml) an alle B-Zellen (Abbildung 4-3). HEK-Omega-1 hingegen bindet kaum an B-Zellen. Sowohl natürliches (nIPSE; orange) als auch rekombinantes (HEK-IPSE; hellgrün) IPSE/alpha-1 binden mit steigender Konzentration an 80% ± 13% (HEK-IPSE) bzw. 59% ± 9% (nIPSE) der B-Zellen. Abbildung 4-3: PF488-HEK-IPSE bindet an bis zu 80% der humanen B-Zellen. (A) FACS-Analyse der Bindung von PF488-HEK-IPSE in einer Konzentrationsreihe von 0 µg/ml bis 160 µg/ml. Das Gate für positive Events wurde in dem Ansatz ohne HEK-IPSE (0 µg/ml) gesetzt. Je mehr PF488-HEK-IPSE zu den Zellen gegeben wurde, desto mehr Zellen wurden positiv für die Bindung von HEK-IPSE an B-Zellen. Dargestellt ist exemplarisch eines von drei durchgeführten Experimenten. (B) HEK-IPSE (hellgrün) konnte an 80% ± 13% der B-Zellen und nIPSE (orange) konnte an 59% ± 9% der B-Zellen binden. Die Positivkontrolle anti-IgG/IgM (rot) konnte schon bei niedriger Konzentration an 100% der B-Zellen binden, während die Negativkontrolle HEK-omega-1 (violett) an 9,2% ± 1,6% der B-Zellen gebunden hat. Dargestellt sind die Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) (n = 3). 48 Ergebnisse 4.2.2 Die Bindung von IPSE/alpha-1 lässt sich mit anti-IgG/IgM blockieren Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob IPSE/alpha-1 über den B-Zell-Rezeptor, und/oder andere Rezeptoren an die B-Zellen bindet. Sowohl natürliches als auch rekombinant in HEK-Zellen exprimiertes IPSE (HEK-IPSE) sind glykosyliert und können daher theoretisch auch an andere Rezeptoren, wie z. B „C-type-lectin“-Rezeptoren binden. In einem Blockierungsassay wurden daher die B-Zellen mit anti-IgG/IgM (Blockierung des BZR), mit Mannan (Blockierung der Mannose-bindenden „C-type-lectin“-Rezeptoren, z.B. CD206) oder EGTA (Blockierung aller Ca2+-abhängigen Rezeptoren) vorinkubiert. Für den Versuch wurden die isolierten B-Zellen zunächst ohne bzw. mit 20 µg/ml antiIgG/IgM, 400 µg/ml Mannan, 10 mM EGTA oder 40 µg/ml anti-IgE für 45 min bei 37 °C inkubiert (Kapitel 3.2.2). Die Bindung wurde anschließend mit 10 µg/ml PF488-HEK-IPSE und PF488-nIPSE untersucht (45 min bei 37°C). Da der Einfluss der Blockierung auf die Zellen nicht bekannt war, wurde vor der Messung 7-AAD zu den Zellen gegeben, um nur die lebenden Zellen auf die Bindung von IPSE/alpha-1 zu untersuchen. In Abbildung 4-4 ist die Gating-Strategie für diesen Versuch gezeigt. Zunächst wurden die B-Zellen im FSC/SSC Dotplot identifiziert. Anschließend wurden unter Zuhilfenahme von 7-AAD die toten Zellen ausgeschlossen. Nachdem so die lebenden B-Zellen gegatet worden waren, konnten die PF488-positiven Zellen untersucht werden. Abbildung 4-4: Gating-Strategie für die FACS-Analyse zur Untersuchung der Blockierung der Bindung von IPSE/alpha-1 an B-Zellen. Im FSC/SSC Dotplot wurden zunächst die B-Zellen gegatet und die lebenden (7-AAD-negativen) B-Zellen ausgewählt. Anschließend wurde die Anzahl der PF488-positiven B-Zellen nachgewiesen und ausgewertet. Dargestellt ist exemplarisch eines von drei durchgeführten Experimenten. 49 Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass die Inkubation mit Mannan und EGTA die Bindung nicht beeinflusste (Abbildung 4-5). IPSE/alpha-1 hat auch nicht über IgE an die B-Zellen gebunden, da keine Beeinflussung seiner Bindung durch Inkubation mit anti-IgE nachweisbar war. Anders stellte es sich bei anti-IgG/IgM dar. Die Bindung von HEK-IPSE konnte durch anti-IgG/IgM signifikant gehemmt werden (p = 0,012). Auch die Bindung von nIPSE wurde gehemmt. Da der Versuch mit nIPSE nur zweimal durchgeführt wurde, konnte keine Statistik zur Berechnung der Signifikanz angewendet werden. % P F 4 8 8 -p o s itiv e Z e lle n 20 * M annan 15 EGTA a n ti-Ig G /Ig M 10 a n ti-Ig E 5 0 H EK -IP S E n IP S E Abbildung 4-5: Die Bindung von IPSE/alpha-1 an B-Zellen kann mit anti-IgG/IgM gehemmt werden. Die drei bzw. zwei durchgeführten Experimente wurden zusammenfassend als Balkendiagramm dargestellt. Im Diagramm wurden die Prozentzahlen der PF488-positiven B-Zellen abgebildet. Die Bindung von HEKIPSE (n = 3) und nIPSE (n = 2) ließ sich durch anti-IgG/IgM, nicht aber durch Mannan, EGTA oder anti-IgE hemmen. Die Blockierung der Bindung von HEK-IPSE durch anti-IgG/IgM war mit p = 0,012 signifikant. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD. Für die Statistik wurde der gepaarte t-Test verwendet (*, p < 0,05). IPSE/alpha-1 bindet also an den BZR (membranständiges IgG / IgM, nicht IgE), jedoch nicht an Mannose-bindende oder Ca2+-abhängige Rezeptoren an B-Zellen. 4.2.3 IPSE/alpha-1 wird in die B-Zellen aufgenommen – FACS Analyse Im nächsten Schritt wurde die Aufnahme von IPSE/alpha-1 in die B-Zellen untersucht. Wie in Kapitel 3.2.3 beschrieben, wurden die B-Zellen mit biotinyliertem HEK-IPSE bei 4 °C und 37 °C inkubiert. Sofern das biotinylierte HEK-IPSE auf der Oberfläche zu finden ist, kann es mit FITC-Streptavidin markiert und somit nachgewiesen werden. Biotinyliertes HEK-IPSE, welches aufgenommen wurde, kann hingegen nicht mehr nachgewiesen werden, da FITC-Streptavidin bei 4 °C nicht durch die Plasmamembran in die Zelle gelangen kann. 50 Ergebnisse Abbildung 4-6 zeigt ein exemplarisches Ergebnis der FACS-Analyse. Bei 4 °C werden mehr FITC-positive B-Zellen gefunden als bei 37 °C. Um auszuschließen, dass FITC-Streptavidin unspezifisch an die B-Zellen gebunden hat, wurden diese als Kontrolle mit FITC-Streptavidin, aber ohne biotinyliertes HEK-IPSE inkubiert. Abbildung 4-6: Biotinyliertes HEK-IPSE wird bei 37 °C kaum auf der Oberfläche nachgewiesen. Bei 4 °C konnten mehr FITC-positive B-Zellen gefunden werden als bei 37 °C (rechte Spalte). Eine Inkubation mit FITC-Streptavidin, aber ohne biotinyliertes HEK-IPSE diente als Kontrolle (linke Spalte). Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von drei durchgeführten. Wie in Abbildung 4-7 für drei Versuche zusammenfassend dargestellt ist, wurde bei 4 °C mit 12,5% ± 4,4% mehr HEK-IPSE auf der Zelloberfläche der B-Zellen gefunden, als bei 37 °C (4,4% ± 1,5%). Dies ist ein Hinweis darauf, dass IPSE/alpha-1 von den B-Zellen aufgenommen wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden nachfolgend Experimente mit Lebendzell-Mikroskopie durchgeführt (Kapitel 4.2.4). 51 % S t r e p t a v id i n - p o s i t iv e Z e l l e n Ergebnisse 0 ,0 8 5 20 15 10 5 0 4 °C 3 7 °C T em p era tu r Abbildung 4-7: IPSE/alpha-1 wird bei 37°C weniger auf der Oberfläche von humanen B-Zellen gefunden. Nach der Inkubation von B-Zellen mit biotinyliertem HEK-IPSE bei 4 °C (schwarzer Balken) konnten 12,5% ± 4,4% der B-Zellen mit Streptavidin nachgewiesen werden. Bei 37 °C (graue Balken) wurden 4,4% ± 1,5% der Zellen mit Streptavidin gefärbt. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD. Für die Statistik wurde der gepaarte t-Test verwendet (n = 3). 4.2.4 IPSE/alpha-1 wird in die B-Zellen aufgenommen – Lebendzell-Mikroskopie Für alle bisher durchgeführten Versuche zur Bindung von IPSE/alpha-1 an die B-Zellen und für alle im Anschluss ab Kapitel 4.2.5 dargestellten Zellkulturversuche wurde PF488- oder Biotin-gelabeltes HEK-IPSE verwendet. Die PF488-Moleküle wurden dafür, wie in Kapitel 3.3.1 beschrieben, über primäre Amine an HEK-IPSE gekoppelt. In den FACSAnalysen konnte gezeigt werden, dass HEK-IPSE an 80% ± 13% der B-Zellen bindet. Versuche mit biotinyliertem HEK-IPSE, bei dem das Biotin auch über die primären Amine an HEK-IPSE gebunden waren, legten die Vermutung nahe, dass HEK-IPSE nicht nur an B-Zellen bindet, sondern auch von diesen aufgenommen wird. Die Aufnahme von IPSE/alpha-1 sollte nun mit Hilfe der Lebendzell-Mikroskopie genauer untersucht werden. Allerdings konnte hier PF488-markiertes HEK-IPSE weder an der Oberfläche noch in den Zellen nachgewiesen werden. Das wurde erst möglich, nachdem der Farbstoff über Hydrazidbindung an die Zuckerstrukturen auf dem IPSE-Molekül gebunden wurde (AF488HEK-IPSE) (Abbildung 4-8). Bisher haben wir keine Erklärung für das unterschiedliche Bindungsverhalten unter den Bedingungen der FACS- bzw. Lebendzell-MikroskopieAnalyse. 52 Ergebnisse Abbildung 4-8: Konfokalmikroskopie-Bilder zur Untersuchung der Aufnahme von Fluoreszenzmarkiertem HEK-IPSE. (A) PF488-HEK-IPSE bindet nicht an B-Zellen, während (B) AF488-HEK-IPSE an ungefähr 60% der B-Zellen bindet (C) Im z-stack zeigte sich auch keine Aufnahme von PF488-HEK-IPSE in die B-Zellen. Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von drei durchgeführten. Abbildung 4-9 zeigt die Bindung von AF488-HEK-IPSE an die B-Zellen bei höherer Vergrößerung. Ca. 60% der B-Zellen haben IPSE/alpha-1 gebunden (grüne Pfeile); B-Zellen, die kein IPSE gebunden haben, erscheinen schwarz (schwarze Pfeile). Abbildung 4-9: Konfokalmikroskopie zur Untersuchung der Aufnahme von AF488-HEK-IPSE in humane B-Zellen. In dem Durchlichtbild sind mehrere Zellen zu sehen (rechts), ca. 60% der B-Zellen haben AF488-HEK-IPSE aufgenommen (links, grüne Pfeile). B-Zellen, die kein AF488-HEK-IPSE aufgenommen haben, erscheinen schwarz (links, schwarze Pfeile). Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von drei durchgeführten. Als nächstes wurde untersucht, ob sich das AF488-HEK-IPSE in der B-Zelle wiederfinden lässt. Mittels Gegenfärbung mit Hoechst 33342 (Endkonzentration: 1 µM) und 53 Ergebnisse LysoTracker Red (1: 10000) sollte untersucht werden, wo IPSE/alpha-1 nach Aufnahme in der Zelle lokalisiert ist. Dazu wurde ein z-stack von einer oder mehreren Zellen gleichzeitig aufgenommen. In Abbildung 4-10 wird deutlich, dass AF488-HEK-IPSE in die B-Zelle aufgenommen wird. Weiter konnte gezeigt werden, dass AF488-HEK-IPSE in der Nähe des Zellkerns gefunden wurde und nicht mit den Lysosomen interagierte. Abbildung 4-10: z-stack-Bilder der Konfokalmikroskopie zur Untersuchung der Lokalisation von IPSE/alpha-1 in den humanen B-Zellen. Auf den Bildern ist der z-stack von (A) einer B-Zelle in 600x Vergrößerung oder (B) mehreren B-Zellen in 180x Vergrößerung gezeigt. In Blau ist der Zellkern und in Rot die Lysosomen dargestellt. AF488-HEK-IPSE (grün) befindet in einigen B-Zellen in der Nähe des Zellkerns. (C) Aufnahme bei höherer Vergrößerung. Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von drei durchgeführten. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass IPSE/alpha-1 an ca. 80% der B-Zellen bindet und von den meisten auch aufgenommen wird. In den B-Zellen wird IPSE/alpha-1 in der Nähe des Kerns gefunden, aber nicht in den Lysosomen. Bisher gibt es aber keine Erklärung für das unterschiedliche Verhalten von PF488-HEK-IPSE und AF488-HEK-IPSE im FACS und Lebendzell-Mikroskopie. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob IPSE/alpha-1, da es an B-Zellen bindet und aufgenommen wird, einen modulierenden Effekt auf die Zytokinproduktion von B-Zellen ausübt. 54 Ergebnisse 4.2.5 Der Einfluss von IPSE/alpha-1 auf die Funktion von humanen B-Zellen Die chronische Phase der Infektion mit S. mansoni ist charakterisiert durch die kontinuierliche Ablage von S. mansoni-Eiern, die nach Ausreifung IPSE/alpha-1 sezernieren. Gleichzeitig entsteht eine anti-inflammatorische Immunantwort, an der auch IL-10-produzierende B-Zellen beteiligt sind (Smits et al., 2007; van der Vlugt et al., 2012). Es lag daher nahe, zu prüfen, ob IPSE/alpha-1 an der Induktion regulatorischer IL-10produzierender B-Zellen beteiligt ist. Diese Versuche wurden in Kooperation mit Dr. Hermelijn Smits am LUMC in Leiden durchgeführt. Dort konnte ich während eines 8-wöchigen Aufenthalts grundlegende Techniken erlernen und diese dann am Forschungszentrum Borstel etablieren. In der Literatur sind sowohl TLR-Liganden wie LPS (TLR4) oder CpG (TLR9) als auch „Nicht-TLR“-Liganden wie anti-IgG/IgM oder anti-CD40 als Stimuli für B-Zellen beschrieben. Um das System zu etablieren, wurden daher die B-Zellen zunächst mit LPS (100 ng/ml), CpG (1 µg/ml), anti-IgG/IgM (20 µg/ml) oder anti-CD40 (10 µg/ml) für 48 h inkubiert. Die Stimulations-Konzentrationen wurden aus Leiden übernommen (H. Smits, pers. Mittelung) . Im Zellkulturüberstand wurden IL-10 und IL-6 als typische anti- bzw. proinflammatorische Zytokine bestimmt (Kapitel 3.4). In den fünf (für CpG und LPS) bzw. vier (für anti-IgG/IgM und anti-CD40) ReplikationsExperimenten zeigte sich, dass die Höhe der Zytokinfreisetzung der B-Zellen verschiedener Spender individuell sehr stark variiert (Abbildung 4-11). Das Muster der Zytokinfreisetzung zeigte jedoch Spender-übergreifend Übereinstimmungen: So führte die Stimulation mit LPS oder anti-CD40 zu einer leichten, nicht-signifikant erhöhten Freisetzung von IL-10 und zu einer starken, nicht-signifikant erhöhten Freisetzung von IL-6. Die Stimulation mit CpG oder anti-IgG/IgM hingegen führte zu einer stärkeren, signifikant erhöhten Freisetzung von IL-10 und einer geringen Freisetzung von IL-6, die für CpG signifikant war. Wird das Verhältnis von IL-10 zu IL-6 relativ zum Medium betrachtet, so zeigte sich, dass die Stimulation mit CpG und anti-IgG/IgM eher anti-inflammatorisch wirkte. Die Stimulation mit LPS und anti-CD40 wirkte eher pro-inflammatorisch. 55 Ergebnisse Abbildung 4-11: Stimulation von humanen B-Zellen mit CpG bzw. anti-IgG/IgM (blau) führt überwiegend zur Freisetzung von IL-10 (A, B), während LPS bzw. anti-CD40 (rot) überwiegend die Freisetzung von IL-6 induzieren (C, D). B-Zellen verschiedener Spender wurden isoliert und mit CpG oder LPS (A, C), (n = 5), bzw. mit anti-IgG/IgM oder anti-CD40 (B, D), (n = 4) stimuliert und die Freisetzung von IL-10 (A, B) bzw. IL-6 (C, D) im ELISA bestimmt. Die Stimulation mit CpG bzw. anti-IgG/IgM wirkte eher anti-inflammatorisch, LPS bzw. anti-CD40 eher pro-inflammatorisch (E, F). Es wurde der Mittelwert ± SD angegeben. Für die Statistik wurde der gepaarte t-Test verwendet (*, p < 0,05; ns, p ≥ 0,05). 56 Ergebnisse Im Folgenden sollte untersucht werden, ob eine Stimulation mit soluble egg antigen (SEA 20 µg/ml), der lösliche Gesamtextrakt aus den S. mansoni-Eiern, oder HEK IPSE (10 µg/ml) allein oder in Kombination mit CpG, LPS, anti-IgG/IgM oder anti-CD40 einen modulierenden Einfluss auf die Zytokinproduktion der B-Zellen ausübt.. SEA enthält neben anderen Proteinen auch nIPSE. Das Ergebnis dieser Experimente ist in Abbildung 4-12 dargestellt. Während HEK-IPSE allein keinen Effekt auf die Zytokinproduktion der B-Zellen hatte, induzierte SEA eine IL-10- und IL-6-Freisetzung vergleichbar mit der Freisetzung nach Stimulation mit LPS. Sowohl SEA als auch HEK-IPSE hatten keinen modulierenden Effekt auf die durch LPS, CpG, anti-IgG/IgM oder anti-CD40-induzierte IL-10-Freisetzung aus B-Zellen. Während HEK-IPSE auch keinen Effekt auf die LPS, CpG, anti-IgG/IgM oder anti-CD40-induzierte IL-6-Freisetzung hatte, führte die zusätzliche Stimulation mit SEA auch hier zu einer IL-6-Freisetzung vergleichbar mit der Freisetzung nach LPS-Stimulation. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass SEA, wie in der Literatur beschrieben über TLR4 wirkt (Thomas et al., 2003) oder dass SEA, welches aus Schistosomen-Eiern gewonnen wird, Spuren von LPS enthält. Eine Bestimmung des LPS-Gehaltes des für diesen Versuch verwendeten SEA ergab in der Tat eine „Verunreinigung“ von 20 ng LPS / mg Protein. In der Kombination mit anti-IgG/IgM oder anti-CD40 zeigte sich bei SEA kein Effekt, was die Freisetzung von IL-10 betraf. Bei der Bestimmung von IL-6 zeigte sich, dass die Kombinationen mit SEA unabhängig vom ersten Stimulus gleich viel IL-6 freisetzten. 57 Ergebnisse Abbildung 4-12: Die Stimulation mit SEA führt zur Freisetzung von mehr IL-6 als IL-10, während die Stimulation mit HEK-IPSE keinen Effekt zeigte. Fünf (bei LPS und CpG) oder vier (bei anti-IgG/IgM und anti-CD40) verschiedene Spender wurden in Kombination mit SEA (20 µg/ml) oder HEK-IPSE (10 µg/ml) stimuliert. Es zeigte sich eine Spender-abhängige Freisetzung der Zytokine. In der Abbildung wurde die Freisetzung von IL-10 (A) und IL-6 (B) nach Stimulation mit LPS und CpG (n = 5), sowie die Freisetzung von IL-10 (C) und IL-6 (D) nach Stimulation mit anti-IgG/IgM und anti-CD40 (n = 4) dargestellt. Die Querbalken stellen den Mittelwert dar. Die Signifikanz wurde mit dem 2-Wege ANOVA mit anschließendem MehrfachVergleichstest nach Tukey ermittelt (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001; **** p < 0,0001). 58 Ergebnisse Zusammenfassend konnte zwar eine Bindung und eine mögliche Aufnahme von IPSE/alpha-1 an bzw. in humane B-Zellen gezeigt werden, ein möglicher modulierender Effekt auf die Zytokinproduktion von B-Zellen, konnte jedoch in den gewählten Versuchsansätzen nicht nachgewiesen werden. 4.2.6 Nur B-Zellen, die IPSE/alpha-1 binden, produzieren IL-10 Alle bisher durchgeführten Stimulationsversuche wurden mit der Gesamtpopulation der isolierten CD19-positiven B-Zellen durchgeführt. Berücksichtigt man jedoch, dass IPSE/alpha-1 bei der hier eingesetzten Konzentration von 10 µg/ml nur an 10 - 30% der B-Zellen bindet (im Gegensatz zu anti-IgG/IgM, das schon bei einer Konzentration von 2,5 µg/ml an 100% der B-Zellen bindet), besteht die Möglichkeit, dass der Effekt von IPSE/alpha-1 in der Gesamtpopulation nicht nachweisbar ist. Noch extremer dürfte das bei dem gesamten Ei-Extrakt SEA ins Gewicht fallen, da IPSE/alpha-1 nur ca. 1-2 % des SEA ausmacht. Daher wurde im nächsten Schritt die isolierte Gesamtpopulation der B-Zellen nach HEK-IPSE (bzw. SEA)-bindenden B-Zellen vorsortiert und anschließend wie schon zuvor für 48 h stimuliert (Kapitel 3.2.5). Als Positivkontrolle wurden die Zellen mit einer Mischung aus LPS (100 ng/ml) und CpG (1 µg/ml) inkubiert. Zu diesem Ansatz wurde auch 20 µg/ml SEA bzw. 10 µg/ml HEK-IPSE gegeben, da die sog. „IPSE-Binders“ nach der Sortierung auch schon Selbiges gebunden hatten. Die IL-10-Produktion der B-Zellen wurde sowohl intrazellulär (Kapitel 3.3.4) als auch im Zellkulturüberstand analysiert (Kapitel 3.4). Die Gating-Strategie für die FACS-Analyse ist in Abbildung 4-13 dargestellt. Zunächst wurde das Gate im FSC/SSC-Dotplot auf die B-Zellen (70,4%) gelegt. Anschließend wurden die Einzelzellen sowohl im FSC-A/FSC-W Dotplot (96,6%), als auch im SSC-A/SSC-W Dotplot (95,5%) identifiziert. Da die nachzuweisenden IL-10-positiven B-Zellen nicht TNF-α-positiv sein sollten, wurden die TNF-α-negativen B-Zellen gegatet (97,5%). TNF-α ist wie IL-6 ein typisches pro-inflammatorisches Zytokin. Anschließend wurden die IL-10positiven B-Zellen (13%) identifiziert. Da bei der intrazellulären Färbung auch gleichzeitig die Oberflächenmarker mitgefärbt wurden (siehe Kapitel 4.2.7), war auch CD24 gefärbt. 59 Ergebnisse Abbildung 4-13: Gating-Strategie zur Identifizierung der IL-10-positiven B-Zellen. Das Gating ist anhand der Positivkontrolle CpG/LPS + IPSE gezeigt. Zunächst wurden die B-Zellen und im Anschluss die Einzelzellen im FSC und SSC identifiziert. IL-10-positive B-Zellen sind gleichzeitig auch TNF-α-negativ. Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von zwei durchgeführten. Bei der intrazellulären Färbung wurden nur die TNF-α-negativen IL-10-positiven B-Zellen betrachtet. Diese Population ist sowohl bei den SEA- (2,6% ± 0,9%) als auch bei den HEK-IPSE-„IPSE-Binders“ (2,4% ± 1,1%) im Vergleich zu den „IPSE-Non-binders“ (1,5% ± 0,3% bzw. 1% ± 0,5%) leicht erhöht (Abbildung 4-14). Eine Untersuchung auf Signifikanz konnte nicht durchgeführt werden, da der Versuch nur zweimal durchgeführt wurde. Weitere Replikat-Experimente sind geplant. Auch bei der Zugabe von CpG/LPS zu SEA bzw. HEK IPSE zeigte sich ein ähnliches Bild, wobei CpG und LPS die Produktion von IL-10 erhöht. Im ELISA zeigte sich, dass nur B-Zellen, die SEA oder HEK-IPSE binden, IL-10 freisetzen. CpG und LPS erhöhen die Freisetzung von IL-10, so dass der Effekt von SEA oder HEK-IPSE möglicherweise maskiert ist. 60 Ergebnisse Abbildung 4-14: Nur die B-Zellen, an die SEA bzw. HEK-IPSE binden, produzieren IL-10. (A) Intrazelluläre Färbung der B-Zellen. TNF-α-negative, IL-10-positive B-Zellen sind sowohl bei den SEA(links; 2,6% ± 0,9%) als auch bei den HEK-IPSE-„binders“ (rechts; 2,4% ± 1,1%) im Vergleich zu den „IPSENon-binders“ (1,5% ± 0,3% bzw. 1% ± 0,5%) leicht erhöht. Auch bei der Zugabe von CpG/LPS zu SEA bzw. HEK-IPSE zeigte sich ein ähnliches Bild, wobei CpG und LPS die Produktion von IL-10 erhöht. (B) Bestimmung von IL-10 im ELISA. B-Zellen, die SEA (links) oder HEK-IPSE (rechts) binden, setzen IL-10 frei. In den „IPSE-Non-binders“ ist IL-10 nicht detektierbar (n.d.). CpG und LPS erhöhen die Freisetzung von IL-10 (n = 2). Zusammenfassend kann gesagt werden, wenn die Gesamtpopulation von B-Zellen betrachtet wird, ist ein Effekt von IPSE/alpha-1 nicht sichtbar. Dies kann damit zusammenhängen, dass HEK-IPSE bei einer Konzentration von 10 µg/ml nur an 39% ± 20% der B-Zellen bindet und auf diese Zellen auch nur einen modulierenden Effekt ausüben kann. Dafür spricht, dass nach der Sortierung der IPSE-bindenden B-Zellen nur diese Zellen IL-10 freisetzen. 4.2.7 IPSE/alpha-1-bindende B-Zellen exprimieren für IL-10-produzierende B-Zellen typische Oberflächenmarker In der Literatur sind IL-10-produzierende B-Zellen bisher hauptsächlich über IL-10 definiert (Blair et al., 2010; Bouaziz et al., 2010; Iwata et al., 2011). Es werden zurzeit noch Oberflächenmarker gesucht, die die ganze Population der IL-10-produzierenden B-Zellen (oder auch regulatorische B-Zellen) beschreibt. Bisher bekannt sind CD1d-positive B-Zellen, CD24hi CD27hi-B-Zellen und CD38hi CD24hi-B-Zellen, die die Population von 61 Ergebnisse IL-10-produzierenden B-Zellen teilweise umschreiben. Diese Populationen wurden im folgenden Kapitel auch in den vorsortierten IPSE-bindenden B-Zellen untersucht. Wie zuvor in Abbildung 4-13 gezeigt ist, wurde das Gate im FSC/SSC-Dotplot auf die B-Zellen (70,4%) gelegt. Anschließend wurden die Einzelzellen sowohl im FSC-A/FSC-W Dotplot (96,6%), sowie im SSC-A/SSC-W Dotplot (95,5%) identifiziert. Da bei der intrazellulären Färbung ausschließlich die IL-10-positiven B-Zellen identifiziert werden sollten, wurden die B-Zellen zunächst als TNF-α-negativ (97,5%) gegatet. In Abbildung 4-15 ist die weitere Gating-Strategie dargestellt, um die verschiedenen Populationen zu identifizieren. Zunächst wurden die CD1d-positiven B-Zellen (1,3%) identifiziert. Innerhalb dieser CD1d-positiven Zellen wurden die IL-10-positiven Zellen gegatet. Der Anteil von IL-10-, CD1d-positiven B-Zellen an der gesamten Population von B-Zellen, die analysiert wurde, beträgt in diesem Beispiel 0,48%. Die IL-10-positiven B-Zellen innerhalb der CD24hi CD27hi-B-Zellen und CD38hi CD24hi-B-Zellen wurden auf die gleiche Weise identifiziert, wobei diese Zellen zusätzlich CD1d-negativ sind. In diesem Beispiel des Gatings sind 2,3% der B-Zellen IL-10-positiv, CD38hi und CD24hi sowie 2,6% der B-Zellen IL-10-positiv, CD24hi und CD27hi. 62 Ergebnisse Abbildung 4-15: Gating-Strategie zur Identifizierung der CD1d+-B-Zellen, CD24hi CD27hi-B-Zellen und CD38hi CD24hi-B-Zellen, die auch für IL-10 positiv sind. Das Gating ist anhand der Positivkontrolle CpG/LPS + IPSE gezeigt. Zunächst wurden die B-Zellen, wie in Abbildung 4-13 gezeigt, identifiziert. Bei dem weiteren Gating wurden zunächst die CD1d-positiven B-Zellen (1,3%) identifiziert. Innerhalb dieser CD1d-positiven Zellen wurden die IL-10-positiven Zellen gegatet (0,48%). Die IL-10-positiven B-Zellen innerhalb der CD24hi CD27hi-B-Zellen und CD38hi CD24hi-B-Zellen wurden auf die gleiche Weise identifiziert, wobei diese Zellen zusätzlich CD1d-negativ sind. Dargestellt ist exemplarisch ein Experiment von zwei durchgeführten. Die beiden durchgeführten Experimente sind in Abbildung 4-16 zusammenfassend dargestellt. Die B-Zellen, die SEA und HEK-IPSE binden, zeigten auch eine erhöhte Expression der Oberflächenmarker, die für IL-10-produzierende B-Zellen beschrieben sind, im Vergleich zu den „IPSE-Non-binders“. Werden die „IPSE-binders“ mit den „IPSE-Nonbinders“ verglichen, so zeigte sich, dass die Oberflächenmarker bei den SEA-bindenden B-Zellen doppelt so hoch waren wie bei den nicht-SEA-bindenden B-Zellen. In Zahlen ausgedrückt sind 0,08% ± 0,03% der SEA-bindenden B-Zellen für IL-10 und CD1d-positiv im Gegensatz zu 0,036% ± 0,016% bei den „IPSE-Non-binders“. 63 Ergebnisse Bei den IL-10-positiven, CD24hi und CD27hi B-Zellen sind es 0,42% ± 0,25% im Vergleich zu 0,26% ± 0,19% und bei den IL-10-positiven, CD38hi und CD24hi B-Zellen sind es 0,15% ± 0,08% im Vergleich zu 0,08% ± 0,04%. Bei den HEK-IPSE-bindenden B-Zellen war die Expression der Oberflächenmarker dreimal so hoch (CD1d-positiv: 0,06% ± 0,04% vs. 0,02% ± 0,01%; CD24hi CD27hi: 0,46% ± 0,40% vs. 0,15% ± 0,13%; CD38hi CD24hi: 0,14% ± 0,10% vs. 0,05% ± 0,04%). Abbildung 4-16: IPSE-bindende B-Zellen zeigen eine erhöhte Expression der Oberflächenmarker, die für IL-10-produzierende B-Zellen beschrieben sind. Es sind die SEA- (links) und HEK-IPSE-bindenden B-Zellen (rechts) im Vergleich zu den nicht-bindenden B-Zellen dargestellt. (A) Analyse der Expression von IL-10- und CD1d-positiven B-Zellen. (B) Analyse der Expression von IL-10-positven, CD24hi und CD27hi B-Zellen. (C) Analyse der Expression von IL-10-positiven, CD38hi und CD24hi B-Zellen (n = 2). 64 Ergebnisse Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das von Schistosomen-Eiern sezernierte Glykoprotein, IPSE/alpha-1, über den BZR an humane B-Zellen bindet und von diesen aufgenommen wird. In den B-Zellen gelangt IPSE/alpha-1 nicht in die Lysosomen, sondern wurde in der Nähe des Zellkerns lokalisiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass B-Zellen, nach Interaktion mit IPSE/alpha-1 eine erhöhte Produktion des anti-entzündlichen Zytokins IL-10 aufwiesen. Dies ging einher mit einer erhöhten Expression von Oberflächenmarkern, die kürzlich als charakteristisch für IL-10-produzierende B-Zellen beschrieben wurden. Nachdem regulatorische B-Zellen sich durch eine erhöhte IL-10-Freisetzung auszeichnen, deuten unsere Ergebnisse daraufhin, dass IPSE/alpha-1 in eine Induktion der regulatorischen B-Zell-Antwort während einer Schistosomen-Infektion involviert sein könnte. 4.3 Pilotstudien zur Expression der IgE-Rezeptoren und deren Beladung mit IgE auf Monozyten Neben B-Zellen bindet IPSE/alpha-1 auch an Monozyten (Kapitel 4.1). Ein direkter Effekt von IPSE/alpha-1 auf aus PBMC isolierte, humane Monozyten konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (K. Knuhr, Diplomarbeit, 2010). Auch aus Monozyten generierte, dendritische Zellen (moDC), die nach Konditionierung mit Omega-1 eine Polarisation der T-Zellantwort in Richtung Th2 vermittelten, zeigten keinen Effekt nach Stimulation mit IPSE/alpha-1 (Everts et al., 2009). Nachdem humane Monozyten sowohl den hoch-affinen (FcεRI) als auch den niedrig-affinen (FcεRII oder CD23) Rezeptor für IgE exprimieren können, sollte daher untersucht werden, ob IPSE/alpha-1 möglicherweise über die Bindung an IgE, wie schon zuvor für Basophile gezeigt, mit Monozyten interagiert. In dieser Arbeit sollte in Voruntersuchungen geklärt werden, ob und unter welchen Bedingungen die hoch- und niedrig-affinen Rezeptoren auf Monozyten vorliegen, und ob sie mit IgE beladen sind. Dabei war insbesondere ein Th2-Millieu wie es im SchistosomenEi-Granulom vorliegt von Interesse, da IPSE/alpha-1 hier auf die Monozyten trifft. Dazu wurden frisch aus dem peripheren Blut gesunder, nicht-allergischer Spender isolierte Monozyten verglichen mit solchen, die 24 h oder 6 d in Anwesenheit von IL-4 und GM-CSF ± IgE kultiviert wurden. 65 Ergebnisse Zunächst wurden Monozyten, die frisch isoliert wurden, Monozyten, die für 24 h mit IL-4 (250 U/ml) und GM-CSF (900 U/ml) inkubiert wurden, oder Monozyten, die für 6 d mit IL-4 und GM-CSF inkubiert wurden (moDCs) bezüglich ihrer Expression der IgE-Rezeptoren und deren Beladung mit IgE durchflusszytometrisch untersucht (Kapitel 3.3.3). Die Gates wurden anhand von FMO-Kontrollen gesetzt, die in Abbildung 4-17 beispielhaft für frisch isolierte Monozyten dargestellt sind. Abbildung 4-17: Gating-Strategie zum Nachweis von IgE am FcεRI und CD23. (A) Die Dotplots zeigen die FMO-Kontrollen der frisch isolierten Monozyten. (B) Zunächst wurden die FcεRI-positiven von den CD23positiven Monozyten unterschieden. Danach erfolgte der Nachweis von IgE auf diesen Zellen. Dargestellt ist exemplarisch ein von drei durchgeführten Experimenten. Abbildung 4-18 zeigt die Expression der beiden IgE-Rezeptoren und ihre Beladung mit IgE beispielhaft für einen von Spender. Abbildung 4-19 zusammengefasst für vier unabhängige Experimente. 66 Ergebnisse Abbildung 4-18: Expression von FcεRI und CD23 sowie der Nachweis von IgE auf frisch isolierten (0 h), für 24 h mit IL-4 und GM-CSF inkubierten (24 h) und moDC (6 Tage). Die Histogramme zeigen jeweils die ungefärbten Zellen (blau), FMO-Kontrollen (grün) und mit anti-human-FcεRIα, anti-human-CD23 und anti-human-IgE gefärbten moDCs (rot). Frisch isolierte Monozyten exprimieren FcεRI. 24 h mit IL-4 und GMCSF kultivierte Monozyten exprimieren CD23 und können mit IgE beladen werden. Nach 6 Tagen mit IL-4 und GM-CSF exprimierten die moDCs den FcεRI stark, während CD23 nicht mehr ganz so stark exprimiert war. Diese Zellen konnten mit IgE beladen werden. Dargestellt ist eines von drei durchgeführten Experimenten. 67 Ergebnisse Abbildung 4-19: Verlauf der Expression von FcεRI und CD23 sowie Bindung von IgE. Die Abbildung zeigte jeweils die Prozentzahl der positiven Zellen (links) sowie die mediane Fluoreszenzintensität der in Medium (schwarz), mit IL-4 und GM-CSF (rot) und mit IL-4, GM-CSF und IgE (blau) inkubierten Zellen. Der FcεRI wurde innerhalb der ersten 24 h runterreguliert. Nach 24 h mit IL-4 und GM-CSF exprimierten die Monozyten CD23 und konnten IgE binden. Die moDCs exprimierten zusätzlich den FcεRI und konnten mit IgE beladen werden (n = 4). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD. Die Signifikanz wurde mit dem gepaarten t-Test ermittelt, da nur die Werte innerhalb einer Gruppe auf Signifikanz untersucht wurden (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Die Expression der beiden IgE-Rezeptoren folgt offensichtlich einer ganz unterschiedlichen Kinetik. Der hoch-affine FcεRI war bereits auf frisch isolierten Monozyten gesunder, nichtallergischer Spender deutlich exprimiert. Innerhalb von 24 h in Kultur verschwindet der FcεRI von der Oberfläche der Monozyten, wahrscheinlich wird er internalisiert. Ein Th2Zytokin-Millieu (Inkubation mit IL-4 und GM-CSF) führte dazu, dass nach 24 h der FcεRI weiter exprimiert wurde, allerdings deutlich geringer als auf frisch isolierten Monozyten. Erst eine längere Anwesenheit von IL-4 (hier 6 d) führte zu einer deutlich erhöhten Expression des hoch-affinen Rezeptors. Der niedrig-affine IgE-Rezeptor CD23 war dagegen auf frisch isolierten Monozyten kaum exprimiert. Nach 24 h IL-4 und GM-CSF stieg die Expression stark an und blieb auch über einen längeren Zeitraum hoch. Sobald die Rezeptoren exprimiert waren, ließen sie sich auch mit IgE beladen, wobei sich in diesem experimentellen Ansatz nicht unterscheiden ließ, an welchen Rezeptor das IgE 68 Ergebnisse gebunden hatte bzw. wieviel IgE durch Internalisierung möglicherweise nicht mehr nachweisbar ist. Nach 24 h Kultur mit IL-4 schien die zusätzliche Anwesenheit von IgE die Expression des hoch-affinen Rezeptors zu erhöhen, nach 6 d ging das allerdings wieder zurück, was durch Internalisierung des Rezeptors mit gebundenem IgE zu erklären wäre. Weitere Untersuchungen, z.B. mit markiertem IgE, sind erforderlich, um die Vorgänge genau aufzuklären. Zusammenfassend wurden erste Bedingungen gefunden, in denen Monozyten mit IgE beladen sind. In zukünftigen Experimenten soll der Effekt von IPSE/alpha-1 auf diese Zellen in Hinsicht auf die Produktion von IL-10 und alternativ-aktivierten Makrophagen untersucht werden. 69 Diskussion 5 Diskussion Die Ziele dieser Arbeit waren es, weitere Zielzellen von IPSE/aplha-1 zu identifizieren und die Interaktion von IPSE/alpha-1 mit diesen Zellen genauer zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 sowohl an humane Monozyten und als auch B-Zellen bindet. Eine Bindung an T-Zellen wurde nicht gefunden. Eine bekannte Struktur, an die IPSE/alpha-1 binden kann, sind Immunglobuline. Da IPSE/alpha-1 an Immunglobuline bindet und B-Zellen den BZR als membranständiges Immunglobulin auf der Oberfläche tragen, wurde zunächst der Effekt von IPSE/alpha-1 auf humane B-Zellen untersucht. Ein Teil dieser Arbeit wurde am Leiden University Medical Center (LUMC) in Leiden in der Gruppe von Dr. H.H. Smits durchgeführt, wo parallel auch der Effekt von IPSE/alpha-1 auf murine B-Zellen untersucht wurde. 5.1 Humane B-Zellen und ihre Interaktion mit IPSE/alpha-1 Im ersten Abschnitt wird die Bindung und Aufnahme von IPSE/alpha-1 untersucht. Im zweiten Teil wird der Fokus auf die Zytokinproduktion nach Stimulation gelegt, um eine mögliche Funktion von IPSE/alpha-1 auf B-Zellen nachzuweisen. 5.1.1 IPSE/alpha-1 bindet an den B-Zell-Rezeptor der B-Zellen Die B-Zellen können Immunglobuline auf zwei Arten an der Zelloberfläche tragen. Zum einen können Immunglobuline direkt als Transmembranrezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert werden, so der BZR, der spezifische Antigene erkennt. Eine weitere Möglichkeit ist die Bindung von Immunglobulinen über sogenannte Fc-Rezeptoren. Der Fc-Rezeptor bindet den Fc-Teil des Immunglobulins, so dass die antigen-spezifischen Fab-Fragmente zugänglich bleiben. Die B-Zellen tragen den niedrig-affinen IgG Rezeptor FcγRIIB (CD32) und den niedrig-affinen IgE Rezeptor FcεRII (CD23) auf der Oberfläche. (Daëron, 2014). Die Expression von CD23 auf B-Zellen ist ohne Stimulus gering und wird durch IL-4 und IL-13 induziert (Punnonen et al., 1993, Bonnefoy et al., 1995) 70 Diskussion In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 an einen großen Teil der B-Zellen bindet. Während HEK-IPSE an bis zu 80% der B-Zellen bindet, sind es bei nIPSE nur 50-60%. Ursache für die niedrigere Prozentzahl kann eine ungenau berechnete Proteinkonzentration von nIPSE bzw. HEK-IPSE sein. Die Konzentrationen wurden durch die Messung der optischen Dichte bei 280 nm bestimmt. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz lässt sich daraus die Konzentration berechnen, sofern der Extinktionskoeffizient des Proteins bekannt ist. Der Extinktionskoeffizient kann aus der Aminosäuresequenz berechnet werden (Gill und Hippel, 1989). Die unterschiedliche Glykosylierung von HEK-IPSE und nIPSE wird nicht mit in die Berechnung des Extinktionskoeffizienten einbezogen. Während nIPSE nur N-glykosidisch-gebundene Zucker besitzt, weist HEK-IPSE vermutlich auch O-glykosidische Zucker auf (M. Wodrich, Dissertation, 2006). Die Bindung von IPSE/alpha-1 an B-Zellen konnte nur durch die vorherige Inkubation mit anti-IgG/IgM blockiert werden. Das bedeutet, dass IPSE/alpha-1 ausschließlich über den BZR an die B-Zellen bindet. Bei dem Blockierungsantikörper handelte es sich nur um das F(ab‘)2-Fragment, so dass IPSE/alpha-1 selbst auch nicht an den Blockierungsantikörper binden konnte. Mannan fungierte als Kontrolle, da es die Bindung an „C-type lectin“Rezeptoren (CLR) hemmt. Das war erwartungsgemäß nicht der Fall, da B-Zellen keine Mannose-Rezeptoren besitzen. Die Bindung von IPSE/alpha-1 konnte auch nicht durch EGTA gehemmt werden. EGTA blockiert alle Ca2+-abhängigen Rezeptoren, Interessanterweise konnte die Bindung auch nicht durch IgE inhibiert werden. B-Zellen können den niedrig-affinen IgE-Rezeptor CD23 exprimieren. Unser Ergebnis kann bedeuten, dass die B-Zellen der hier eingesetzten gesunden Spender entweder kein CD23 exprimieren (Punnonen et al., 1993) oder diese nicht bzw. nur mit sehr wenig IgE beladen sind. 5.1.2 IPSE/alpha-1 wird von humanen B-Zellen aufgenommen Bei den zunächst durchgeführten FACS-Experimenten konnte nicht unterschieden werden, ob IPSE/alpha-1 bei 37 °C aufgenommen wurde oder schlechter bindet. Daher wurde die Konfokalmikroskopie als Methode zum Nachweis der Aufnahme von IPSE/alpha-1 in B-Zellen gewählt. Die Vermutung der Aufnahme von IPSE/alpha-1 konnte damit bestätigt werden. 71 Diskussion Bindet ein Antigen an den BZR, so wird dieser Antigen-BZR-Komplex in die Zelle aufgenommen. Es ist beschrieben, dass der endozytierte Antigen-BZR-Komplex in den Lysosomen zu finden ist und dort der Abbau des Antigens stattfindet (Lankar et al., 2002). Die Antigenfragmente werden auf MHC-II Moleküle geladen. Diese mit Antigen beladenen MHC-II Komplexe werden an die Zelloberfläche exportiert und den CD4-positiven T-Zellen präsentiert (Yuseff et al., 2013). Somit war zu erwarten, dass IPSE/alpha-1 in den Lysosomen zu finden ist. Es zeigte sich jedoch, dass IPSE/alpha-1 in der Nähe des Zellkerns und nicht in den Lysosomen gefunden wurde. Eine Möglichkeit ist, dass sich IPSE/alpha-1 im endoplasmatischen Retikulum (ER) befindet. Das ER ist in der Nähe des Kerns lokalisiert. Das raue ER ist mit den zahlreichen Ribosomen, die auf der Oberfläche zu finden sind, an der Proteinsynthese beteiligt. Die ER-ständigen Ribosomen produzieren Proteine, die durch Kanäle direkt ins Lumen des rauhen ER gelangen und dort gefaltet werden, posttranslational modifiziert werden oder oligomerisieren (Hegde und Lingappa, 1999). IPSE/alpha-1 könnte dort in die Proteinsynthese eingreifen und diese modulieren. Eine zweite mögliche Erklärung ist, dass IPSE/alpha-1 aufgrund der nuclear localization sequence (NLS) an der Kernmembran lokalisiert ist, weil es weiter in den Kern transportiert wird. Dort könnte IPSE/alpha-1 als Transkriptionsfaktor wirken. Fraglich ist jedoch, warum IPSE/alpha-1 dann nicht auch im Kern gefunden wurde. Kaur et al. (2011) zeigte, dass IPSE/alpha-1 eine funktionelle NLS am C-Terminus besitzt. Es wurden bisher jedoch keine Immunzellen identifiziert, in denen IPSE/alpha-1 in den Kern transloziert wird. Interessant ist zusätzlich, dass die Aufnahme von IPSE/alpha-1 in humane B-Zellen nur nachgewiesen werden konnte, wenn das HEK-IPSE über die Zuckerstrukturen markiert wurde (AF488-IPSE). Bei einer Markierung von IPSE/alpha-1 über Amidbindungen wurde es nicht in den B-Zellen gefunden (PF488-IPSE). PF488-IPSE konnte in der Mikroskopie nur homogen verteilt um die Zelle herum detektiert werden, während in der FACS-Analyse eine Bindung nachgewiesen werden konnte. Bei der Bindung von Antigenen an den BZR kommt es laut Yang und Reth (2010) zu offenen Clustern von BZR und Antigen. Dies führt dazu, dass das Antigen an einer Stelle auf der B-Zelle angereichert vorliegt. Wird diese Art von offenen Clustern jedoch durch IPSE/alpha-1 verhindert, so liegen die B-Zell-Rezeptoren mit gebundenem IPSE/alpha-1 als Monomere auf der Oberfläche vor. Diese sind dann wie das um die Zellen liegende IPSE/alpha-1 gleichmäßig verteilt. Eine Bindung wäre somit nicht erkennbar. Dagegen spricht aber wiederrum die membrane raft (auch bekannt als 72 Diskussion lipid raft)-Hypothese. Membrane rafts sind kleine (10-200 nm), heterogene, hochdynamische Domänen, in denen zellulären Prozesse stattfinden können (Pike, 2006). In den Versuchen der Konfokalmikroskopie mit PF488-HEK-IPSE konnte nicht nur keine Bindung, sondern auch keine Aufnahme von IPSE/alpha-1 in die B-Zellen nachgewiesen werden. Eine Erklärung dafür könnte die Methode der Markierung sein. PF488-HEK-IPSE wurde über Amidbindungen an das Protein gebunden. Die N-glykosidisch- und auch O-glykosidisch-gebundenen Glykosylierungen, die bei HEK-IPSE vorhanden sind, blieben unberührt. B-Zellen exprimieren neben dem BZR auch Ko-Rezeptoren, wie z. B. FcγRIIB und CD22 (Tsubata, 2012). Bei der gleichzeitigen Bindung vom Antigen an den BZR und einen der beiden Ko-Rezeptoren wird die Signaltransduktion inhibiert (Nitschke, 2014). HEK-IPSE könnte über IgG an den FcγRIIB binden, so dass keine Signale über die immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM)-Struktur weitergegeben werden und die Aufnahme so inhibiert wird (Daëron et al., 1995). Eine weitere Möglichkeit ist die Inhibition über CD22. CD22 gehört zu der SIGLEC-Familie der Lektine (Crocker et al., 1998). SIGLEC steht für sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins. Es ist somit ein Lektin, das an Sialinsäure bindet. Anders als natürliches IPSE/alpha-1 hat das rekombinante IPSE/alpha-1, das in HEK-Zellen produziert wurde, endständige Sialinsäuren in den Zuckerstrukturen. Somit ist es möglich, dass PF488-HEK-IPSE gleichzeitig an den BZR und CD22 bindet und so die Aufnahme inhibiert wird. Zusätzlich spricht die Beobachtung, dass AF488-HEK-IPSE aufgenommen wurde, für eine Bindung an CD22. Bei der Markierung über AF488 wurde der Fluoreszenzfarbstoff an die Zuckerstruktur gebunden. Es ist möglich, dass nach der Markierung die endständigen Sialinsäuren nicht für die Bindung an CD22 frei waren. Dies würde für eine Aufnahme von AF488-HEK-IPSE in die B-Zellen sprechen. Um herauszufinden, warum PF488-HEK-IPSE nicht aufgenommen wurde, sind weitere Versuche mit einer nicht-glykosylierten HEK-IPSE Mutante oder IPSE, das in E. coli exprimiert wurde und somit nicht glykosyliert ist, geplant. 73 Diskussion 5.1.3 In der Gesamtpopulation der CD19-positiven B-Zellen ist nach Stimulation mit IPSE/alpha-1 keine Freisetzung von IL-10 nachweisbar B-Zellen sind in der Lage, Zytokine zu produzieren. Besonders IL-10-produzierende B-Zellen sind in den Fokus gerückt, da diese Toleranz induzieren. In den letzten Jahren wurden humane IL-10-produzierende B-Zellen von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben (Blair et al., 2010; Bouaziz et al., 2010; Iwata et al., 2011). In der Gesamtpopulation der CD19-positiven B-Zellen ist nach Stimulation mit IPSE/alpha-1 keine erhöhte Freisetzung von IL-10 nachweisbar. Sowohl mit soluble egg antigen (SEA), das nIPSE enthält, als auch mit dem rekombinant hergestellten HEK-IPSE, konnte keine Freisetzung von IL-10 induziert werden. Auch eine Kombination der Stimuli führte zu keinem Effekt. Ein generell interessanter Befund der vorliegenden Arbeit, der so in der Literatur noch nicht beschrieben ist, war die Beobachtung, dass die Stimulation von humanen B-Zellen mit LPS oder anti-CD40 zu einer eher pro-inflammatorischen Antwort führte. Die Stimulation mit CpG oder anti-IgG/IgM führte zu einer anti-inflammatorischen Antwort der B-Zellen. Durch eine Erhöhung der untersuchten Spender könnte sich dieser Effekt als signifikant darstellen. Bisher wurde in Untersuchungen zu IL-10-produzierenden B-Zellen meistens nur IL-10 bestimmt (Iwata et al., 2011). Bei Untersuchungen, in denen auch pro-inflammatorische Zytokine untersucht wurden, wurden diese aber nicht direkt ins Verhältnis zur IL-10 Produktion der B-Zellen gesetzt (van der Vlugt et al., 2014a). Bei Stimulation der B-Zellen mit SEA, zeigte sich eine Zytokinproduktion, die mit LPS vergleichbar ist. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass SEA mit LPS (20 ng/mg Protein) verunreinigt war und SEA selbst somit keinen Effekt auf die B-Zellen ausübte. Eine weitere Möglichkeit ist, dass SEA die B-Zellen über den Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) aktiviert. Einige Glykoproteine aus SEA tragen Lacto-N-fucopentaose III (LNFPIII) auf der Oberfläche (Okano et al., 2001). LNFPIII kann eine Th2-Antwort in DCs über TLR4 induzieren (Thomas et al., 2003) und somit evtl. auch eine Stimulation von B-Zellen über TLR4. 74 Diskussion 5.1.4 Nur B-Zellen, die IPSE binden, produzieren IL-10 und weisen eine erhöhte Expression von Oberflächenmarkern charakteristisch für regulatorische B-Zellen auf IPSE/alpha-1 bindet bei der eingesetzten Konzentration von 10 µg/ml nur an 10 - 30% der B-Zellen. Somit ist es möglich, dass der Effekt von IPSE/alpha-1 in der Gesamtpopulation nicht nachweisbar ist. Noch extremer dürfte das bei dem gesamten Ei-Extrakt SEA ins Gewicht fallen, da IPSE/alpha-1 nur ca. 1-2 % des SEA ausmacht. Daher wurde die isolierte Gesamtpopulation der B-Zellen nach HEK-IPSE (bzw. SEA)-bindenden B-Zellen vorsortiert und anschließend wie schon zuvor für 48 h stimuliert. Es zeigte sich, dass die B-Zellen, die IPSE bzw. SEA binden, mehr IL-10 freisetzen, als die B-Zellen, die IPSE bzw. SEA nicht binden. Weiterhin zeigte sich, dass diese „IPSE-binders“ eine erhöhte Expression von Oberflächenmarkern, die als typisch für IL-10-produzierende B-Zellen beschrieben wurden, aufwiesen. IPSE/alpha-1 könnte somit in eine Induktion der regulatorischen B-Zell-Antwort während einer Schistosomen-Infektion involviert sein. Bei der Schistosomen-Infektion spielen CD1d-positve, IL-10-produzierende B-Zellen eine Rolle (Correale et al., 2008; van der Vlugt et al., 2012). Es wurde gezeigt, dass CD1dpositive B-Zellen einen protektiven Effekt gegen allergische Atemwegserkrankungen vermitteln (Amu et al., 2010). Da B-Zellen, die IPSE/alpha-1 binden, eine erhöhte Expression von CD1d aufweisen, könnte IPSE/alpha-1 ein interessanter Kandidat für künftige therapeutische Interventionen bei allergischem Asthma darstellen. 5.2 Pilotversuche zur IgE-Rezeptor Expression und Beladung mit IgE auf Monozyten In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 nicht nur an B-Zellen, sondern auch an Monozyten bindet. Es ist bekannt, dass Monozyten Immunglobuline auf der Oberfläche tragen können. Neben IgE, das über FcεRI und CD23 an Monozyten gebunden werden kann, gibt es auch Rezeptoren für IgG, die von Monozyten exprimiert werden. Dazu gehören unter anderem FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB und FcγRIIIA (Daëron, 2014). Somit ist es möglich, dass IPSE/alpha-1 auch an die Monozyten über Immunglobuline bindet. 75 Diskussion Es ist beschrieben, dass Monozyten in Anwesenheit von IL-4 den niedrig-affinen IgERezeptor CD23 exprimieren (Alderson et al., 1994; Aiba et al., 2003). Daher wurden im Zusammenhang mit dieser Arbeit Versuche mit IL-4 und IgE durchgeführt. Es konnte bestätigt werden, dass CD23 mit IL-4 (und GM-CSF) innerhalb der ersten 24 h stark hochreguliert wurde. Der hoch-affine Rezeptor FcεRI wurde hingegen unter Einfluss von IL-4 und IgE nur leicht hochreguliert. Ohne diese Kulturzusätze verschwand er von der Zelloberfläche und wurde wahrscheinlich internalisiert. Ca. 60% der Monozyten konnten mit IgE beladen werden. Interessant ist, dass eine Inkubation von 24 h ohne Zusatz keinen Einfluss auf die Expression von CD23 hat. Es führte aber zu einer starken Herunterregulation von FcεRI. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass CD23 nicht aufgenommen wird. Die Regulation der Expression von CD23 wird durch ADAM-10 reguliert (Lemieux et al., 2007). ADAM-10 gehört zu der Disintegrin/Metalloproteinase-Familie, woher auch die Abkürzung ADAM abgeleitet wird (a disintegrin and metalloproteinase). Der FcεRI hingegen kann, wenn IgE an Selbigen gebunden ist, in die Zelle aufgenommen werden (Greer et al., 2014). Auch nach der Inkubation für 6 Tage mit IL-4 und GM-CSF blieb der niedrig-affine CD23 exprimiert, während der hoch-affine FcεRI erst jetzt hochreguliert wurde. Es zeigte sich jedoch, dass nur noch ca. 20% der Zellen IgE gebunden hatten. Da bei gleichzeitiger Expression von CD23 und FcεRI zu erwarten ist, dass IgE eher an den hoch-affinen FcεRI bindet, stellt sich die Frage, ob der FcεRI nur auf einigen moDCs exprimiert wird. Zu mindestens bei den Monozyten gibt es eine Subpopulation, die eine hohe Expression von FcεRI zeigen (Cheng et al., 2006). Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 an Monozyten bindet. Durch die Inkubation mit IL-4 und GM-CSF kann die Expression von CD23 (nach 24 h) und von FcεRI (nach 6 d) hochreguliert werden. Sind die IgE-Rezeptoren auf der Oberfläche vorhanden, so lassen diese sich auch mit IgE beladen. Zukünftige Experimente sollen zeigen, ob und welchen Effekt IPSE/alpha-1 auf Monozyten/Makrophagen, die in einem Th2-artigen Zytokin Milieu mit IgE beladene Rezeptoren auf der Oberfläche exprimieren, hat. 76 Diskussion 5.3 Ausblick Die immunmodulatorisch relevanten Eier des Helminthen S. mansoni sezernieren das Immunglobulin-bindende Glykoprotein IPSE/alpha-1. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IPSE/alpha-1 an Oberflächen-Immunglobuline von B-Zellen und Monozyten bindet. IPSE/alpha-1 wird von humanen B-Zellen aufgenommen und induziert hier einen regulatorischen Phänotyp, insbesondere die Produktion von IL-10. Diese Arbeit wurde in Kooperation mit Dr. Hermelijn Smits am LUMC in Leiden durchgeführt. Dort wird zurzeit der Effekt von IPSE/alpha-1 auf murine B-Zellen untersucht. Die Ergebnisse sollen genutzt werden, um zu prüfen, ob IPSE/alpha-1 auch in vivo im Mausmodell eine regulatorische Kapazität hat. Bezüglich der Interaktion mit Monozyten wurden im Rahmen der vorgelegten Dissertation erste Pilotuntersuchungen zur Expression und IgE-Beladung von humanen Monozyten durchgeführt. In zukünftigen Experimenten soll der Effekt von IPSE/alpha-1 an IL-4-konditionierten, IgE-beladenen Monozyten untersucht werden, insbesondere im Hinblick auf die Produktion von IL-10 und einen alternativ aktivierten Phänotyp. 77 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Abehsira-Amar, O., Gibert, M., Joliy, M., Thèze, J., and Jankovic, D.L. (1992). IL-4 plays a dominant role in the differential development of Tho into Th1 and Th2 cells. The Journal of Immunology 148, 3820–3829. Aiba, S., Manome, H., Yoshino, Y., and Tagami, H. (2003). Alteration in the production of IL-10 and IL-12 and aberrant expression of CD23, CD83 and CD86 by monocytes or monocyte-derived dendritic cells from atopic dermatitis patients. Experimental Dermatology 12, 86–95. Alderson, M.R., Armitage, R.J., Tough, T.W., and Ziegler, S.F. (1994). Synergistic Effects of IL-4 and either GM-CSF or IL-3 on the Induction of CD23 Expression by Human Monocytes: Regulatory Effects of IFN-α and IFN-γ. Cytokine 6, 407–413. 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Ich habe mich bisher noch keinem Promotionsverfahren unterzogen. 86 Veröffentlichungen Veröffentlichungen Teile dieser Arbeit wurden in folgendem Abstract mit Vortrag veröffentlicht:  Langhans, K., Nyenhuis, S., Smits, H.H., Haas, H., Schramm, G. (2015). IPSE/alpha-1, an immunoglobulin-binding factor from the parasitic worm Schistosoma mansoni, binds to and is taken up by human B cells. AllergieWorkshop, Mainz Weitere Publikationen:  Reimers, N., Homann, A., Höschler, B., Langhans, K., Wilson, R.A., Pierrot, C., Khalife, J., Grevelding, C.G., Chalmers, I.W., Yazdanbakhsh, M., et al. (2015). Drug-Induced Exposure of Schistosoma mansoni Antigens SmCD59a and SmKK7. PLOS Neglected Tropical Diseases 9, e0003593. 87 Danksagung Danksagung Bei Herrn Prof. Dr. H. Fehrenbach möchte ich mich herzlich für die Bereitschaft bedanken, die Schirmherrschaft für diese Arbeit zu übernehmen. Ich danke Herrn PD Dr. H. Haas für die Überlassung des interessanten Promotionsthemas. Ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. G. Schramm für die hervorragende Betreuung und Hilfsbereitschaft, die Korrektur dieser Arbeit, sowie die freundliche Atmosphäre, die sie verbreitet. Bei allen Mitarbeitern der ehemaligen FG Zelluläre Allergologie, die mich während meiner Doktorarbeit begleitet haben, möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit bedanken. Ganz besonders danke ich Frau S. Nyenhuis für die Hilfe und Unterstützung bei den Versuchen, für Ihre stets gute Laune und für die Fröhlichkeit, die sie im Labor verbreitet. Ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. H.H. Smits vom Leiden University Medical Center (LUMC) für die Möglichkeit ein 8-wöchiges Praktikum in ihrem Labor durchzuführen und dafür, dass sie ihr Know-how über humane B-Zellen mit mir geteilt hat. Ich danke auch Frau Dr. S. Häberlein für die Unterstützung und Frau A. Ozir-Fazalalikhan für die Hilfe im Labor, sowie allen Mitarbeitern der Leiden Immunoparasitology Group (LIPG) für die freundliche Aufnahme am LUMC und die schöne Zeit in Leiden. Ich danke der Fluoreszenz-Zytometrie Einheit am FZ Borstel. Herrn Dr. J. Behrends für die guten Ratschläge bei der FACS-Analyse und Herrn Dr. T. Scholzen für die Hilfe bei der Konfokalmikroskopie. Herrn PD Dr. H. Heine danke ich dafür, dass er das Amt meines Zweitbetreuers übernommen hat und für die guten Ratschläge. Bei Frau C. Schneider bedanke ich mich für die Organisation der freiwilligen Blutspender. Ich bedanke mich bei allen Blutspendern für ihre unkomplizierte Spontaneität und natürlich für ihr Blut. Ganz großer Dank gilt meiner Familie für die stete Unterstützung während des gesamten Studiums und der Anfertigung dieser Arbeit. 88